尤慧敏, 康祥錦, 楊 潔, 林燕珊, 劉見橋, 杜紅姿
(廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學中心,廣東省生殖醫(yī)學重點實驗室,廣東省產(chǎn)科重大疾病重點實驗室,廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室, 廣東 廣州 510150)
EGCG通過調(diào)控SIRT1-P53通路誘導人卵巢癌SKOV-3細胞凋亡*
尤慧敏,康祥錦,楊潔,林燕珊,劉見橋,杜紅姿△
(廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學中心,廣東省生殖醫(yī)學重點實驗室,廣東省產(chǎn)科重大疾病重點實驗室,廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室, 廣東 廣州 510150)
[摘要]目的: 研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)調(diào)控人卵巢癌SKOV-3細胞活力和凋亡的分子機制。方法: SKOV-3細胞給予EGCG(0~50 μmol/L)、SIRT1激動劑SRT1720(1 μmol/L)和SIRT1抑制劑EX527(1 μmol/L)處理后,用CCK-8法檢測細胞活力,流式細胞術檢測細胞凋亡,real-time PCR檢測Bax和Bcl-2 mRNA的表達水平;采用SIRT1去乙酰化酶活性檢測試劑盒檢測SIRT1酶活性;使用Western blot法檢測SIRT1、乙?;疨53和P53的蛋白表達變化。結果: 與正常對照組相比,單獨給予EGCG或EX527處理之后SKOV-3細胞活力下降,凋亡率增加;SIRT1的酶活性和蛋白表達水平均明顯下降;P53的乙?;斤@著增加。與EGCG組相比,SRT1720預處理組的細胞活力上升,凋亡率下降,Bax/Bcl-2的相對比值及激活型caspase-3的蛋白水平明顯下降,并且SIRT1的酶活性和蛋白表達水平顯著增加,P53的乙?;较陆?。結論: EGCG可通過調(diào)控SIRT1-P53通路抑制卵巢癌SKOV-3細胞活力并誘導其凋亡。
[關鍵詞]表沒食子兒茶素沒食子酸酯; SKOV-3細胞; 細胞凋亡; SIRT1-P53通路
卵巢癌是婦科常見腫瘤之一,其死亡率高居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤榜首,且呈逐年上升趨勢。因為卵巢癌缺乏早期癥狀和早期診斷的檢測手段,往往在首次確診時,病灶已擴散至卵巢外。目前采用手術治療雖可以起到較好的療效,但通常會在短時間內(nèi)復發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。除手術治療外,臨床上主要使用以鉑類和紫杉醇為基礎的聯(lián)合化療方案,可延長患者的生存時間,提高生活質(zhì)量。然而由于化療的耐藥時常發(fā)生,并且這種治療方法存在神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓抑制等嚴重不良反應,許多患者難以承受,長期生存率未獲改變[2-3]。因此,尋找新型高效、低毒的化療藥物是目前卵巢癌研究的主要方向之一。
天然產(chǎn)物大多具有低毒的特點。近年來研究發(fā)現(xiàn),很多天然植物分離提取物具有抑制腫瘤細胞增殖的作用,一些已進入臨床試驗階段,其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是目前研究較多的一個[4]。EGCG是綠茶茶多酚的主要成份,具有抗氧化、清除自由基等多種生物活性[5]。研究表明,EGCG對包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞均有明顯的抑制作用,有望成為新型的抗腫瘤化療藥物[5-6]。然而,到目前為止,EGCG調(diào)控卵巢癌細胞增殖與凋亡的具體分子機制并不十分清楚。本實驗使用卵巢癌細胞株SKOV-3作為研究對象,通過觀察不同濃度EGCG對SKOV-3細胞SIRT1-P53通路的調(diào)控作用,初步探討EGCG抑制卵巢癌的分子機制,為進一步將EGCG應用于卵巢癌臨床治療提供實驗依據(jù)。
材料和方法
1主要試劑和藥品
人卵巢癌細胞株SKOV-3購自上海中科院細胞研究所;高糖培養(yǎng)基DMEM和新生牛血清分別購自Gibco;EGCG(純度>98%)購自Sigma,用超純水配成100 mmol/L,-20 ℃避光保存;CCK-8試劑盒購自日本Dojindo;細胞凋亡Annexin V-FITC熒光檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;SIRT1去乙?;富钚詸z測試劑盒購自Cycle;SIRT1兔多抗、cleaved caspase-3兔多抗和乙?;疨53 (acetyla-ted P53,Ac-P53)兔多抗購自CST;β-actin小鼠單抗、P53小鼠單抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠和羊抗兔II抗為Santa Cruz產(chǎn)品;SIRT1激動劑SRT1720和抑制劑EX527均購自Selleck,用DMSO配成1 mmol/L,-20 ℃避光保存。各目的基因及內(nèi)參引物以Primer Premier 5.0 軟件設計,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,具體序列見表1。
表1 引物序列
2主要方法
2.1細胞培養(yǎng)與處理人卵巢癌細胞株SKOV-3使用含10%新生牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細胞根據(jù)實驗要求接種至不同規(guī)格的培養(yǎng)板中,待細胞貼壁后血清饑餓12 h,隨后加入指定濃度的EGCG(0~50 μmol/L)、SIRT1激動劑SRT1720(1 μmol/L)或SIRT1抑制劑EX527(1 μmol/L)培養(yǎng)預定時間,培養(yǎng)結束后進行后續(xù)實驗。
2.2SIRT1去乙酰化酶活性檢測接種細胞至60 mm培養(yǎng)皿中,按照實驗要求加入EGCG、SIRT1激動劑SRT1720或SIRT1抑制劑EX527處理細胞,給藥結束后檢測SIRT1酶活性。檢測步驟按照SIRT1去乙酰化酶活性測定試劑盒說明書進行。棄培養(yǎng)基,PBS洗3次,裂解液冰上裂解5~10 min,超聲處理15 s,4 ℃ 14 000×g離心10 min,取上清。加入1 μg SIRT1抗體,4 ℃慢搖2 h,加入15 μL Protein G瓊脂糖微球,4 ℃搖擺過夜,4 ℃ 14 000×g離心30 s,棄上清,用裂解液洗滌沉淀,按照說明書要求配制去乙酰化酶反應體系,充分混勻后加入避光的96孔板中,采用Tecan多功能酶標儀檢測熒光強度[激發(fā)光波長為(490±10) nm;發(fā)射光波長為(530±10) nm]。
2.3Western blot檢測蛋白表達細胞無血清處理之后,按照實驗要求加入EGCG、SIRT1激動劑SRT1720或SIRT1抑制劑EX527處理細胞,給藥結束后,棄培養(yǎng)基,加入RIPA裂解液提取總蛋白,依次進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)、封閉,4 ℃孵育I抗過夜,室溫孵育II抗1 h,并采用化學發(fā)光法檢測蛋白表達情況,使用ImageJ軟件進行條帶灰度分析。
2.4CCK-8法檢測細胞活力接種SKOV-3細胞于96孔板,血清饑餓完成之后,按照實驗要求加入EGCG、SIRT1激動劑SRT1720或SIRT1抑制劑EX527處理細胞,每組設6個平行孔。處理結束后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h,450 nm波長處檢測吸光度值A,并計算細胞增殖。細胞活力(%)=實驗組A450/對照組A450×100%。
2.5流式細胞術檢測細胞凋亡接種SKOV-3細胞至60 mm平皿中,按照實驗要求加入EGCG、SIRT1激動劑SRT1720或SIRT1抑制劑EX527處理細胞,處理完成后,棄培養(yǎng)基。收集細胞并計數(shù),按照Annexin V/PI雙染流式細胞檢測試劑盒說明書對SKOV-3細胞進行染色后,上機檢測,分析細胞凋亡率。
2.6Real-time PCR檢測mRNA的表達按照實驗要求加入EGCG、SIRT1激動劑SRT1720或SIRT1抑制劑EX527處理細胞,給藥結束后,使用TRIzol 試劑(Invitrogen)從SKOV-3細胞中提取總RNA,將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用能與雙鏈DNA 結合便可發(fā)出熒光的熒光染料SYBR Green(TaKaRa)進行PCR 擴增,通過檢測PCR 反應中熒光信號強度,對目的基因進行準確定量。以GAPDH 為內(nèi)參照。
3統(tǒng)計學處理
使用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,各組數(shù)據(jù)以均值±標準差(mean±SD)表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行多組間分析,各組數(shù)據(jù)間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
結果
1EGCG對人卵巢癌SKOV-3細胞株SIRT1-P53通路的影響
不同濃度EGCG(0、12.5、25和50 μmol/L)處理SKOV-3細胞24 h后,采用SIRT1去乙?;富钚詸z測試劑盒檢測細胞中SIRT1的去乙酰化酶活性,利用Western blot實驗檢測SIRT1、Ac-P53和P53的蛋白水平。結果顯示,隨著EGCG濃度增加,SIRT1的去乙?;富钚院偷鞍妆磉_顯著下降(P<0.05),并且P53的乙?;斤@著增加(P<0.05),見圖1。
Figure 1.The effect of EGCG on SIRT1-P53 signaling pathways in ovarian cancer cell line SKOV-3. SKOV-3 cells were treated with various concentrations (0~50 μmol/L) of EGCG for 24 h. A: SIRT1 deacetylase activity was measured by SIRT1 deacetylase fluorometric assay kit; B: the protein levels of SIRT1, Ac-P53 and P53 were examined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.
圖1EGCG 對卵巢癌SKOV-3細胞SIRT1-P53通路的影響
2EGCG通過抑制SIRT1誘導人卵巢癌SKOV-3細胞凋亡
為了明確SIRT1在EGCG誘導SKOV-3細胞凋亡中的作用,SKOV-3細胞單獨給予SIRT1抑制劑EX527處理,或使用SIRT1的激動劑SRT1720(1 μmol/L)預處理SKOV-3細胞之后,再給予EGCG(50 μmol/L)處理24 h,采用CCK-8法檢測SKOV-3細胞活力,并使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果顯示,在SKOV-3細胞中給予SRT1720預處理之后,EGCG抑制細胞活力和誘導細胞凋亡的作用被取消(P<0.05)。而單獨給予EX527處理能夠模擬EGCG的作用,從而抑制SKOV-3的細胞活力,并誘導凋亡,見圖2。
Figure 2.SIRT1 participated in the effect of EGCG on the activity and apoptosis of ovarian cancer cell line SKOV-3. SKOV-3 cells were treated with 1 μmol/L EX527 or pretreated with 1 μmol/L SRT1720 for 1 h followed by stimulation with EGCG (50 μmol/L) for 24 h. A: cell viability was measured by CCK-8 assay; B: apoptosis was assessed by flow cytometric analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGCG group.
圖2SIRT1參與了EGCG對人卵巢癌細胞SKOV-3活力和凋亡的調(diào)控
3SIRT1參與了EGCG對SKOV-3細胞凋亡相關基因的影響
為了進一步明確SIRT1在EGCG誘導SKOV-3細胞凋亡中的作用,SKOV-3細胞單獨給予SIRT1抑制劑EX527處理,或給予SRT1720預處理細胞1 h后,再給予EGCG(50 μmol/L)處理24 h,并分別采用real-time PCR和Western blot的方法檢測凋亡相關基因Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的水平。結果表明EGCG可顯著增加Bax的mRNA表達,降低Bcl-2的mRNA表達,Bax/Bcl-2的比值明顯增加(P<0.05),并且cleaved caspase-3的蛋白水平顯著上升(P<0.05)。而SRT1720預處理可逆轉(zhuǎn)EGCG對Bax、Bcl-2以及cleaved caspase-3水平的影響(P<0.05)。單獨給予EX527處理能夠模擬EGCG的作用,增加Bax/Bcl-2的比值和cleaved caspase-3的蛋白水平,見圖3。
Figure 3.SIRT1 participated in the effect of EGCG on the expression of apoptosis-related genes in ovarian cancer cell line SKOV-3. SKOV-3 cells were treated with 1 μmol/L EX527 or pretreated with 1 μmol/L SRT1720 for 1 h followed by stimulation with EGCG (50 μmol/L) for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGCG group.
圖3SIRT1參與了EGCG對人卵巢癌細胞SKOV-3凋亡相關基因表達的調(diào)控
4EGCG通過抑制SIRT1調(diào)控P53的乙?;?/p>
為了進一步研究EGCG調(diào)控SKOV-3細胞凋亡的分子機制,SKOV3細胞單獨給予SIRT1抑制劑EX527處理,或給予SRT1720預處理1 h,再給予EGCG處理24 h之后,我們分別檢測了SIRT1的去乙?;富钚砸约癝IRT1和Ac-P53的蛋白水平。結果表明SRT1720可取消EGCG對SIRT1去乙?;富钚砸约癝IRT1和Ac-P53蛋白水平的影響(P<0.05),而單獨給予EX527處理能夠抑制SIRT1酶活性和蛋白表達,增加P53的乙?;?提示SIRT1參與了EGCG對其下游P53乙?;降恼{(diào)控作用,見圖4。
討論
卵巢癌因發(fā)病隱匿,易于轉(zhuǎn)移,已成為死亡率最高的婦科惡性腫瘤。目前,卵巢癌術后化療藥物的毒副作用及耐藥性使得預后較差。因此,需要尋找高效低毒的藥物與放療聯(lián)合應用來提高卵巢癌的治療效果。而EGCG正具備這樣2個特點。大量研究證明EGCG可抑制多種腫瘤細胞增殖誘導凋亡并具有阻止腫瘤細胞的侵襲等生物學作用[6-8]。在臨床試驗中,受試者單次服用EGCG劑量達1 600 mg或每日服用800 mg,連續(xù)服藥1個月,除可見輕度胃腸道反應外,沒有出現(xiàn)明顯的毒副反應,提示EGCG的安全性高[4, 9]。關于EGCG在卵巢癌中的作用也有一定的報道。EGCG可通過激活p38 MAPK通路,下調(diào)MMP-2的蛋白表達從而抑制卵巢癌細胞株OVCAR-3增殖并誘導其凋亡[10]。最近的研究發(fā)現(xiàn)EGCG還可增加順鉑對卵巢癌細胞株的敏感性[7]。在本實驗中,我們也發(fā)現(xiàn)50 μmol/L的EGCG能夠顯著抑制人卵巢癌SKOV-3的細胞活力,誘導細胞凋亡,提示EGCG可能是一個潛在的治療卵巢癌的化療藥物。然而,關于EGCG調(diào)控卵巢癌細胞增殖與凋亡的具體分子機制并不十分清楚,值得進一步研究。
近年來,SIRT1因在腫瘤形成過程中扮演的重要角色而引起人們的廣泛關注[11]。SIRT1 屬于煙酰胺(NAD+)依賴的Ⅲ型組蛋白去乙酰化酶sirtuin家族,哺乳動物sirtuin家族包含7個成員(SIRT1~7)[12]。在sirtuin家族成員中,SIRT1是調(diào)控物質(zhì)代謝、壽命長短以及細胞衰老的重要因子[13]。研究表明SIRT1可通過使腫瘤抑制蛋白P53第382位的賴氨酸殘基發(fā)生去乙酰化作用,從而降低P53的活性,因此使細胞繞過P53介導的凋亡而繼續(xù)存活[14]。目前,SIRT1在卵巢癌細胞中的作用研究較少。在卵巢癌組織中,有研究表明SIRT1的蛋白表達及去乙?;富钚跃@著增加[15]。而de Jong等[16]發(fā)現(xiàn)一種花生四烯酸代謝物15d-PGJ2能夠通過抑制SIRT1的表達進而誘導卵巢癌細胞A2780凋亡。以上結果提示SIRT1在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。然而,EGCG是否能夠調(diào)控SIRT1-P53通路?SIRT1-P53信號通路是否參與了EGCG誘導人卵巢癌細胞SKOV-3凋亡的過程?這些問題都需要進一步研究。在本實驗中,我們首次發(fā)現(xiàn)EGCG可劑量依賴性地抑制SKOV-3細胞中SIRT1的去乙?;富钚院偷鞍妆磉_水平,并增加SIRT1下游P53的乙?;?。為了進一步明確SIRT1-P53通路在EGCG調(diào)控人卵巢癌SKOV-3細胞增殖和凋亡中的作用,我們給予SKOV-3細胞SIRT1的特異性激動劑SRT1720預處理,發(fā)現(xiàn)SRT1720可顯著逆轉(zhuǎn)EGCG對SKOV-3細胞活力和凋亡的影響,進一步的研究表明SRT1720還可拮抗EGCG對SIRT1-P53通路的調(diào)控作用。而單獨給予SIRT1的抑制劑EX527可誘導SKOV3細胞凋亡,抑制SIRT1去乙酰化酶活性從而增加P53的乙?;健?/p>
Figure 4.EGCG regulated the P53 acetylation through SIRT1 inhibition. SKOV-3 cells were treated with 1 μmol/L EX527 or pretreated with 1 μmol/L SRT1720 for 1 h followed by stimulation with EGCG (50 μmol/L) for 24 h. A: SIRT1 deacetylase acti-vity was measured by SIRT1 deacetylase fluorometric assay kit; B: the protein levels of SIRT1, Ac-P53 and P53 were exa-mined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGCG group.
圖4EGCG通過抑制SIRT1調(diào)控P53的乙?;?/p>
綜上所述,本實驗證明SIRT1-P53通路參與了EGCG誘導人卵巢癌SKOV-3細胞凋亡的病理過程,我們的研究為EGCG在卵巢癌防治中的應用提供了必要的實驗資料和理論依據(jù)。
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(責任編輯: 陳妙玲, 羅森)
Epigallocatechin gallate induces apoptosis of ovarian cancer cell line SKOV-3 via regulation of SIRT1-P53 pathways
YOU Hui-min, KANG Xiang-jin, YANG Jie, LIN Yan-shan, LIU Jian-qiao, DU Hong-zi
(CenterforReproductiveMedicine,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,KeyLaboratoryforReproductiveMedicineofGuangdongProvince,KeyLaboratoryforMajorObstetricDiseasesofGuangdongProvince,KeyLaboratoryofReproductionandGeneticsofGuangdongHigherEducationInstitutes,Guangzhou510150,China.E-mail:hongzidgzmu@163.com)
[ABSTRACT]AIM: To study the effect of epigallocatechin gallate (EGCG) on the growth and apoptosis of ova-rian cancer cell line SKOV-3 and its molecular mechanism. METHODS: SKOV-3 cells were treated with different concentrations of EGCG (0~50 μmol/L), SRT1720 (1 μmol/L) or EX527 (1 μmol/L) for 24 h. The cell activity was evaluated by CCK-8 assay. The apoptosis of SKOV-3 cells was analyzed by flow cytometry. The mRNA expression of Bcl-2 and Bax was detected by real-time PCR. SIRT1 deacetylase fluorometric assay kit was used to detect the activity of SIRT1. The protein levels of SIRT1 and acetylated P53 (Ac-P53) were determined by Western blot. RESULTS: EGCG or EX527 decreased the deacetylase activity and protein expression of SIRT1, and increased the level of Ac-P53 in a dose-dependent manner. Moreover, SRT1720 abrogated the effects of EGCG on the activity, apoptosis and SIRT1-P53 pathways in ovarian cancer cell line SKOV-3. CONCLUSION: EGCG inhibits the activity and induces apoptosis of ovarian cancer cell line SKOV-3 by regulating SIRT1-P53 pathways.
[KEY WORDS]Epigallocatechin gallate; SKOV-3 cells; Apoptosis; SIRT1-P53 pathway
[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0076- 07
[收稿日期]2015- 07- 23[修回日期] 2015- 10- 23
*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81401254);廣東省中醫(yī)藥局建設中醫(yī)藥強省科研項目(No. 20142097);廣州市教育局市屬高??蒲许椖?No. 1201430205)
通訊作者△Tel: 020-81292233; E-mail: hongzidgzmu@163.com
[中圖分類號]R730.23; R737.31
[文獻標志碼]A
doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.013