苯丙氨酸羥化酶在日本刺沙蠶腦內(nèi)的表達分析

任桂敏，董哲，劉超，劉乙蒙，欒治東，劉琪，暴學(xué)祥，王順

1 遼寧醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州　121000 2 遼寧醫(yī)學(xué)院 發(fā)育生物學(xué)教研室，遼寧 錦州　121000 3 東北師范大學(xué) 昆蟲腦神經(jīng)生物學(xué)實驗室，吉林 長春　130024

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苯丙氨酸羥化酶在日本刺沙蠶腦內(nèi)的表達分析

任桂敏1，董哲1，劉超2，劉乙蒙2，欒治東2，劉琪3，暴學(xué)祥3，王順1

1 遼寧醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州121000 2 遼寧醫(yī)學(xué)院 發(fā)育生物學(xué)教研室，遼寧 錦州121000 3 東北師范大學(xué) 昆蟲腦神經(jīng)生物學(xué)實驗室，吉林 長春130024

任桂敏, 董哲, 劉超, 等. 苯丙氨酸羥化酶在日本刺沙蠶腦內(nèi)的表達分析. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(4): 518–526.

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摘要:苯丙氨酸羥化酶 (PAH) 是芳香族氨基酸羥化酶家族 (AAAHs) 的一員，催化苯丙氨酸 (Phe) 轉(zhuǎn)化為酪氨酸 (Tyr)。運用Western blotting技術(shù)檢測沙蠶PAH免疫原性。制作沙蠶頭部石蠟切片，運用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測PAH蛋白表達定位情況。解剖剝離沙蠶腦組織，提取總RNA，運用RT-PCR技術(shù)克隆pah基因片段，構(gòu)建質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中擴增，挑單一均勻菌落培養(yǎng)，雙酶切鑒定后測序并比對同源性。Western blotting結(jié)果表明pah表達的蛋白存在于沙蠶腦內(nèi)，免疫組化標記技術(shù)結(jié)果表明苯丙氨酸羥化酶主要分布在日本刺沙蠶前腦中腹側(cè)、中腦背側(cè)和兩側(cè)。RT-PCR結(jié)果表明沙蠶腦內(nèi)存在苯丙氨酸羥化酶基因，且與多種動物pah具有同源性。在蛋白質(zhì)和核酸水平鑒定了低等環(huán)節(jié)動物日本刺沙蠶腦組織內(nèi)苯丙氨酸羥化酶的存在，為進一步研究無脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)芳香族氨基酸羥化酶的基因分化奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:日本刺沙蠶，苯丙氨酸羥化酶，免疫組織化學(xué)，RT-PCR

Received: December 24, 2015; Accepted: March 3, 2016

Supported b y: National Natural Science Foundation of China (No. 31071912), College Students' Innovative Training Program Foundation of Liaoning Province (No. 201210160015).

含有芳香環(huán)的酪氨酸 (Tyrosine，Tyr)、苯丙氨酸 (Phenylalanine，Phe) 和色氨酸(Tryptophan，Trp) 統(tǒng)稱作芳香族氨基酸[1]，對芳香族氨基酸具有羥化活力的酶通稱作芳香族氨基酸羥化酶[2]。依據(jù)羥化作用底物的不同將芳香族氨基酸羥化酶分為3種，即苯丙氨酸羥化酶 (Phenylalanine hydroxylase，PAH)、色氨酸羥化酶 (Tryptophan hydroxylase，TPH) 和酪氨酸羥化酶 (Tyrosine hydroxylase，TH)，這3種酶組成芳香族氨基酸羥化酶家族[3-5](Aromatic amino acid hydroxylases，AAAHs)。苯丙氨酸羥化酶作為芳香族氨基酸羥化酶家族的一員，主要催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸[6]，是苯丙氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶和限速酶。人類 (Human) PAH基因與重要代謝疾病苯丙酮尿癥(Phenylketonuria，PKU) 等疾病密切相關(guān)[7-10]，線蟲Nematode的PAH基因與表皮的黑色素合成有關(guān)[11]，果蠅Drosophila melanogaster PAH基因與表皮硬化、眼色素合成以及神經(jīng)活動有關(guān)[12-13]，埃及伊蚊Aedes aegypti PAH基因與防御免疫黑化有關(guān)[14]。研究結(jié)果表明苯丙氨酸羥化酶在人體及動物中具有重要作用。

在對無脊椎動物芳香族氨基酸羥化酶基因進化的研究中，目前認為酪氨酸羥化酶首先從芳香族氨基酸羥化酶基因家族中分化出來[15]，而后苯丙氨酸羥化酶才與色氨酸羥化酶分化開，形成3種具有獨立功能的酶[16]。目前研究表明PAH和TPH在節(jié)肢動物門已經(jīng)分化成各自獨立的酶[17]，但兩者是否在更低等生物中分化成獨立的酶，還沒有明確的證據(jù)。本課題采用Western blotting技術(shù)、免疫組化標記技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，對在進化上比節(jié)肢動物更低等的環(huán)節(jié)動物的典型代表動物日本刺沙蠶Neathes japonica腦內(nèi)PAH的存在、表達定位和克隆進行分析，以期在蛋白質(zhì)和核酸水平上證明在環(huán)節(jié)動物中存在獨立的PAH基因，為芳香族氨基酸羥化酶基因的分化研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

兔抗PAH多克隆抗體、β-actin兔抗多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自南京恩晶生物公司，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福建邁新生物公司，樹脂石蠟(Colophony-Paraffin，CP) 包埋劑為東北師范大學(xué)暴學(xué)祥教授提供，3′ RACE PCR試劑盒、大腸桿菌Escherichia coli Competent Cell DH5α、LA Tap酶、pHSG396載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ均購自TaKaRa公司。膠回收試劑盒、小劑量質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司。引物由北京鼎國生物公司合成?；蛐蛄杏缮虾＝芾钌锕緶y序完成。

1.2方法

1.2.1Western blotting檢測沙蠶腦內(nèi)苯丙氨酸羥化酶的表達

剝離日本刺沙蠶腦組織置于EP管中剪碎，加入裂解液超聲振碎制成勻漿，冰上靜置30 min，4 ℃、13 000 r/min離心20 min，使用BCA法蛋白定量，制得標準曲線后，經(jīng)計算得樣品蛋白濃度，最后將蛋白樣品制成約2 μg/μL，沸水煮5 min使蛋白變性。

制膠后電泳槽加足量SDS-PAGE電泳液，將上述制備好的蛋白樣品緩慢加入上樣孔，先80 V電泳20 min，樣品通過濃縮膠后，再120 V電泳100 min。電泳后輕輕撬下凝膠，放入裝有轉(zhuǎn)膜液的平皿中，按陽極、濾紙、PVDF膜、膠、濾紙、陰極的順序放在轉(zhuǎn)膜儀20 V轉(zhuǎn)膜20 min，轉(zhuǎn)好的PVDF膜放入5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉2 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。一抗 (TBST稀釋1∶200) 孵育4 ℃過夜，洗膜3次后二抗室溫孵育2 h，用新配置的發(fā)光液浸沒室溫孵育1 min，去除多余發(fā)光液后顯影照相。同樣的方法用β-actin兔抗多克隆抗體代替一抗同步進行上述實驗過程，作為陽性對照。

1.2.2免疫組化檢測沙蠶腦內(nèi)苯丙氨酸羥化酶的表達定位

將日本刺沙蠶的頭和軀干分離后，快速將頭放入4%多聚甲醛中室溫固定4 h，然后用0.1 mol/L PBS (pH 7.4) 洗3次，15 min/次，之后用梯度酒精脫水 (70%、80%、90%、95%、100%，每次1 h)，用二甲苯透明3次，每次1 h，CP包埋劑整體定向包埋，旋轉(zhuǎn)切片機上制作連續(xù)額狀切片，片厚6 μm，裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，晾干備用。

切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，0.1 mol/L PBS (pH 7.4) 沖洗，用內(nèi)源性過氧化物酶室溫孵育10 min，再用0.1 mol/L PBS沖洗3次，兔抗PAH多克隆抗體 (0.1 mol/L PBS稀釋1∶100)室溫孵育3 h，繼而用生物素標記的二抗孵育10 min，PBS沖洗，最后用DAB顯色10 min。連接數(shù)字顯示的顯微鏡觀察拍照。用0.1 mol/L PBS和兔抗β-actin多克隆抗體代替兔抗PAH多克隆抗體同步進行上述免疫組織化學(xué)染色過程，作為陰性對照和陽性對照。

1.2.3RT-PCR核酸水平檢測沙蠶腦內(nèi)苯丙氨酸羥化酶

用Trizol試劑提取沙蠶腦總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA并以此為模板，β-actin引物為內(nèi)參進行RT-PCR檢測PAH，引物見表1。按照試劑盒的操作方法進行兩輪巢式PCR。反應(yīng)體系中包括cDNA模板1 μL、引物各2 μL、LA Tap酶0.5 μL、緩沖液5 μL等 (50 μL體系)，混勻離心后進行PCR擴增，首輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍后取1 μL作為第二輪PCR的模板。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，32個循環(huán)；4 ℃保存。以β-actin作為內(nèi)對照。

巢式PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖上電泳鑒定并拍照。按照膠回收試劑盒操作流程進行膠回收。T4 DNA連接酶1 μL、載體1 μL、膠回收產(chǎn)物16 μL、T4 DNA連接酶緩沖液2 μL (20 μL體系) 16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α，37 ℃孵育60 min，菌液涂于涂有IPTG和X-gal的氨芐青霉素抗性的LB平皿上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取大小均勻的白斑菌落培養(yǎng)，參照小劑量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，陽性克隆質(zhì)粒送交測序后進行Blast對比。

表1　RT-PCR引物序列Table 1　RT-PCR primer sequences

2　結(jié)果與分析

2.1Western blotting檢測苯丙氨酸羥化酶在沙蠶腦內(nèi)的表達

Western blotting結(jié)果表明，應(yīng)用兔抗PAH多克隆抗體能夠在日本刺沙蠶頭提取液中標記出一條明顯的分子量大約為52 kDa的條帶(圖1)，其結(jié)果與抗體使用說明書所表述的52 kDa標準分子量大小相一致。β-actin為陽性對照標記出一條44 kDa的條帶 (圖1)。結(jié)果表明苯丙氨酸羥化酶基因在日本刺沙蠶腦內(nèi)有相應(yīng)的蛋白表達產(chǎn)物存在，為進一步應(yīng)用免疫組化切片標記技術(shù)進行PAH的表達分布研究提供了依據(jù)和可能。

2.2免疫組化檢測苯丙氨酸羥化酶在沙蠶腦區(qū)的表達分布

低倍鏡下可以看出，在視野范圍內(nèi)日本刺沙蠶的腦區(qū)確實有被染色的褐色顆粒的存在，呈現(xiàn)出明顯、穩(wěn)定的PAH免疫組織化學(xué)陽性反應(yīng)，說明苯丙氨酸羥化酶在日本刺沙蠶腦內(nèi)有表達 (圖2A–2F)。陰性對照實驗無陽性染色胞體 (圖2G和圖2H)，陽性對照實驗顯示出明顯的陽性反應(yīng)結(jié)果 (圖2I和圖2J)。

圖1　苯丙氨酸羥化酶在沙蠶頭的蛋白表達Fig. 1　Western blotting analysis of the immunogenicity of phenylalanine hydroxylase and β-actin in the brain of ragworm Neathes japonica.

切片免疫組化染色實驗結(jié)果顯示這些PAH陽性神經(jīng)元在前腦和中腦均有表達，只是在前腦分布較集中，胞體小，分布較少；在中腦分布相對分散，胞體大，表達量較大；這些胞體均染色顯著，呈深褐色，在局部聚集成群。根據(jù)胞體在腦中的分布位置的不同，可以大體區(qū)分為3群。第一群主要集中在前腦區(qū)域，染色細胞主要分布在中腹側(cè)，胞體相對較小，大約包含40個神經(jīng)元胞體 (圖2A、2B)。第二群主要集中在一對后眼之間的中腦區(qū)域，染色細胞主要分布在兩側(cè)部，右側(cè)胞體較集中，大約包含15個神經(jīng)元胞體 (圖2B、2C)。第三群主要集中在中后腦區(qū)域，染色細胞在背方和兩側(cè)邊部均有分布，兩側(cè)分布相對較少，背方分布較多，但較分散，相對集中區(qū)域大約包含20個神經(jīng)元胞體 (圖2E、2F)。苯丙氨酸羥化酶主要存在于神經(jīng)元的細胞質(zhì)中，且這些神經(jīng)元細胞無突觸，沒有遠端的投射 (圖2B、2D、2F)。在整個腦區(qū)未見靜脈曲張狀纖維投射的存在。

圖2　沙蠶腦區(qū)免疫組化染色圖 (A、C、E、G、I 為20×，B、D、F、H、J為40×，A、B為前腦，C、D、E、F、G、H、I、J為中腦)Fig. 2　Immunolocalization of phenylalanine hydroxylase in the brain of ragworm Neanthes japonica. A, C, E, G, I is 20 times under a microscope; B, D, F, H, J is 40 times under a microscope, A, B is the forebrain, C, D, E, F, G, H, I, J is the midbrain. The arrow pointing in the direction of positive cells. A, B, C, D, E, F is the experimental group. G, H is the negative control group. I, J is the positive control group.

2.3RT-PCR檢測苯丙氨酸羥化酶在沙蠶腦中的存在

巢式PCR的第一輪產(chǎn)物可以增加目的模板的濃度，第二輪PCR產(chǎn)物的特異性更高，兩輪PCR之后的擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，由于是簡并性引物，電泳條帶會有多條，如圖3A所示，在750 bp和320 bp左右有兩條明亮的條帶，上面的條帶與預(yù)期的更相近，將大的條帶切下回收，T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，挑取4個大小均勻的白斑菌落，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定后電泳如圖3B所示，1號、3號和4號為陽性克隆，將1號、3號和4號送交測序。經(jīng)測序3號片段得到一段長度為757 bp帶有PolyA尾巴的一段cDNA序列，NCBI網(wǎng)站上Blast之后結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)此基因序列與櫛孔扇貝Azumaecten farreri PAH (GenBank登錄號AEE60803.1)具有71%的同源性，與白腹叢蚊Armigeres subalbatus PAH (GenBank登錄號AAT78350.1) 具有70%的同源性，與囊舌蟲Saccoqlossus kowalevskii PAH (GenBank登錄號NP_001161629.1) 具有70%的同源性，與家蠶Bombyx mori PAH (GenBank登錄號NP_001274766.1) 具有69%的同源性，與擬黑多刺蟻Polyrhachis vicina PAH (GenBank登錄號AFL02790.1) 具有65%的同源性，與大紅斑蝶Danaus plexippus PAH (GenBank登錄號EHJ64587.1) 具有66%的同源性。

圖3　沙蠶神經(jīng)索PAH的克隆Fig. 3　Clone of phenylalanine hydroxylase in the nerve cord of ragworm Neanthes japonica. (A) Electrophoresis images of PAH. (B) Identification of pHSG-PAH plasmid using restriction endonuclease digestion, 1, 3, and 4 were positive clone; 2 was negative clone; M: DL100 DNA ladder.

表2　測序片段Blast結(jié)果Table 2　Blast result of segment sequence

3　討論

歷經(jīng)漫長的選擇進化，PAH基因在脊椎動物乃至人類仍被保留。1983年Woo等[18]從人肝臟中成功克隆出了苯丙氨酸羥化酶基因，PAH在肝臟合成，定位于第12號染色體12q24.1，大約由1.5 Mb堿基組成，包含13個外顯子和12個內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄時剪切掉內(nèi)含子形成了僅包含1 353 bp外顯子的單鏈，即包含451個密碼子的可譯框，mRNA翻譯成451個氨基酸的酶單體，單體再聚合成有功能的PAH酶[19-20]。

目前對于芳香族氨基酸羥化酶的研究大多集中于高等生物，人類苯丙氨酸羥化酶基因的突變致人患苯丙酮酸尿癥[21]，動物體內(nèi)的苯丙氨酸羥化酶基因突變也導(dǎo)致了一系列的疾病，而目前對于低等生物苯丙氨酸羥化酶的研究則相對較少。在基因進化研究方面，低等生物中芳香族氨基酸羥化酶是否像哺乳動物一樣進行了功能基因的分化還是未知，尤其是苯丙氨酸羥化酶和色氨酸羥化酶基因是否也進行了相應(yīng)地分化，是在哪一進化中的低等生物物種中進行了分化，即分化的節(jié)點到底在哪兒，一直沒有定論。

實驗中對日本刺沙蠶體內(nèi)的PAH蛋白進行了免疫學(xué)標記，對pah基因進行了克隆。Western blotting實驗結(jié)果表明，在日本刺沙蠶體內(nèi)有明確的pah基因表達的蛋白存在。免疫組化實驗結(jié)果明確了其在蛋白水平的組織分布情況，在日本刺沙蠶腦內(nèi)PAH神經(jīng)元細胞內(nèi)，PAH充滿細胞液，細胞無投射，說明被合成的苯丙氨酸羥化酶在細胞液中使苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?，而不需要分泌到胞外到遠端去發(fā)揮作用。分布的這種差別，應(yīng)該與苯丙氨酸羥化酶所具有的相應(yīng)的功能有關(guān)，研究表明，苯丙氨酸羥化酶是生物體內(nèi)苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸的關(guān)鍵限速酶[22-24]，一旦此酶缺乏，苯丙氨酸就會在體內(nèi)堆積，酪氨酸量就會減少，進而影響酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴胺或酪胺的量[25-26]，引起一系列的連環(huán)反應(yīng)，即影響多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素這些兒茶酚胺[27]類神經(jīng)遞質(zhì)的功能，或影響酪胺和章魚胺的功能，這些單胺類神經(jīng)遞質(zhì)都是以苯丙氨酸和酪氨酸為前體物質(zhì)合成的，若以苯丙氨酸為前體物質(zhì)，則PAH的存在顯得尤為重要。從分布來看，有PAH神經(jīng)元細胞分布的腦區(qū)域可能與兒茶酚胺、酪胺和章魚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成相關(guān)，具體在沙蠶體內(nèi)會引起什么樣的變化還有待下一步通過對酪氨酸羥化酶及相應(yīng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在沙蠶腦內(nèi)的存在及分布模式的研究去進行深入地討論。

應(yīng)用分子克隆技術(shù)克隆出了PAH的一段757 bp帶有PolyA尾巴的cDNA序列，NCBI網(wǎng)站上Blast結(jié)果與多個物種PAH高度的同源性，從核酸水平上證明了在日本刺沙蠶腦中確有獨立的PAH的存在。

綜上所述，低等的環(huán)節(jié)動物日本刺沙蠶腦內(nèi)存在獨立的苯丙氨酸羥化酶，在蛋白質(zhì)水平和核酸水平上為芳香族氨基酸羥化酶中苯丙氨酸羥化酶和色氨酸羥化酶的基因分化提供了證據(jù)，為兩種羥化酶基因的分化節(jié)點在已有的節(jié)肢動物門基礎(chǔ)上向前推進到環(huán)節(jié)動物門提供了依據(jù)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

生物育種與工藝優(yōu)化

The expression of phenylalanine hydroxylase in the brain of ragworm Neanthes japonica (Polychaeta, Annelida)

Guimin Ren1, Zhe Dong1, Chao Liu2, Yimeng Liu2, Zhidong Luan2, Qi Liu3, Xuexiang Bao3, and Shun Wang1
1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning, China 2 Department of Developmental Biology, School of Basic Medical Sciences, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning, China 3 Laboratory of Insect Brain Biology, Northeast Normal University, Changchun 130024, Jilin, China

Abstract:Phenylalanine hydroxylase (PAH) is a member of aromatic amino acid hydroxylase (AAAHs) family, and catalyze phenylalanine (Phe) into tyrosine (Tyr). Using immunological and RT-PCR methods to prove the existence of phenylalanine hydroxylase (PAH) gene in the brain of Neanthes japonica in protein and nucleic acid level. Using Western blotting to detect the pah immunogenicity of Neanthes japonica. Making paraffin sections and using immunohistochemical technique to identify the presence and distribution of the phenylalanine hydroxylase gene in the brain of Neanthes japonica. Clone pah gene from the brain of Neanthes japonica by RT-PCR, constructing plasmid and transferring into E. coli to amplification, picking a single homogeneous colony, double digesting then making sequence and comparing homology. Western blotting results showed that the expression of the protein is present in Neanthes japonica brain, immunohistochemistry technique results showed that phenylalanine hydroxylase mainly expressed in abdominal of forebrain, dorsal and sides of midbrain. RT-PCR technique results showed that the phenylalanine hydroxylase exist in the brain of Neanthes japonica and has a high homology with others animals. PAH is present in the lower organisms Neanthes japonica, in protein and nucleic acid level. Which provide the foundation for further study the evolution of aromatic amino acid hydroxylase genes in invertebrate.

Keywords:Neanthes japonica, phenylalanine hydroxylase, immunohistochemistry, RT-PCR

DOI:10.13345/j.cjb.150550

Corresponding author:Shun Wang. Tel: +86-416-4673253; E-mail: 284476696@qq.com