過表達(dá)IGF-1對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞氧化損傷的抑制作用*

趙　雷，　陳　昕，　馮業(yè)童，　劉朋飛

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院 1 麻醉科， 2檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518020； 3中山大學(xué)人類病毒學(xué)研究所，廣東 廣州 510080； 4吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021)

過表達(dá)IGF-1對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞氧化損傷的抑制作用*

趙雷1，陳昕2，馮業(yè)童3，劉朋飛4△

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院1麻醉科，2檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518020；3中山大學(xué)人類病毒學(xué)研究所，廣東 廣州 510080；4吉林大學(xué)藥學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021)

[摘要]目的： 分析過表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)氧化損傷的抑制作用，開發(fā)UC-MSCs新的應(yīng)用模式。方法: 通過酶消化法，從臍帶組織中分離UC-MSCs，并采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的表面特異標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體系，構(gòu)建過表達(dá)IGF-1的UC-MSCs(UC-MSCs-IGF-1)，并進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)UC-MSCs-IGF-1的IGF-1表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)分析UC-MSCs-IGF-1的表面標(biāo)志物及成骨成脂分化能力；用不同濃度的H2O2(0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L)處理細(xì)胞，分析UC-MSCs-IGF-1在增殖活力維持、抗氧化損傷和抗凋亡方面的優(yōu)勢(shì)。結(jié)果: UC-MSCs表面標(biāo)志物CD29、CD90和CD105的表達(dá)均呈陽性，而CD34的表達(dá)為陰性，符合正常間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體系構(gòu)建的UC-MSCs-IGF-1在IGF-1表達(dá)方面遠(yuǎn)高于正常UC-MSCs，同時(shí)干細(xì)胞表型與UC-MSCs一致，且具備正常的成脂成骨分化能力；在H2O2的氧化損傷作用下，與UC-MSCs相比，UC-MSCs-IGF-1具有較強(qiáng)的增殖活力和抗氧化、抗凋亡功能，同時(shí)細(xì)胞中的SOD活性略高于UC-MSCs。結(jié)論: 過表達(dá)IGF-1對(duì)UC-MSCs的氧化損傷及氧化引起的凋亡均具有一定的防護(hù)作用，與正常UC-MSCs相比，UC-MSCs-IGF-1可能在臨床應(yīng)用方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。

[關(guān)鍵詞]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 胰島素樣生長(zhǎng)因子1； 氧化損傷；細(xì)胞凋亡

近年來，以干細(xì)胞特別是成體干細(xì)胞為基礎(chǔ)的新型治療模式，已在多種疾病的治療上進(jìn)行了深入研究[1-4]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)具有多向分化潛能，還能夠遷移至受損組織處，通過分泌營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)損傷組織修復(fù)，在體內(nèi)發(fā)揮功能的過程中未見成瘤性[5-6]。同時(shí)，UC-MSCs的免疫學(xué)特性也在很大程度上擴(kuò)寬了它的應(yīng)用范圍，這種細(xì)胞不僅具有免疫調(diào)節(jié)能力，而且，基于自身的低免疫源性特點(diǎn)，該細(xì)胞在異體移植方面也具有著較好的應(yīng)用前景[3, 7-9]。

胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor-1，IGF-1)是一種結(jié)構(gòu)類似胰島素的多肽類細(xì)胞因子，主要在肝臟合成，是具有促進(jìn)細(xì)胞分化和增殖作用的單鏈蛋白，生物作用廣泛，參與機(jī)體多種器官功能調(diào)節(jié)，在人和脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育和機(jī)體正常成長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用[10]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)IGF-1具有一定的抗氧化損傷的作用，該功能在多種細(xì)胞氧化損傷的抑制方面均得到了一定驗(yàn)證，即在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入IGF-1，可以起到抵抗氧化損傷的作用[11-12]。但是，IGF-1對(duì)UC-MSCs的氧化損傷抑制作用尚不明確。此外，這種技術(shù)模式需要持續(xù)給予外源的IGF-1，對(duì)許多應(yīng)用方面具有一定的局限性。

針對(duì)這些問題，本課題組擬通過基因調(diào)控技術(shù)，使UC-MSCs能持續(xù)表達(dá)IGF-1，探索過表達(dá)IGF-1的UC-MSCs在抗氧化功能方面的優(yōu)越性，為UC-MSCs在臨床方面的合理化應(yīng)用提供一定的理論參考和技術(shù)支持。

材料和方法

1主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco；TRIzol RNA提取液購(gòu)自Invitrogen；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒均購(gòu)自TaKaRa；所有引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成；CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo；人源CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC和IGF-1-PE單克隆抗體均購(gòu)自BD；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色試劑盒、油紅O(oil red O)染色試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)分型測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

IX-70倒置相差顯微鏡及正置生物學(xué)顯微鏡均購(gòu)自日本 Olympus；PCR儀購(gòu)自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自Bio-Rad；FACSCalibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD；EXL-808酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自Bio-Tek。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1人源UC-MSCs的分離和鑒定取分娩后的臍帶組織，用PBS液清洗組織3遍，用眼科剪刀將組織標(biāo)本剪碎；加IV型膠原蛋白酶(2 g/L)與剪碎組織混勻，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱消化4 h，3 000 r/min室溫下離心10 min，棄上清液；再添加I型脫氧核糖核酸酶(1 g/L)重懸細(xì)胞沉淀，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱消化15 min，按上述離心條件再次離心，棄上清液；添加0.25%胰酶重懸組織細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱消化15 min，再次離心棄上清液；添加UC-MSCs細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%胎牛血清)重懸組織細(xì)胞，應(yīng)用40 μm細(xì)胞容器過濾組織塊，將濾液移入鋪有明膠的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

收集第3代的UC-MSCs進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)和評(píng)價(jià)。在表面特異標(biāo)記檢測(cè)方面，將1×106UC-MSCs懸浮于0.1 mL PBS中，人源CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC和CD105-FITC單克隆抗體均按1∶50的稀釋比例與UC-MSCs混合，室溫孵育30 min后，用PBS清洗2次，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記。另一方面，對(duì)細(xì)胞在成骨分化和成脂分化方面的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，分別采用成骨分化培養(yǎng)基(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，附加地塞米松10-4mmol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L和維生素C 50 mg/L)和成脂分化培養(yǎng)基(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，附加地塞米松10-3mmol/L、胰島素10 mg/L、IBMX 0.5 mmol/L和吲哚美辛0.2 mmol/L)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液1次，培養(yǎng)3～4周后，分別用AP染色和油紅O染色評(píng)價(jià)細(xì)胞的分化潛能，具體分化方法及檢測(cè)同參考文獻(xiàn)[4]。

2.2過表達(dá)IGF-1的UC-MSCs的構(gòu)建pMX-IGF-1過表達(dá)載體由吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)中心提供。本課題中采用293T細(xì)胞制備逆轉(zhuǎn)錄病毒，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法構(gòu)建過表達(dá)IGF-1的UC-MSCs(UC-MSCs-IGF-1)。具體實(shí)驗(yàn)方法同參考文獻(xiàn)[13-14]。

對(duì)本課題所構(gòu)建的UC-MSCs-IGF-1其細(xì)胞表面標(biāo)記、成骨分化能力和成脂分化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，方法同2.1。此外，分別通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞過表達(dá)IGF-1的程度。同時(shí)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UC-MSCs-IGF-1干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況。收集構(gòu)建的UC-MSCs-IGF-1，用TRIzol裂解，提取細(xì)胞RNA，并進(jìn)一步通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得細(xì)胞基因組cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UC-MSCs-IGF-1中相關(guān)基因的表達(dá)程度，檢測(cè)過程中以正常UC-MSCs和轉(zhuǎn)染空載體的UC-MSCs-vector為對(duì)照組，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，引物序列見表1。

2.3過表達(dá)IGF-1的UC-MSCs的抗氧化損傷能力分析分別將正常UC-MSCs、UC-MSCs-vector和UC-MSCs-IGF-1，以每孔2×103cells的數(shù)量接種到96孔板中，每組細(xì)胞進(jìn)一步用不同濃度的H2O2(0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L)進(jìn)行作用處理，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞在H2O2作用24 h、48 h后的細(xì)胞活力，評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)組的抗氧化能力，用僅含培養(yǎng)基的組作為背景組，測(cè)量絕對(duì)吸光度(實(shí)驗(yàn)組絕對(duì)吸光度值=實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，具體操作按CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行。另一方面，將細(xì)胞以每孔2×105cells的數(shù)量接種到6孔板中，處理方法及分組同上，直接用細(xì)胞計(jì)數(shù)器在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察的細(xì)胞活力結(jié)果，觀察UC-MSCs-IGF-1的增殖能力。

收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，采用MDA測(cè)定試劑盒和SOD分型測(cè)試盒檢測(cè)各組細(xì)胞MDA 的含量及SOD的活性，觀察過表達(dá)IGF-1對(duì)細(xì)胞凋亡和SOD活性的影響，進(jìn)一步明確各組細(xì)胞的抗氧化能力。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4過表達(dá)IGF-1的UC-MSCs在抗氧化損傷過程中的凋亡相關(guān)基因分析在H2O2作用48 h后，收集各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的RNA，反轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡基因caspase-3、bax和抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)程度，從而明確各組細(xì)胞的凋亡情況。在凋亡基因檢測(cè)中，以β-actin作為內(nèi)參照，將正常UC-MSCs作為空白對(duì)照組，并將基因在空白對(duì)照組的表達(dá)水平作為“1”，通過等比例比較各實(shí)驗(yàn)組的基因表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列見表1。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

（2）改善鉆井液潤(rùn)滑性。施工中通過加入1%油基潤(rùn)滑劑來優(yōu)化鉆井液潤(rùn)滑性，作用機(jī)理是在親水性的井壁和鉆具表面形成一層疏水性油膜，在增強(qiáng)吸附表面潤(rùn)滑性的同時(shí)，也有助于抑制泥頁巖吸水膨脹分散，降低摩阻。若是摩阻較大的定向井，可向鉆井液中加入10% 原油，并使其充分乳化，以改善鉆井液的潤(rùn)滑性能和摩阻，阻止壓差卡鉆現(xiàn)象的發(fā)生［1］。

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，并用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組之間的兩兩比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　引物序列

F: forward; R: reverse.

結(jié)果

1人源UC-MSCs的分離和鑒定結(jié)果

分離的人源UC-MSCs在培養(yǎng)1 d后，呈長(zhǎng)梭形貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，可見細(xì)胞生長(zhǎng)密度逐漸增大，由此說明細(xì)胞具有一定的增殖能力。此外，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)可見UC-MSCs表達(dá)CD29、CD90和CD105(表達(dá)效率分別為98.1%、97.2%和90.2%)，基本不表達(dá)CD34(表達(dá)效率為0.52%)，這種表面標(biāo)記特征與正常的間充質(zhì)干細(xì)胞相符合，滿足本課題后續(xù)研究的需要。同時(shí)，細(xì)胞具備成骨分化和成脂分化的能力，可見分化后的細(xì)胞AP染色和油紅O染色均為陽性，見圖1。

2過表達(dá)IGF-1的UC-MSCs的構(gòu)建及鑒定

將基因在UC-MSCs-IGF-1組的表達(dá)水平定為“1”，通過等比例比較各實(shí)驗(yàn)組的基因表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，IGF-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后的UC-MSCs，在IGF-1表達(dá)方面遠(yuǎn)高于正常UC-MSCs以及UC-MSCs-vector，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果相一致，與陰性對(duì)照組相比，UC-MSCs、UC-MSCs-vector和UC-MSCs-IGF-1的IGF-1表達(dá)效率分別為0.25%、0.32%和97.5%，UC-MSCs-IGF-1中IGF的表達(dá)效率遠(yuǎn)高于正常UC-MSCs以及UC-MSCs-vector。上述結(jié)果證明本課題中所采用的逆轉(zhuǎn)錄病毒過表達(dá)體系效果明顯，可以成功構(gòu)建過表達(dá)IGF-1的UC-MSCs，見圖2。

Figure 1.The morphology and identification of human UC-MSCs and UC-MSCs-IGF-1.

圖1人源UC-MSCs及UC-MSCs-IGF-1的形態(tài)及鑒定結(jié)果

3過表達(dá)IGF-1的UC-MSCs抗氧化損傷的能力評(píng)價(jià)結(jié)果

細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果的大體趨勢(shì)與CCK-8的結(jié)果基本一致。在用10 μmol/L H2O2處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的增殖能力并未見顯著變化，隨著H2O2濃度的提高，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力逐漸下降；在用50 μmol/L H2O2處理時(shí)，UC-MSCs和UC-MSCs-vector均呈現(xiàn)一定的增殖抑制現(xiàn)象，而UC-MSCs-IGF-1仍然可以呈現(xiàn)一定程度的增殖趨勢(shì)；在用100 μmol/L H2O2處理時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組均呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，但是，各實(shí)驗(yàn)組的抑制程度具有顯著區(qū)別，作用48 h后，UC-MSCs和UC-MSCs-vector的抑制效率[抑制效率=(0 h相對(duì)吸光度-48 h相對(duì)吸光度)/0 h相對(duì)吸光度×100%]分別為51.9%和51.7%，而UC-MSCs-IGF-1組的抑制效率為16.4%，明顯低于UC-MSCs和UC-MSCs-vector，由此表明UC-MSCs-IGF-1具有一定的抗氧化損傷的作用，見圖3。

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組SOD的檢測(cè)結(jié)果表明，UC-MSCs-IGF-1中SOD的活性水平略高于UC-MSCs和UC-MSCs-vector(P<0.05)，所以UC-MSCs-IGF-1可以在一定程度上抵抗H2O2的氧化損傷，維持細(xì)胞活力，見圖4。

Figure 2.Evaluation of UC-MSCs-IGF-1 establishment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsUC-MSCs；#P<0.05vsUC-MSCs-vector.

圖2UC-MSCs-IGF-1的構(gòu)建評(píng)價(jià)

Figure 3.The proliferation of UC-MSC, UC-MSCs-vector and UC-MSCs-IGF-1 treated with H2O2at different concentrations.A: CCK-8 assay; B: cell counting. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 h；#P<0.05vs24 h.

圖3在不同濃度H2O2的作用下UC-MSCs、UC-MSCs-vector和UC-MSCs-IGF-1的增殖變化

Figure 4.The SOD activity in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsUC-MSCs;#P<0.05vsUC-MSCs-vector.

圖4各實(shí)驗(yàn)組SOD活性的檢測(cè)結(jié)果

4過表達(dá)IGF-1的UC-MSCs在抗氧化損傷過程中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的結(jié)果表明，在未經(jīng)H2O2處理或10 μmol/L H2O2處理細(xì)胞時(shí)，UC-MSCs、UC-MSCs-vector以及UC-MSCs-IGF-1的凋亡基因caspase-3和bas均保持較低水平，而抗凋亡基因bcl-2處于較高的水平，各實(shí)驗(yàn)組未見明顯差異；隨著H2O2濃度的增大，由H2O2引起細(xì)胞凋亡逐漸顯著，可見各實(shí)驗(yàn)組均有caspase-3和bax上調(diào)，以及bcl-2下調(diào)的趨勢(shì)，但是，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡程度各不一致，與UC-MSCs和UC-MSCs-vector相比，UC-MSCs-IGF-1中的caspase-3和bax的上調(diào)程度和bcl-2的下調(diào)程度均較弱，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，MDA的檢測(cè)結(jié)果表明，UC-MSCs-IGF-1中MDA的含量略低于UC-MSCs和UC-MSCs-vector(P<0.05)，由此表明UC-MSCs-IGF-1可以在一定程度上抵抗氧化損傷引起的細(xì)胞凋亡，見圖5。

Figure 5.Detection of apoptosis-associated gene expression and MDA in each group treated with H2O2at different concentrations. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsUC-MSCs;#P<0.05vsUC-MSCs-vector.

圖5在不同濃度H2O2的作用下各實(shí)驗(yàn)組凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)及MDA的檢測(cè)結(jié)果

討論

本研究利用逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建了UC-MSCs-IGF-1，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體系屬于基因組插入模式，所以，所構(gòu)建的UC-MSCs-IGF-1是穩(wěn)定表達(dá)IGF-1的UC-MSCs。結(jié)果表明，與正常UC-MSCs相比，UC-MSCs-IGF-1在生長(zhǎng)形態(tài)、表面標(biāo)記、細(xì)胞增殖及成骨成脂分化等方面，未見顯著區(qū)別。由此可見，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體系實(shí)現(xiàn)的IGF-1過表達(dá)，不會(huì)影響干細(xì)胞的基本生物特性。

IGF-1對(duì)細(xì)胞氧化損傷的抑制作用已逐漸為研究人員所證實(shí)，但是，如何將這一科學(xué)理論應(yīng)用于臨床實(shí)踐尚不明確。目前研究表明，通過體外調(diào)控，可以優(yōu)化UC-MSCs的某些生物學(xué)特性，同時(shí)，UC-MSCs通過靜脈途徑進(jìn)入體內(nèi)，對(duì)多種疾病均有較好的治療效果[3, 7, 15-16]。但是，正常情況下，人體血液內(nèi)的IGF-1濃度較低，必須在給予UC-MSCs的同時(shí)補(bǔ)充IGF-1才能起到抗氧化損傷的效果，這種方法在很大程度上增加了治療成本，同時(shí)還需要考慮外源IGF-1在體內(nèi)的作用劑量和作用時(shí)間。針對(duì)這一問題，本課題采用基因調(diào)控手段構(gòu)建UC-MSCs-IGF-1，證明UC-MSCs-IGF-1在抗氧化損傷、維持細(xì)胞增殖活力、抗凋亡等方面，均具有一定的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，課題組對(duì)所建立的UC-MSCs-IGF-1進(jìn)行了一定時(shí)期的體外培養(yǎng)，在構(gòu)建后傳代5次，IGF-1仍然具有較高的表達(dá)水平，與初始構(gòu)建的UC-MSCs-IGF-1并無明顯差別。這些特點(diǎn)均在一定程度上為UC-MSCs的臨床合理化應(yīng)用提供了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。但是，本課題對(duì)于基因調(diào)控方面的機(jī)理機(jī)制分析較少，尚不明確過表達(dá)IGF-1對(duì)細(xì)胞內(nèi)其它信號(hào)通路及UC-MSCs生物活性的影響；同時(shí)，在UC-MSCs-IGF-1抗氧化損傷的能力方面，本課題所建立的體系仍有待進(jìn)一步優(yōu)化；特別是本課題仍處于體外研究階段，UC-MSCs-IGF-1相關(guān)的體內(nèi)功能仍需要進(jìn)一步的探索和研究。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Inhibitory effect of IGF-1 overexpression on oxidative damage in umbilical cord mesenchymal stem cells

ZHAO Lei1, CHEN Xin2, FENG Ye-tong3, LIU Peng-fei4

(1DepartmentofAnesthesiology，2DepartmentofLaboratoryMedicine,SecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,ShenzhenPeople’sHospital,Shenzhen518020,China;3InstituteofHumanVirology,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;4DepartmentofRegenerativeMedicine,SchoolofPharmaceuticalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China.E-mail:rockman123456@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To analyze the inhibitory effect of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) overexpression in umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) on oxidative damage and to develop new application model for UC-MSCs. METHODS: UC-MSCs were isolated from human umbilical cord with enzymatic digestion, and further characte-rized with flow cytometry. IGF-1-overexpressing UC-MSCs (UC-MSCs-IGF-1) were established by retrovirus infection. IGF-1 expression of UC-MSCs-IGF-1 was evaluated by real-time quantitative PCR and flow cytometry, and its surface markers, as well as osteogenic and adipogenic differentiation ability, were further analyzed. The proliferation, anti-oxidative damage and anti-apoptosis abilities of UC-MSCs-IGF-1 were evaluated when treated with H2O2 at different concentrations (0 μmol/L, 10 μmol/L, 50 μmol/L and 100 μmol/L). RESULTS: UC-MSCs showed positive expression of CD29, CD90 and CD105, but negative expression of CD34, which coincided with the normal phenotype of mesenchymal stem cells. UC-MSCs-IGF-1 established with retrovirus infection showed much higher expression of IGF-1 compared with normal UC-MSCs, and expressed the same surface markers as UC-MSCs.The osteogenic and adipogenic differentiation abilities were also observed. With the oxidative damage by H2O2treatment, UC-MSCs-IGF-1 showed more strong proliferation, anti-oxidative damage and anti-apoptosis abilities as compared with normal UC-MSCs. In addition, the activity of SOD in UC-MSCs-IGF-1 was a little higher than that in control group. CONCLUSION: IGF-1 overexpression in UC-MSCs inhibits oxidative damage and cell apoptosis. UC-MSCs-IGF-1 may have more advantagies in clinical application.

[KEY WORDS]Umbilical cord mesenchymal stem cells; Insulin-like growth factor-1; Oxidative damage; Apoptosis

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0160- 07

[收稿日期]2015- 06- 02[修回日期] 2015- 11- 05

*[基金項(xiàng)目]深圳市知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃 (No. JCYJ20140416122812052)；吉林大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(No. 2015009)；深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目 (No. 201401010)

通訊作者△Tel: 0431-85619715； E-mail： rockman123456@sina.com

[中圖分類號(hào)]R392.32

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.028