小鼠iPSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞及治療糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究*

任麗偉，　魏　培，　楊曉菲，　楊　璐，　鄧春艷，　齊　暉，　李富榮△

(1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院干細(xì)胞與細(xì)胞治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518020； 2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

小鼠iPSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞及治療糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究*

任麗偉1, 2，魏培1，楊曉菲1, 2，楊璐1, 2，鄧春艷1，齊暉1，李富榮1△

(1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院干細(xì)胞與細(xì)胞治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518020；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 利用3步法誘導(dǎo)方案，使小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)分化為胰島素分泌細(xì)胞(insulin-producing cells，IPCs)，觀察誘導(dǎo)效率和成熟度，并觀察其對糖尿病小鼠治療效果。方法: 本實(shí)驗(yàn)室通過piggyBac轉(zhuǎn)座子將C57/C雄性小鼠來源胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)構(gòu)建為小鼠iPSCs，利用3步法誘導(dǎo)方案分化為IPCs，觀察細(xì)胞分化過程中的形態(tài)變化；RT-PCR和免疫熒光檢測其胰島β細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)分析分化效率；葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)檢測胰島素和C肽分泌水平。將IPCs移植入C57/C雄性糖尿病小鼠模型左腎包膜下，監(jiān)測血糖和血清中胰島素含量28 d，觀察逆轉(zhuǎn)高糖血癥的效果。結(jié)果: 建立的3步誘導(dǎo)方案可以將小鼠iPSCs誘導(dǎo)分化為IPCs，其表達(dá)胰島β細(xì)胞的標(biāo)志性基因(Pdx1、Ngn3、Pax6和Ins2)和蛋白(Pdx1、Nkx6.1和胰島素)，在葡萄糖刺激下可分泌胰島素和C肽。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明誘導(dǎo)分化的效率達(dá)28%。移植后3 d糖尿病小鼠血糖即降低至接近正常水平，血清胰島素含量明顯升高，對葡萄糖的調(diào)控能力明顯增強(qiáng)。病理學(xué)觀察IPCs細(xì)胞移植28 d后仍存活。結(jié)論: 建立的3步誘導(dǎo)法可將iPSCs高效定向誘導(dǎo)分化為IPCs，明顯縮短了誘導(dǎo)分化的時(shí)間，移植至近交系同性別小鼠體內(nèi)可逆轉(zhuǎn)糖尿病的高糖血癥。

[關(guān)鍵詞]誘導(dǎo)多能干細(xì)胞； 胰島素分泌細(xì)胞； 糖尿病

Ⅰ型糖尿病是一種以胰島β細(xì)胞受損為特征的自身免疫性疾病。同種異體胰島移植被認(rèn)為是最有可能治愈糖尿病的方法之一[1-2]，但移植后的免疫排斥和炎癥反應(yīng)都可能引起移植的胰島細(xì)胞功能喪失[3-4]。新近研究發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)具有類似胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)增殖和分化為特定細(xì)胞的能力[5-7]。并有研究驗(yàn)證iPSCs可以誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞(insulin-producing cells，IPCs)[8-9]。用iPSCs作為一種胰島來源細(xì)胞，不僅在倫理學(xué)上不受限制，并且個(gè)體特異來源的iPSCs不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)[10-12]，可成為移植治療糖尿病的理想種子細(xì)胞。近年來報(bào)道的ESCs和iPSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的方案中，胰島素陽性細(xì)胞展示了一些胰島細(xì)胞的特征，這些細(xì)胞大多數(shù)釋放胰島素和C肽，表達(dá)胰島轉(zhuǎn)錄因子和含有分泌顆粒。然而，這些分化的胰島素陽性細(xì)胞效率低下，成熟度差[8, 13-14]。在此，我們建立了一種3步誘導(dǎo)小鼠iPSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，可明顯縮短誘導(dǎo)時(shí)間并增加成熟度。經(jīng)腎包膜下移植糖尿病小鼠模型，可逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠的高糖血癥。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物和細(xì)胞Oct4-GFP轉(zhuǎn)基因雄性C57/C小鼠分離胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，經(jīng)攜帶Oct4、c-Myc、Klf4和Sox2的 piggyBac 轉(zhuǎn)座子對MEFs重編程的iPSCs為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和鑒定，相關(guān)結(jié)果未發(fā)表。C57/C小鼠(8周齡，雌性)，體重18～22 g，購自廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于深圳北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(SPF級)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，對動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2主要試劑和儀器6孔培養(yǎng)板、T25培養(yǎng)瓶、離心管等培養(yǎng)耗材均購自BD；胎牛血清、DMEM/F12、DMEM/H、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺和β-巰基乙醇均購自Gibco；總RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen；維甲酸、尼克酰胺和鏈脲菌素購自Sigma；bFGF、HGF和activin A購自Peprotech；胰島素ELISA 試劑盒和C肽ELISA 試劑盒購自Mercodia；豚鼠抗鼠胰島素抗體、兔抗鼠Pdx1抗體和兔抗鼠Nkx6.1抗體均購自Abcam；兔抗小鼠C肽抗體購自Santa Cruz；FITC標(biāo)記羊抗兔抗體購自Rockland；小鼠胰島素ELISA試劑盒購自Mercodia。Axiovert 200熒光顯微鏡和LSM 510激光共聚焦顯微鏡均為Zeiss產(chǎn)品。血糖儀和血糖試紙為Lifescan產(chǎn)品。

2iPSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞

收集培養(yǎng)3 d左右的小鼠iPSCs，將細(xì)胞接種到懸浮培養(yǎng)皿內(nèi)。第1步：誘導(dǎo)為擬胚體4 d，更換培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基含10%胎牛血清、雙抗工作液、 L-谷氨酰胺、非必須氨基酸和β-巰基乙醇)。48 h后，收集擬胚體，種植在1% Matrigel預(yù)先包被的培養(yǎng)皿內(nèi)，2 h左右更換培養(yǎng)基成分(DMEM/F12培養(yǎng)基，含20%胎牛血清、1%雙抗工作液、100 μg/L activin A和非必須氨基酸)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。第2步：誘導(dǎo)為胰腺前體細(xì)胞4 d，更換培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、雙抗工作液、10-6mol/L 維甲酸和非必須氨基酸)培養(yǎng)24 h；再更換培養(yǎng)基成分(DMEM/F12，含10% 胎牛血清、雙抗工作液、10 μg/L bFGF和非必須氨基酸)培養(yǎng)3 d。第3步：誘導(dǎo)為胰島素分泌細(xì)胞3 d，更換培養(yǎng)基成分(DMEM/F12，含N2 supplement、B27 supplement、50 μg/L HGF、1 mg/L laminin、10 μg/L bFGF、10 mmol/L尼克酰胺、非必需氨基酸和雙抗工作液)培養(yǎng)3 d。對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，并進(jìn)行相關(guān)鑒定。

3分化的IPCs鑒定

3.1RT-PCR檢測胰島β細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)取分化的IPCs，棄去培養(yǎng)基，用無菌DEPC水配制預(yù)冷的PBS溶液洗滌2次，用TRIzol試劑處理細(xì)胞，提取總RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的DNA加樣到配制的2%的瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠拍照。所用引物序列見表1。

3.2免疫熒光檢測胰島素、Pdx1和Nkx6.1蛋白的表達(dá)取分化的IPCs玻片加入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，固定10 min；棄去多聚甲醛，用PBS溶液洗滌3次，每次5 min;用透膜封閉液(PBS配制含0.2%的Triton Χ-100和2%BSA)室溫孵育30 min；分別加入相應(yīng)比例稀釋 I 抗(抗胰島素抗體、抗Pdx1抗體和抗Nkx6.1抗體)，避光，4 ℃孵育過夜；棄去染色液，用PBS溶液洗滌，加入相應(yīng)比例稀釋的熒光Ⅱ抗，室溫孵育60 min；加入1∶200稀釋的DAPI溶液，室溫孵育5 min；抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

表1　引物序列

3.3分化效率檢測收集分化的IPCs，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×109/L，取100 μL細(xì)胞懸液，加入兔抗小鼠C肽抗體，4 ℃孵育30 min，PBS洗滌2次，加入FITC標(biāo)記羊抗兔抗體，室溫孵育30 min，1 000 r/min離心5 min，用1%多聚甲醛重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞C肽表達(dá)陽性率。同時(shí)設(shè)置同型對照管。

3.4葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)收集分化后的IPCs，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×109/L， 將1 mL細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板，以含5.5 mmol/L葡萄糖(低)或25 mmol/L葡萄糖(高)的DMEM/F12培養(yǎng)液1 mL孵育1 h，收集培養(yǎng)液。成年小鼠胰島細(xì)胞作為對照組。按照小鼠ELISA試劑盒說明檢測胰島素和C肽釋放水平。

4IPCs移植治療糖尿病小鼠模型的療效觀察

4.1小鼠糖尿病模型制備及細(xì)胞移植C57/C雄鼠禁食12 h，連續(xù)3 d腹腔注射2% 鏈脲菌素溶液(150 mg/kg)，尾靜脈采血用血糖儀監(jiān)測血糖，連續(xù)3 d測得血糖濃度大于300 mg/dL為糖尿病小鼠造模成功。糖尿病小鼠隨機(jī)分為2組：IPCs移植組每只小鼠左腎包膜下注射1×107個(gè)IPCs；糖尿病組每只小鼠左腎包膜下注射0.1 mL PBS。另取正常BALB/c小鼠為正常組。

4.2移植后功能學(xué)檢測移植后每3 d對各組禁食6 h的C57/C小鼠進(jìn)行斷尾取血測血糖；每次隨機(jī)檢測5只小鼠，如果連續(xù)2次<250 mg/dL，則定義為血糖正常。在移植后第7、14、21、28天，各組小鼠眶周采血0.5 mL，離心分離血清-20 ℃保存，采用小鼠ELISA法檢測血清中胰島素水平。在移植后第7天和21天，小鼠禁食6～8 h后，腹腔注射10%葡萄糖溶液(2 mg/kg)進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)。第28天時(shí)摘取小鼠左腎，石蠟包埋，組織切片，HE染色，以及免疫組織熒光，觀察移植細(xì)胞存活以及胰島素和胰高血糖素表達(dá)情況。評價(jià)指標(biāo)至第30天。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，2組以上的組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1小鼠iPSCs誘導(dǎo)分化為IPCs形態(tài)學(xué)變化

利用建立的3步誘導(dǎo)法，在11 d內(nèi)將iPSCs誘導(dǎo)分化為IPCs。在誘導(dǎo)小鼠iPSCs分化的過程中，細(xì)胞從最初在飼養(yǎng)層細(xì)胞上貼壁生長，形成擬胚體后轉(zhuǎn)為懸浮生長，再將其種植在用1% Matrigel預(yù)先包被的培養(yǎng)皿內(nèi)，細(xì)胞開始貼壁，并呈現(xiàn)分散趨勢進(jìn)行生長。經(jīng)過進(jìn)一步誘導(dǎo)分化，細(xì)胞集落從4周開始緩慢鋪展開來，出現(xiàn)有上皮樣的形態(tài)。在誘導(dǎo)分化的最后階段，細(xì)胞呈現(xiàn)類似細(xì)胞團(tuán)樣的結(jié)構(gòu)，見圖1。

2iPSCs來源的IPCs具有胰島β細(xì)胞特征

在iPSCs誘導(dǎo)分化為IPCs過程中，在第2步和第3步誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行胰島β細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因與蛋白的檢測。PCR的結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)1步結(jié)束后細(xì)胞表達(dá)內(nèi)胚層細(xì)胞的標(biāo)志基因Sox17，誘導(dǎo)第2、3步細(xì)胞表達(dá)一些胰島β細(xì)胞標(biāo)志性基因，包括有胰十二指腸同源盒 1 (pancreatic and duodenal homeobox factor 1，Pdx1)、神經(jīng)元素 3(neurogenin 3，Ngn3)、配對盒基因 6(paired box gene，Pax6)和前胰島素原 2 (preproinsulin 2，Ins2)，而Sox17的表達(dá)，其中Ins2 在第3階段表達(dá)比第2階段的細(xì)胞明顯增強(qiáng)。免疫熒光檢測誘導(dǎo)分化后的IPCs，也表達(dá)β細(xì)胞標(biāo)志性相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)Pdx1(紅色)、Nkx6、1(綠色)和insulin(紅色)呈陽性，表明分化后的細(xì)胞具有表達(dá)胰島素的能力。利用流式細(xì)胞術(shù)對分化的IPCs檢測C肽，發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞為28%。葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)觀察IPCs細(xì)胞的成熟度，發(fā)現(xiàn)在高低糖刺激下均會(huì)分泌胰島素和C肽，在高糖(25 mmol/L)刺激下胰島素的分泌量約為低糖(5.5 mmol/L)的4～5倍，C肽的分泌量約為低糖(5.5 mmol/L)的4～5倍，但只有正常小鼠胰島分泌胰島素和C肽能力的1/8和1/5。表明建立的3步誘導(dǎo)法分化效率明顯提高，但成熟度尚未達(dá)到正常胰島功能。

Figure 1.The strategy and morphological changes during the inducing processes of iPSCs to IPCs. A: the diagrammatic drawing of 3-step method; B: the morphological changes of the inducing processes. a1, a2: iPSCs colonies attached to the plate; b1, b2: embryoid body was formed after suspension culture; c1, c2: the cells of embryoid body were diffused and the morphology was different after cultured in Matrigel-coated plate; d1: the induced cells appeared to be epithelioid; d2: the final morphology of the cells by the 3-step method induction.

圖13步法誘導(dǎo)iPSCs為IPCs步驟示意圖及此過程中細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)變化

Figure 2.Identification of insulin-producing cells (IPCs) derived from iPSCs . A: the mRNA expression of Pdx1, Ngn3, Ins2 and Pax6 in different stages detected by RT-PCR; B： flow cytometry detection of C-peptide in the IPCs with the percentages of 28%; C: immunofluorescence staining of iPSC-derived IPCs with antibodies against Pdx1, Nkx6.1 and insulin; D，E: comparison of insulin and C-peptide levels with different concentrations of glucose stimulation detected by ELISA. Mean±SD.n=10.$P<0.05vs0 d group;#P<0.05vs4 d group;&P<0.05vs8 d group;△P<0.05vs11 d group;*P<0.05vs5.5 mmol/L glucose group.

圖2經(jīng)誘導(dǎo)分化的IPCs基因和蛋白表達(dá)特點(diǎn)、誘導(dǎo)效率及不同濃度葡萄糖刺激下胰島素和C肽的分泌水平

3IPCs移植治療糖尿病實(shí)驗(yàn)研究

為了驗(yàn)證IPCs治療糖尿病模型效果，將IPCs移植到C57/C雄性糖尿病小鼠模型左腎包膜下，發(fā)現(xiàn)在移植后第3天血糖開始明顯下降，降至160～200 mg/dL水平，并持續(xù)維持在此水平，但沒有降到正常小鼠的血糖水平，在28 d摘除小鼠左腎后，血糖快速升至糖尿病小鼠的血糖水平。在移植后第7、14、21和28天眼眶采血，檢測血清胰島素水平，發(fā)現(xiàn)較糖尿病小鼠明顯升高(P<0.05)，與血糖水平減低相對應(yīng)。在移植后第28天進(jìn)行葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，顯示IPCs組小鼠血糖調(diào)控能力較糖尿病組明顯改善。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)移植到小鼠左腎包膜下的IPCs仍存活，沒有發(fā)生明顯排斥反應(yīng),仍表達(dá)胰島素，見圖3。

Figure 3.Therapeutic effect of IPCs transplantation on the diabetic mice. A: the changes of blood glucose after IPCs transplantation; B: insulin levels 3, 7, 14, 21 and 28 d after IPCs transplantation detected by ELISA; C: glucose tolerance test of diabetic mice 28 d after IPCs transplantation; D: HE staining showing that IPCs existed under the capsual of removed kidney (×40); E: insulin was still excreted in the transplanted site after 28 d of transplantation (×200). Mean±SD.n=10.*P<0.05vsdiabetes group;#P<0.05vsnormal group.

圖3IPCs移植后對糖尿病模型小鼠降糖效果的評價(jià)

討論

研究發(fā)現(xiàn)小鼠MEFs來源的iPSCs能夠在特定誘導(dǎo)條件下分化為胰島素分泌細(xì)胞，并通過肝門靜脈移植入糖尿病小鼠體內(nèi)，能夠控制小鼠的血糖水平和糖化血紅蛋白的水平[9]。目前，建立的4步誘導(dǎo)法將IPSCs誘導(dǎo)分化為IPCs時(shí)間約為21 d左右[8, 15-16]，但仍然存在誘導(dǎo)時(shí)間過長，分化效率只有25%，阻礙IPCs在臨床研究上的應(yīng)用。本研究在ESCs和iPSCs誘導(dǎo)分化方案的基礎(chǔ)上，建立了一個(gè)高效快速地將iPSCs分化為IPCs的誘導(dǎo)方案，即3步法誘導(dǎo)方案。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，誘導(dǎo)分化效率為28%，誘導(dǎo)分化時(shí)間為11 d。第1步分化為擬胚體，第2步分化為胰腺祖細(xì)胞，第3步分化為胰島素分泌細(xì)胞。由于activin A和維甲酸在誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞過程中具有關(guān)鍵作用[16]，在第2步縮短了activin A和維甲酸作用的時(shí)間間隔，第3 步將laminin、 bFGF 和尼克酰胺同時(shí)添加到培養(yǎng)基，使各種因子可以連續(xù)作用于分化中的細(xì)胞，減少了iPSCs誘導(dǎo)分化為IPCs過程中更換培養(yǎng)基的次數(shù)和時(shí)間, 最終將iPSCs分化為的IPCs時(shí)間縮短到11 d，比原方案節(jié)省近一半的時(shí)間。

通過3步誘導(dǎo)方案，結(jié)果表明每步誘導(dǎo)結(jié)束的細(xì)胞都表達(dá)特定的標(biāo)記基因，并且在誘導(dǎo)分化最后階段的IPCs與體內(nèi)成熟的β細(xì)胞相似。首先，用本方案誘導(dǎo)的IPCs表達(dá)β細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和功能標(biāo)志蛋白，包括Pdx1、Ngn3、Pax4和Ins2。第二，Pdx1、Nkx6.1和胰島素的共表達(dá)被認(rèn)為是成熟β細(xì)胞的特殊功能標(biāo)志。第三，誘導(dǎo)最后階段的IPCs可分泌胰島素和C肽，并且二者的分泌受葡萄糖的刺激。胰島素和C肽的含量分別為正常胰島含量的1/8和1/6。這可能是因?yàn)檎T導(dǎo)分化最后階段的細(xì)胞中只包含28%的IPCs，所以分化的IPCs與正常胰島β細(xì)胞是相似可比較的。

之后，我們將誘導(dǎo)分化的IPCs移植到同系同性別的糖尿病小鼠模型體內(nèi)，以進(jìn)一步評價(jià)其在體內(nèi)的功能。IPCs移植后，糖尿病小鼠模型的血糖快速下降并穩(wěn)定在160～200 mg/dL，ELISA檢測血清中胰島素水平明顯比糖尿病小鼠模型高，說明IPCs在體內(nèi)具有逆轉(zhuǎn)高血糖癥的作用。糖耐量實(shí)驗(yàn)也表明，IPCs移植到體內(nèi)其分泌胰島素的能力受葡萄糖調(diào)控，表明IPCs移植到體內(nèi)后仍具有分化為成熟胰島β細(xì)胞的特點(diǎn)[17]。

綜上所述，我們建立了一個(gè)高效快速地將iPSCs誘導(dǎo)分化為成熟IPCs的方案。獲得的IPCs展示了成熟β細(xì)胞的大多數(shù)特點(diǎn)，包括胰島素和C-肽的分泌受血糖的調(diào)控，為利用患者自體細(xì)胞構(gòu)建iPSCs治療糖尿病奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Aathira R, Jain V. Advances in management of type 1 diabetes mellitus[J].World J Diabetes, 2014, 5(5):689-696.

[2]Bruni A, Gala-Lopez B, Pepper AR, et al. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges[J]. Diabetes Metab Syndr Obes, 2014, 7:211-223.

[3]Abreu JR, Roep BO. Immune monitoring of islet and pancreas transplant recipients[J]. Curr Diabetes Rep, 2013, 13(5):704-712.

[4]Kanak MA, Takita M, Kunnathodi F, et al. Inflammatory response in islet transplantation[J]. Int J Endocrinol, 2014, 2014:451035.

[5]Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell, 2006, 126(4):663-676.

[6]Yamanaka S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future[J]. Cell Stem Cell, 2012, 10(6):678-684.

[7]Chen P, Chen JZ, Shao CY, et al. Treatment with retinoic acid and lens epithelial cell-conditioned medium directed the differentiation of pluripotent stem cells towards corneal endothelial cell-like cells[J]. Exp Ther Med, 2015, 9(2):351-360.

[8]Zhang D, Jiang W, Liu M, et al. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells[J]. Cell Res, 2009, 19(4):429-438.

[9]Alipioa Z,Liao W,Roemer EJ,et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(30):13426-13431.

[10]Kaneko S, Yamanaka S. To be immunogenic, or not to be: that’s the iPSC question[J]. Cell Stem Cell, 2013, 12(4):385-386.

[11]Guha P, Morgan JW, Mostoslavsky G, et al. Lack of immune response to differentiated cells derived from syngeneic induced pluripotent stem cells[J]. Cell Stem Cell, 2013, 12(4):407-412.

[12]Morizane A, Doi D, Kikuchi T, et al. Direct comparison of autologous and allogeneic transplantation of iPSC-derived neural cells in the brain of a non-human primate[J]. Stem Cell Reports, 2013, 1(4):283-292.

[13]Liu H, Yang H, Zhu D, et al. Systematically labeling developmental stage-specific genes for the study of pancreatic beta-cell differentiation from human embryonic stem cells[J]. Cell Res, 2014, 24(10):1181-1200.

[14]Khorsandi L, Nejad-Dehbashi F, Ahangarpour A, et al. Three-dimensional differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into insulin-producing cells[J]. Tissue Cell, 2015, 47(1):66-72.

[15]Jiang W, Shi Y, Zhao D, et al.Invitroderivation of functional insulin-producing cells from human embryonic stem cells[J]. Cell Res, 2007, 17(4):333-344.

[16]Shi Y, Hou L, Tang F, et al. Inducing embryonic stem cells to differentiate into pancreatic beta cells by a novel three-step approach with activin A and all-transretinoic acid[J]. Stem Cells, 2005, 23(5):656-662.

[17]Pezzolla D, Lopez-Beas J, Lachaud CC, et al. Resveratrol ameliorates the maturation process of beta-cell-like cells obtained from an optimized differentiation protocol of human embryonic stem cells[J]. PLoS One, 2015, 10(3):e0119904.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Differentiation of mouse iPSCs into insulin-producing cells and experimental study on treating diabetes

REN Li-wei1, 2, WEI Pei1, YANG Xiao-fei1, 2, YANG Lu1, 2, DENG Chun-yan1, QI Hui1, LI Fu-rong1

(1TheKeyLaboratoryofStemCellandCellularTherapy,TheSecondClinicalMedicalCollege,ShenzhenPeople’sHospital,JinanUniversity,Shenzhen518020,China;2SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:frli62@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To induce mouse induced pluripotent stem cells (iPSCs) to differentiate into insulin-producing cells (IPCs) by a new 3-step method, and to detect the efficiency and maturity for the treatment of diabetic mice. METHODS: We constructed iPSCs from mouse embryonic fibroblasts of male C57/C mouse by piggyBac transposon, then induced the iPSCs into IPCs by a 3-step method. The cell morphological change was traced by microscopy during the process of differentiation. The expression of mRNA and protein associated with islet β cell development was determined by real-time PCR and immunofluorescence staining. Flow cytometry was used to analysis the efficiency of differentiation. Insulin and C-peptide secretions of IPCs in response to glucose at high (25 mmol/L) or low (5.5 mmol/L) level were measured by ELISA. The IPCs were transplanted into the capsul of left kidney in the male C57/C diabetic mouse model. Blood glucose was continuously monitored for 28 day, serum insulin was tested by ELISA in different stages. The glucose tolerance test was performed on the 28th day, and the left kidney was excised. RESULTS: IPCs were obtained from mouse iPSCs by the 3-step method. The cells expressed the marker genes (Pdx1, Ngn3, Pax6 and Ins2) and proteins (Pdx1, Nkx6.1 and insulin) of β cells. The glucose stimulation induced the secretion of insulin and C-peptide. The efficiency of differentiation was 28% detected by flow cytometry. After transplantation of IPCs to the diabetic mice, the blood glucose was decreased to normal level on the 3rd day,and serum insulin level and the ability of regulating glucose were improved. IPCs were still alive after 28 d of transplantation by pathological observation. CONCLUSION: iPSCs is efficiently induced into IPCs by a 3-step method , and the induction time is shortened significantly. The hyperglycemia of diabetes mice is reversed after transplanting IPCs to same sex inbred strain mice.

[KEY WORDS]Induced pluripotent stem cells; Insulin-producing cells; Diabetes mellitus

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0118- 06

[收稿日期]2015- 03- 23[修回日期] 2015- 11- 11

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270857)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. S2013010014832)；深圳市科技計(jì)劃(No. GJHZ20120618153934353)

通訊作者△Tel： 0755-25533000-2450; E-mail: frli62@163.com

[中圖分類號]R363; R587.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.020