PI3K/Nrf2通路在內(nèi)毒素休克兔腎損傷中的作用*

陳牡林，　余劍波，　宮麗榮 ，　史　佳

(1天津醫(yī)科大學(xué)南開臨床學(xué)院，天津市南開醫(yī)院麻醉科，天津 300310； 2天津市西青醫(yī)院麻醉科，天津 300380 )

PI3K/Nrf2通路在內(nèi)毒素休克兔腎損傷中的作用*

陳牡林1, 2，余劍波1△，宮麗榮1，史佳1

(1天津醫(yī)科大學(xué)南開臨床學(xué)院，天津市南開醫(yī)院麻醉科，天津 300310；2天津市西青醫(yī)院麻醉科，天津 300380 )

[摘要]目的： 探討磷脂酰肌醇3-激酶/核因子E2相關(guān)因子2(PI3K/Nrf2)信號(hào)通路在內(nèi)毒素休克兔急性腎損傷中的作用。方法: 健康清潔級(jí)雄性新西蘭大白兔50只，隨機(jī)分為5組(每組10只)：對照組(C組)、內(nèi)毒素休克模型組(L組)、渥曼青霉素+內(nèi)毒素休克組(WL組)、渥曼青霉素組(W組)和二甲基亞砜組(D組)。W組、WL組經(jīng)耳緣靜脈注射渥曼青霉素0.6 mg/kg，D組注射二甲基亞砜0.08 mL/kg，C組和L組注射等容量生理鹽水。30 min后，L組和WL組靜脈注射脂多糖5 mg/kg(溶于2 mL生理鹽水)，C組、W組和D組注射等容量生理鹽水。注射脂多糖或生理鹽水后6 h處死兔，取腎組織進(jìn)行腎損傷評分(HSK)，測定血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和尿α1-微球蛋白(α1-MG)濃度，檢測腎組織MDA含量及SOD活性，檢測腎組織Nrf2和HO-1的mRNA總Akt蛋白、p-Akt蛋白、總Nrf2蛋白、p-Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白和HO-1蛋白水平。結(jié)果: 與C組、W組及D組比較，L組和WL組HSK、BUN、Cr、α1-MG及MDA含量升高，SOD活性降低，腎組織Nrf2和HO-1的mRNA、p-Akt蛋白、Nrf2總蛋白、p-Nrf2蛋白、Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的水平上調(diào)(P<0.05)。C組、W組和D組之間上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與L組比較，WL組HSK、BUN、Cr、α1-MG及MDA含量升高，SOD活性降低，腎組織Nrf2和HO-1的mRNA、p-Akt蛋白、Nrf2總蛋白、p-Nrf2蛋白、Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的水平降低(P<0.05)。結(jié)論: PI3K/Nrf2通路激活是內(nèi)毒素休克誘發(fā)兔急性腎損傷時(shí)機(jī)體的適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]磷脂酰肌醇3-激酶；核因子E2相關(guān)因子2； 內(nèi)毒素休克； 急性腎損傷

腎臟是內(nèi)毒素休克最容易累及的器官之一，其機(jī)制不明，治療棘手。研究表明[1]，內(nèi)毒素血癥并發(fā)急性腎衰竭的病死率可高達(dá)74.5%。因而，探明內(nèi)毒素休克腎損傷的機(jī)制，對預(yù)防和減輕急性腎損傷以改善內(nèi)毒素休克預(yù)后有著十分重要的臨床意義。核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(nuclear factor E2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE)是體內(nèi)重要的防御性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們前期研究已經(jīng)證實(shí)，ARE其中重要之一的血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)可以減輕內(nèi)毒素休克腎臟損傷[2]。本研究旨在評價(jià)其上游信號(hào)通路磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Nrf2在內(nèi)毒素休克兔急性腎損傷中的作用，為內(nèi)毒素休克腎損傷的防治提供理論基礎(chǔ)和新思路。

材料和方法

1主要試劑與儀器

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自Sigma；渥曼青霉素(wortmannin)購自Selleck；總RNA提取試劑盒和real-time PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；核蛋白及總蛋白提取試劑盒(Thermo)；山羊抗兔lgG抗體(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)； 抗兔HO-1多克隆抗體(Abcam )；兔Nrf2多克隆抗體(Biorbyt)； p-Akt(Ser470)抗體(博奧森公司)；β-actin抗體(CST)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定試劑盒和超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase，SOD)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。BX51光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡(Olympus)；多功能酶標(biāo)儀(BioTek)；Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)；LineGene 9620實(shí)時(shí)定量PCR儀(杭州博日科技有限公司)。

2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康清潔級(jí)雄性新西蘭大白兔50只，2月齡，體重1.5～2.0 kg。由天津市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供[許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0008]。室溫18～22 ℃，安靜環(huán)境常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水。采取隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為5組(n=10)：對照(control,C)組、內(nèi)毒素休克模型組(L組)、渥曼青霉素+內(nèi)毒素休克組(WL組)、渥曼青霉素組(W組)和二甲基亞砜(dimthyl sulfoxide，DMSO)組(D組)。

3主要方法

3.1內(nèi)毒素休克模型制備實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)耳緣靜脈注射20%烏拉坦5 mL/kg麻醉后，仰臥固定于兔臺(tái)上。耳緣靜脈置管建立靜脈輸液通路。頸部備皮消毒，1%利多卡因局麻，剪開頸部正中皮膚，分離氣管和左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈。行氣管插管及左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈置管，保留自主呼吸，連續(xù)監(jiān)測動(dòng)脈血壓。血壓穩(wěn)定后30 min，W組和WL組經(jīng)耳緣靜脈注射wortmannin 0.6 mg/kg(溶劑為DMSO 0.08 mL/kg)，D組注射DMSO 0.08 mL/kg，C組和L組各注射等容量生理鹽水。30 min后，L組和WL組靜脈注射LPS 5 mg/kg(溶于2 mL生理鹽水)，C組、W組及D組注射等容量生理鹽水。排除給予LPS 后2 h 內(nèi)平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)未下降到基礎(chǔ)值75%及以下或給予LPS 后6 h 內(nèi)死亡的動(dòng)物，并予補(bǔ)充。

3.2標(biāo)本采集與貯存靜脈注射LPS或生理鹽水后6 h經(jīng)心臟采血5 mL，3 000 r/min 4 ℃離心15 min。取膀胱尿液3 mL。采用全自動(dòng)生化分析儀測定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)濃度和尿α1-微球蛋白(α1-microglobulin，α1-MG)濃度。放血處死兔，留取雙腎，4 ℃磷酸鹽緩沖鹽水沖洗腎組織表面，右腎組織用4%甲醛溶液固定，左腎組織液氮罐速凍后保存于-80 ℃低溫冰箱。

3.3腎組織病理觀察與損傷評分取4%甲醛固定的右腎組織，石蠟包埋、切片(厚5 μm)、HE 染色。參照文獻(xiàn)[3-4]介紹的方法，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野于光學(xué)顯微鏡下觀察(×200)，進(jìn)行腎組織損傷評分。腎組織損傷評分標(biāo)準(zhǔn)：(1)近曲小管改變：小管上皮扇貝樣改變，伴有細(xì)胞刷狀緣著色斑片狀脫失為1分；上皮細(xì)胞腫脹或增厚，伴有刷狀緣著色部分脫失為2分；上皮細(xì)胞顯著腫脹或有空泡形成，刷狀緣著色脫失>50%為3分。(2)小管擴(kuò)張和上皮增厚： <25%為1分；25%～50%為2分；>50%為3分。(3)小管壞死/細(xì)胞碎裂： <25%為1分； 25%～50%為2分；>50% 為3分。(4)小管上皮/基底膜剝離：偶發(fā)為1分；片狀(尤其在腎髓質(zhì))為2分； 腎髓質(zhì)和皮質(zhì)多發(fā)為3分。(5)小管上皮細(xì)胞凋亡： <10%為1分；10%～50%為2分；>50% 為3分。

3.4腎組織MDA含量及SOD活性的測定取-80 ℃中保存的左腎組織制備腎組織勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定HO-1及Nrf2的mRNA表達(dá)水平按照總RNA提取試劑盒的操作步驟提取腎組織總RNA，用分光光度法測定其濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)NCBI公布的兔基因序列設(shè)計(jì)引物，通過NCBI中的BLAST功能，檢測引物的特異性。HO-1的上游引物為5’-GTCTACGCCCCGCTCTACTTCCCG-3’，下游引物為5’-TAGCCTCTTCCACCACCCTCTGCC-3’，產(chǎn)物片段長度為394 bp；Nrf2上游引物為5’-TTAGTGCTTTTGAGGATTCTTTCGG-3’，下游引物為5’ -AATTCTGTGCTTTCAGGGTGGTTCT-3’，產(chǎn)物片段長度為262 bp；β-actin上游引物為5’-AAACGAGACGAGATTGGCATGGCTTTA-3’,下游引物為5’-GGGATGCTCGCTCCAACGACTGCT-3’，產(chǎn)物片段長度為143 bp。PCR反應(yīng)體系為QuantiTectTMSYBR Green PCR Mix 10 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，RNase-free ddH2O 6.0 μL；反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用熒光定量PCR儀測定β-actin、HO-1及Nrf2的Ct值，采用SDS軟件以2-ΔΔCt法相對定量分析HO-1和Nrf2 的mRNA表達(dá)水平[5]。

3.6Western blot法測定腎組織HO-1蛋白、總Nrf2蛋白、p-Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白、總Akt蛋白及p-Akt的蛋白水平取-80 ℃保存的左腎組織，按說明提取組織總蛋白及核蛋白，離心取上清液進(jìn)行蛋白定量，取80 μg蛋白加入5×SDS上樣緩沖液，95 ℃變性10 min，經(jīng)10% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜30 min，封閉2 h后，加入兔HO-1多克隆抗體(1∶1 000)、Nrf2多克隆抗體(1∶1 000)和Akt多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔lgG抗體(1∶3 000)，室溫避光搖床孵育1 h后漂洗。于暗室中用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色與曝光，采用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin條帶積分吸光度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1血BUN、Cr及尿α1-MG濃度

與C組比較，L組和WL組血Cr、BUN及尿α1-MG濃度升高(P<0.05)；W組和D組上述指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與L組比較，WL組血Cr、BUN及尿α1-MG濃度升高(P<0.05)，見表1。

表1各組兔血肌酐、尿素氮及尿α1-MG濃度

Table 1.The concentrations of blood urea nitrogen (BUN), creatinine (Cr) and urinary α1-microglobulin (α1-MG) in each group (Mean±SD.n=10)

GroupBUN(mmol/L)Cr(μmmol/L)α1-MG(mg/L)C7.55±0.7378.82±8.294.93±0.87D7.65±1.0584.16±10.855.11±0.98W8.16±1.1781.39±10.135.19±0.89L16.16±1.34*#&138.45±12.76*#&15.52±1.02*#&WL18.48±1.88*#&△166.04±12.21*#&△26.87±1.14*#&△

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D;&P<0.05vsgroup W;△P<0.05vsgroup L.

2腎組織HSK、MDA含量及SOD活性

與C組比較，L組和WL組腎組織的HSK和MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；W組和D組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與L組比較，WL組腎組織的HSK和MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)，見表2。

表2腎組織損傷評分、腎組織丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性的觀察

Table 2.The changes of histological scores, MDA content and SOD activity of the kidney (Mean±SD.n=10)

GroupHSKMDA(mol/g)SOD(μU/g)C1.56±0.475.81±0.70175.79±5.11D2.05±0.815.91±0.96177.36±8.30W1.75±0.806.44±0.91178.81±7.37L6.79±1.36*#&12.29±1.61*#&109.79±4.72*#&WL8.45±0.79*#&△14.20±1.40*#&△85.70±8.65*#&△

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D;&P<0.05vsgroup W;△P<0.05vsgroup L.

3Real-time PCR結(jié)果

與C組比較，L組和WL組腎組織Nrf2及HO-1的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；D組和W組上述指標(biāo)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與L組比較，WL組腎組織Nrf2及HO-1的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見表3。

表3腎組織Nrf2及HO-1的mRNA表達(dá)水平

Table 3.The mRNA expression of HO-1 and Nrf2 in the renal tissues (Mean±SD.n=10)

GroupNrf2mRNAHO-1mRNAC1.00±0.041.00±0.05D0.98±0.070.96±0.05W1.02±0.090.99±0.09L3.04±0.14*#&3.10±0.12*#&WL2.08±0.90*#&△1.90±0.07*#&△

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D;&P<0.05vsgroup W;△P<0.05vsgroup L.

4Western blot結(jié)果

與C組比較，L組和WL組腎組織的p-Akt蛋白、總Nrf2蛋白、p-Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白及HO-1蛋白水平上升(P<0.05)；D組和W組上述指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與L組比較，WL組的p-Akt蛋白、總Nrf2蛋白、p-Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白及HO-1蛋白水平下降(P<0.05)，見圖1，表4和表5。

Figure 1.The protein levels of HO-1, total Nrf2, p-Nrf2, nu-clear Nrf2, total Akt and p-Akt in the renal tissues determined by Western blot.

圖1腎組織HO-1、總Nrf2、p-Nrf2、核Nrf2、總Akt及p-Akt蛋白水平的檢測

表4腎組織總Akt、p-Akt及HO-1蛋白水平的觀察

Table 4.The protein levels of total Akt， p-Akt and HO-1 in the renal tissues (Mean±SD.n=10)

GroupTotalAktproteinp-AktproteinHO-1proteinC0.56±0.030.31±0.040.34±0.07D0.56±0.060.32±0.060.36±0.04W0.54±0.040.32±0.040.36±0.08L0.57±0.050.50±0.09*#&0.56±0.07*#&WL0.55±0.030.42±0.04*#&△0.45±0.10*#&△

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D;&P<0.05vsgroup W;△P<0.05vsgroup L.

表5腎組織總Nrf2、p-Nrf2及核Nrf2蛋白水平的觀察

Table 5.The protein levels of total Nrf2, p-Nrf2 and nuclear Nrf2 in the renal tissues (Mean±SD.n=10)

GroupTotalNrf2proteinp-Nrf2proteinNuclearNrf2proteinC0.43±0.030.36±0.050.34±0.04D0.46±0.040.36±0.040.35±0.08W0.47±0.040.38±0.040.36±0.06L0.71±0.07*#&0.62±0.06#&0.61±0.07*#&WL0.59±0.09*#&△0.53±0.04*#&0.51±0.08*#&△

*P<0.05vsgroup C;#P<0.05vsgroup D;&P<0.05vsgroup W;△P<0.05vsgroup L.

討論

膿毒癥是由病原微生物入侵機(jī)體后引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可進(jìn)展為膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征，其中腎臟是易受攻擊的靶器官之一。研究認(rèn)為[6]，腎臟有效灌注不足，內(nèi)毒素含量增高，凝血機(jī)制失調(diào)及細(xì)胞凋亡等機(jī)制參與了膿毒癥所致腎損傷，其中內(nèi)毒素是引起膿毒癥急性腎損傷過程的重要介質(zhì)。內(nèi)毒素可通過TLR4激活NF-κB信號(hào)通路，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，增加核內(nèi)細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)，釋放大量炎癥因子(TNF-α、內(nèi)皮素1等)，作用于腎臟的系膜細(xì)胞及免疫細(xì)胞系統(tǒng)，引起器官組織血流低灌注、強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)以及氧自由基損傷等，造成腎臟功能損傷[7]。內(nèi)毒素休克模型是實(shí)驗(yàn)室常用模型，本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]中介紹的方法經(jīng)耳緣靜脈注射LPS 5 mg/kg制備兔內(nèi)毒素休克模型，以給予LPS 2 h內(nèi)MAP下降至基礎(chǔ)值的75%及以下為內(nèi)毒素休克模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中，L組和WL 組給予LPS后2 h內(nèi)，MAP均下降至基礎(chǔ)值的75%及以下，且腎組織損傷評分升高、血BUN、Cr、尿α1-MG濃度及腎組織MDA含量升高，提示內(nèi)毒素休克誘發(fā)兔急性腎損傷模型制備成功。

Wortmannin是非ATP競爭型PI3K抑制劑，可與PI3K的110 kD催化亞基結(jié)合，特異性抑制PI3K，從而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路[9]。文獻(xiàn)報(bào)道[10]使用wortmannin 0.6 mg/kg可成功阻斷兔心肌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路，且無死亡及急性毒性反應(yīng)，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用wortmannin 0.6 mg/kg作為實(shí)驗(yàn)劑量。結(jié)果顯示，與C組比較，W組及D組血清BUN、血清Cr、尿α1-MG濃度及腎組織MDA含量均無顯著差異，可以排除實(shí)驗(yàn)劑量wortmannin及DMSO對腎損傷的影響。

PI3K是存在于體內(nèi)多種細(xì)胞的一種脂激酶。Akt又稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的下游靶激酶。細(xì)胞內(nèi)外刺激可通過酪氨酸蛋白激酶激活PI3K生成PIP3，與Akt結(jié)合并暴露其活性位點(diǎn)，在磷脂酰肌醇依賴型蛋白激酶催化和輔助下， Akt上Ser 473和(或)Thr 308位點(diǎn)磷酸化而被激活?；罨腁kt可引起下游磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)和靶蛋白之間的相互作用，調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、生長與存活等一系列生物學(xué)效應(yīng)[11-12]。Nrf2是CNC(cap′n′collar)家族中活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。生理狀態(tài)下，Nrf2以Keap-1-Nrf2異二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，以Keap-1介導(dǎo)的蛋白酶體泛素化反應(yīng)的方式降解，處于低濃度非活性狀態(tài)；在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Keap-1構(gòu)象改變，或者Nrf2磷酸化，Nrf2從胞漿蛋白Keap-1中解離，易位至細(xì)胞核與抗氧化基因啟動(dòng)子區(qū)域的ARE結(jié)合，激活下游的抗氧化蛋白如SOD、HO-1及過氧化氫酶(catalase，CAT)等的活性表達(dá)，維持機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)[13]。Nrf2的活化受蛋白磷酸化的調(diào)控，目前認(rèn)為，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、PI3K、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等信號(hào)通路分子廣泛參與了Nrf2的活化和核轉(zhuǎn)位過程， 誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位的信號(hào)通路類型與誘導(dǎo)劑及細(xì)胞種類等因素相關(guān)[14]。PI3K可通過調(diào)整肌動(dòng)蛋白微絲的排列，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白解聚，導(dǎo)致Nrf2與Keap-1復(fù)合體解體，增加Nrf2核轉(zhuǎn)位[15]。

本研究結(jié)果顯示，給予內(nèi)毒素后腎組織Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)上調(diào)， p-Akt、總Nrf2蛋白、p-Nrf2、核Nrf2蛋白及HO-1蛋白水平增加，SOD活性增強(qiáng)，表明內(nèi)毒素作用下，PI3K/Akt-Nrf2通路激活，抗氧化蛋白表達(dá)增加，機(jī)體抗氧化損傷能力增強(qiáng)。內(nèi)毒素休克兔給予PI3K特異性阻斷劑wrotmannin后，腎組織Nrf2及HO-1的mRNA表達(dá)下調(diào)，p-Akt、總Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白及HO-1蛋白水平減少，SOD活性減弱，表明抑制PI3K/Akt后，Nrf2及其下游蛋白表達(dá)減少，機(jī)體抗氧化損傷能力下降，內(nèi)毒素休克所致腎損傷加重。但抑制PI3K/Akt后，腎組織Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)并未完全阻斷，表明腎組織Nrf2/ARE通路的激活可能存在除PI3K以外的其它調(diào)控因素。關(guān)于PI3K以外相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控腎組織Nrf2/ARE通路的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PI3K/Nrf2通路激活是兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性腎損傷時(shí)機(jī)體的適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)機(jī)制之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Van Biesen W, Van Massenhove J, Lameire N, et al. Does urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin really solve the issue of discriminating prerenal from intrinsic acute kidney injury？[J]. Kidney Int, 2012, 81(3):321.

[2]Yu JB, Zhou F, Yao SL, et al. Effect of heme oxygenase-1 on the kidney during septic shock in rats[J]. Transl Res, 2009, 153(6):283-287.

[3]胡菁?jí)簦瑒⒑陮?，王?qiáng)，等. 重復(fù)電針刺激腎腧穴預(yù)處理對大鼠腎缺血再灌注損傷的影響[J]. 中華麻醉學(xué)雜志, 2012 , 32 (8):1002-1005.

[4]Blydt-Hansen TD, Katori M, Lassman C, et al. Gene transfer-induced local heme oxygenase-1 overexpression protects rat kidney transplants from ischemia/ reperfusion injury [J]. J Am Soc Nephrol, 2003, 14(3):745-754.

[5]Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparativeCTmethod[J]. Nat Protoc, 2008, 3(6): 1101-1108.

[6]周樹根，吳儉. 小兒膿毒癥致急性腎損傷發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2014, 54(7):96-99.

[7]Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product[J]. J Immunol, 1999, 162(7):3749-3752.

[8]Yu JB, Dong SA, Luo XQ, et al. Role of HO-1 in protective effect of electro-acupuncture against endotoxin shock-induced acute lung injury in rabbits[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2013, 238(6):705-712.

[9]Walker EH, Pacold ME, Perisic O, et al. Structural determinants of phosphoinositide 3-kinase inhibition by wortmannin, LY294002, quercetin, myricetin, and staurospo-rine[J]. Mol Cell, 2000, 6(4):909-911.

[10]劉國利, 張錦英, 沈圖. 異氟醚后處理對兔心肌缺血-再灌注損傷的影響[J]. 臨床麻醉學(xué)雜志, 2011, 27(11):1116-1118.

[11]Foster FM, Traer CJ, Abraham SM, et al. The phosphoinositide (PI) 3-kinase family[J].J Cell Sci, 2003, 116(Pt 15):3037-3040.

[12]Eisenreich A, Rauch U. PI3K inhibitors in cardiovascular disease [J]. Cardiovasc Ther, 2011, 29(1):29-36.

[13]Piao MS, Park JJ, Choi JY, et al. Nrf2-dependent and Nrf2-independent induction of phase 2 detoxifying and antioxidant enzymes during keratinocyte differentiation[J]. Arch Dermatol Res, 2012, 304(5):387-395.

[14]Shen G, Jeong WS, Hu R, et al. Regulation of Nrf2,NF-κB,and AP-1 signaling pathways by chemopreentive agents[J]. Antioxid Redox Signal, 2005, 7(11-12): 1648-1663.

[15]Kang KW, Lee SJ, Park JW, et al. Phosphatidylinositol 3-kinase regulates nuclear translocation of NF-E2-related factor 2 through actin rearrangement in response to oxidative stress[J]. Mol Pharmacol, 2002, 62(5):1001-1010.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Role of PI3K/Nrf2 signaling pathway in endotoxin-induced acute kidney injury in rabbits

CHEN Mu-lin1, 2, YU Jian-bo1, GONG Li-rong1, SHI Jia1

(1DepartmentofAnesthesiology,TianjinNankaiHospital,NankaiClinicalCollegeofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300310,China;2DepartmentofAnesthesiology,TianjinXiqingHospital,Tianjin300380,China.E-mail:jianboyu99@sina.com)

[ABSTRACT]AIM: To evaluate the role of phosphatidylinositol 3-kinase/nuclear factor E2-related factor 2 (PI3K/Nrf2) signaling pathway in endotoxin-induced acute kidney injury in rabbits. METHODS: Healthy male New Zealand white rabbits were randomly divided into 5 groups: control group (group C), LPS group (group L), wortmannin+LPS group (group WL), wortmannin group (group W) and dimthyl sulfoxide (DMSO) group (group D). Wortmannin at dose of 0.6 mg/kg was injected via the auricular vein in groups W and WL, DMSO at concentration of 0.08 mL/kg was injected in group D, while normal saline (0.08 mL/kg) was injected in groups C and L. LPS at dose of 5 mg/kg was injected via the auricular vein in groups L and WL 30 min later, and equal volume of normal saline was injected in group C, D and W for control. The rabbits were sacrificed 6 h after LPS or normal saline administration. The kidneys were removed for microscopic examination and the determination of histological scores of kidney (HSK). The concentrations of blood urea nitrogen (BUN) and creatinine (Cr), urinary α1-microglobulin (α1-MG), MDA content, SOD activity, the mRNA expression of Nrf2 and HO-1, and the protein levels of total Akt, p-Akt, total Nrf2, p-Nrf2, nuclear Nrf2 and HO-1 in the renal tissues were also detected. RESULTS: Compared with groups C, D and W, the concentrations of BUN and Cr, urinary α1-MG concentration, MDA content and HSK were significantly increased, while SOD activity was significantly decreased (P<0.05). The mRNA expression of Nrf2 and HO-1, and the protein levels of p-Akt, total Nrf2, p-Nrf2, nuclear Nrf2 and HO-1 in the renal tissues were significantly increased in groups L and WL. No significant change among groups C, D and W was observed. Compared with group L, the concentrations of BUN and Cr, urinary α1-MG concentration, MDA content and HSK were significantly increased, while SOD activity, the mRNA expression of Nrf2 and HO-1, and the protein levels of p-Akt, total Nrf2, p-Nrf2, nuclear Nrf2 and HO-1 in the renal tissues were significantly decreased in group WL. CONCLUSION: Activation of PI3K/Nrf2 signaling pathway may be one of the regulatory mechanisms of the body adapting to the endotoxin-induced acute kidney injury in rabbits.

[KEY WORDS]Phosphatidylinositol 3-kinase; Nuclear factor E2-related factor 2; Endotoxic shock; Acute kidney injury

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0129- 05

[收稿日期]2015- 03- 11[修回日期] 2015- 10- 22

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81372096)

通訊作者△Tel： 022-27435289； E-mail： jianboyu99@sina.com

[中圖分類號(hào)]R363.2; R515.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.022