LC-MS對(duì)奧馬珠單抗與其生物類似物CMAB007的分析與結(jié)構(gòu)特征

徐珺，張大鵬，王皓，郭懷祖

1 上海張江生物技術(shù)有限公司，上?！?01203 2 抗體藥物與靶向治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上?！?01203 3 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上?！?00433

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LC-MS對(duì)奧馬珠單抗與其生物類似物CMAB007的分析與結(jié)構(gòu)特征

徐珺1,3，張大鵬1,2，王皓1,2，郭懷祖1,2

1 上海張江生物技術(shù)有限公司，上海201203 2 抗體藥物與靶向治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203 3 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海200433

俆俆, 張大鵬, 王皓, 等. LC-MS對(duì)奧馬珠單抗與其生物類似物CMAB007的分析與結(jié)構(gòu)特征. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(4): 497–506.

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摘要:哮喘是當(dāng)今世界威脅公共健康的最主要的慢性肺部疾病，作為治療中重度和難治性哮喘的特效藥奧馬珠單抗治療費(fèi)用相對(duì)昂貴，生物類似藥CMAB007的研制可以降低治療費(fèi)用。本研究用質(zhì)譜分析一種奧馬珠單抗生物類似藥CMAB007與原研藥的一致性，分別從氨基酸分析、肽圖、N/C端序列，還原質(zhì)譜，寡糖含量，N 糖分析等層面對(duì)CMAB007和奧馬珠單抗進(jìn)行了系統(tǒng)的比對(duì)研究，為進(jìn)一步臨床研究打下基礎(chǔ)。結(jié)果表明CMAB007和奧馬珠單抗氨基酸序列一致，賴氨酸剪切也基本一致，帶唾液酸修飾糖形和帶核心巖藻糖形比例相近，高甘露糖形比例差異不大，CMAB007略低于奧馬珠單抗。因此CMAB007滿足生物類似藥在結(jié)構(gòu)比對(duì)上一致性的要求，有望成為國(guó)內(nèi)首先上市的重組抗人IgE單克隆抗體藥物。

關(guān)鍵詞:單克隆抗體，奧馬珠單抗，哮喘，液質(zhì)聯(lián)用，生物類似藥

Received: July 24, 2015; Accepted: September 28, 2015

Supported b y: National Science and Technology Major Projects for "Major New Drugs Innovation and Development"(No. 20132X09401303), Shanghai Key Technologies R&D Program of Biological Medicine (No. 15431906100).

奧馬珠單抗是由基因泰克、諾華和Tanox公司聯(lián)合開發(fā)的一種人源化抗IgE單克隆抗體，可干擾IgE與肥大細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞的FcεRI受體結(jié)合[1-2]，從而抑制肥大細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞的活化，減少組胺、蛋白水解酶、前列腺素、白細(xì)胞三烯、血小板激活因子、緩激肽等炎癥介質(zhì)的呈遞[3]，從而治療特異性IgE水平增高引起的哮喘[4-5]。該藥物2003年獲美國(guó)FDA許可在上市，用于治療中重度持續(xù)性哮喘。2014年增加了新適應(yīng)癥H1抗組胺劑治療應(yīng)答不充分的成人和青少年 (12歲及以上) 慢性自發(fā)性蕁麻疹患者的輔助治療[6]。奧馬珠單抗2013年全球銷量達(dá)到14.65億美元。根據(jù)國(guó)外兩項(xiàng)研究對(duì)其經(jīng)濟(jì)效益的評(píng)估來看，奧馬珠單抗的主要缺點(diǎn)就是費(fèi)用較高[7]，其高昂的價(jià)格使這一藥物在臨床中的應(yīng)用受到了一定的限制。為此，我們開發(fā)1種奧馬珠單抗生物類似藥CMAB007[8]，以降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9]。

近年來，單克隆抗體藥物憑借其高特異性、有效性和安全性，在臨床和商業(yè)上取得了巨大的成功。2011年全球銷售額前30的單克隆抗體藥物總銷售額達(dá)到1 100億美元[10]?？贵w藥物通常具有5.6?150 kDa的分子量，不同的生產(chǎn)工藝在生產(chǎn)這些復(fù)雜的生物大分子時(shí)必然會(huì)產(chǎn)生不完全相同的產(chǎn)品[11]；正是由于抗體藥物的高分子質(zhì)量和異質(zhì)性，它的生產(chǎn)過程中的微小變化也會(huì)導(dǎo)致它的三維結(jié)構(gòu)、酸性變異體比例和糖基化種類及比例等改變[12]。生物類似藥，作為與原研藥物在質(zhì)量屬性、安全性和有效性上具有相似性的藥物，能加快藥物的審批及在臨床治療中替代原研藥，極大地促進(jìn)了藥物開發(fā)進(jìn)程及降低患者的治療費(fèi)用[13-14]。因此，開發(fā)生物類似藥，成為降低重組蛋白藥物用藥成本，提高藥物可及性的必然選擇，F(xiàn)DA、EMA、CFDA等各國(guó)藥品監(jiān)管部門都出臺(tái)了生物類似藥的指導(dǎo)原則。

歐盟認(rèn)為生物仿制藥是原研藥物的一個(gè)拷貝，需要在物理化學(xué)性質(zhì)、藥物效果以及藥物安全性上做充分的可比性研究，以證明他們的相似性[10]。CFDA發(fā)布了《生物類似藥研發(fā)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則 (試行)》 (以下簡(jiǎn)稱《指導(dǎo)原則》)，首次對(duì)明確了我國(guó)藥品監(jiān)管部門對(duì)生物類似藥 (Biosimilar) 定義，注冊(cè)分類，以及其藥學(xué)、非臨床，臨床研究與評(píng)價(jià)中應(yīng)遵循的基本原則。為我國(guó)的生物類似藥開發(fā)指明了研究方向。

從歐盟批準(zhǔn)的第一個(gè)生物類似藥Remisima?(CT-P13)[15]的公眾評(píng)估報(bào)告 (EPAR The Erasmus PhD Association Rotterdam) 以及我國(guó)的《指導(dǎo)原則》里對(duì)生物類似藥對(duì)比的要求，生物類似藥需要和原研藥進(jìn)行理化鑒定，包括采用適宜的分析方法確定一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu) (二級(jí)/三級(jí)/四級(jí)) 以及其他理化特性。還考慮翻譯后的修飾可能存在差異，如氨基酸序列N端和C端的異質(zhì)性、糖基化修飾 (包括糖鏈的結(jié)構(gòu)和糖型等) 的異同。為此我們采用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜 (LC-ESI-Q-Tof) 技術(shù)，從不同水平對(duì)CMAB007及Omalizumab進(jìn)行了生物類似性的研究。

1　材料與方法

1.1材料

乙酸 (HAc)、甲醇 (MeOH) 和乙腈(ACN)：Fisher Scientific公司，MS級(jí)；碘化鈉(NaI)、血纖肽(GFP)：購自Sigma公司，純度≥90%；甲酸(FA)，F(xiàn)luka公司，MS級(jí)；碳酸氫銨(NH4HCO3)，國(guó)藥化學(xué)試劑，分析純；二硫蘇糖醇 (DTT)，購自Sigma公司；超純水 (18.2 M?)，取自Millipore公司Milli-Q系統(tǒng)；PVDF 0.45 um針頭式濾器，購自Agela公司。重組N-糖苷酶(PNGaseF)：上海張江生物技術(shù)有限公司；重組胰蛋白酶：上海張江生物技術(shù)有限公司；CMAB007：新型重組抗IgE人源化單克隆抗體，抗體藥物與靶向治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制；對(duì)照品：Omalizumab (Xolair?)，諾華。

1.2儀器設(shè)備

AKTA Purifier純化儀：GE公司；串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀Xevo G2-S QTof：Waters 公司；數(shù)據(jù)分析軟件，Biopharmalynx 1.3.3：Waters公司；超高效液相色譜層析系統(tǒng)，Acquity UPLC H-Class Bio 系統(tǒng)：Waters 公司；4 ℃冷藏冰箱及–20 ℃低溫冰箱：SANYO公司；–80 ℃超低溫冰箱：SANYO公司；超純水，milli-Q系統(tǒng)：Millipore公司產(chǎn)品；凍干機(jī)：Christ公司；恒溫金屬?。篢hermo公司。

1.3方法

1.3.1單抗完整蛋白以及單抗經(jīng)還原后的輕鏈、重鏈分析

用超純水將兩個(gè)樣品稀釋到1 mg/mL，離心后存于4 ℃冰箱待用。輕、重鏈樣品使用1 mol/L DTT處理后待用。單抗完整蛋白及輕重鏈的反相分離在同一根MassPREP Desalting Column 2.1 mm×5 mm色譜柱上進(jìn)行。流動(dòng)相A 10%乙腈+1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 50%甲醇+50%水溶液，流動(dòng)相C乙腈，流動(dòng)相D超純水。流速為0.4 mL/min，柱溫保持在80 ℃。質(zhì)譜分析在電噴霧正離子模式下進(jìn)行，脫溶劑氣體溫度和源溫度分別設(shè)定為450 ℃和120 ℃。毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別設(shè)定為3 000 V和40 V。使用Biopharmalynx 1.3.3 (沃特世公司) 對(duì)完整蛋白及抗體輕重鏈的ESI質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積化處理。

1.3.2肽圖分析

將兩個(gè)蛋白樣品分別用8 mol/L鹽酸胍+5 mmol/L EDTA+0.5 mol/L Tris (pH 8.3) 的變性液混勻處理后用 1 mol/L DTT調(diào)節(jié)到濃度為60 mmol/L (37 ℃，孵育60 min)。然后加入2.9 mol/L碘乙酸鈉，避光孵育45 min，加入1 mol/L 的DTT溶液終止反應(yīng)。將上述樣品脫鹽到50 mmol/L NH4HCO3(使用G25脫鹽柱)，加入胰蛋白酶 (酶/底物的比例為：1∶50 (W/W))，振蕩混勻后水浴 (37 ℃) 孵育4 h后使用甲酸終止反應(yīng)，并調(diào)節(jié)樣品pH 3。液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定肽圖。液相條件：0–60 min，流動(dòng)相A 10%乙腈+1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 50%甲醇+50%水溶液，流動(dòng)相C乙腈，流動(dòng)相D超純水。流速為0.2 mL/min，柱溫保持在45 ℃。質(zhì)譜掃描范圍(m/z)：100–3 000，其余同“單抗輕、重鏈分析”。

1.3.3糖基化修飾分析

取兩個(gè)蛋白樣品0.5 mg，用30 kDa超濾管超濾濃縮，置換緩沖液，緩沖液為50 mmol/L 碳酸氫銨 (pH 8.0)，濃縮后按蛋白：酶為50∶1加入PNGaseF，酶切體系為100 μL，37 ℃孵育24 h。使用HILIC固相萃取柱脫去溶液中的蛋白和鹽，真空離心凍干。將凍干好的樣品溶解在30%醋酸+70% DMSO反應(yīng)體系中，并加入2-AB至終濃度50 mg/mL，氰基硼氫化鈉至終濃度60 mg/mL，65 ℃避光干浴5 h。最后，再使用HILIC固相萃取柱除掉樣品中多余的標(biāo)記物，ACQUITY UPLC BEH300 GLycan 1.7 μm 2.1 mm×150 mm柱后質(zhì)譜分析。液相條件：0–40 min，流動(dòng)相B 30 mmol/L 甲酸銨，pH 4.5–5.0，流動(dòng)相C乙腈。流速為0.4 mL/min，柱溫保持在60 ℃。質(zhì)譜掃描范圍(m/z)：100–3 000，其余同“單抗輕、重鏈分析”。

2　結(jié)果與分析

2.1單抗完整蛋白質(zhì)譜分析

圖1　奧馬珠單抗 (上) 和CMAB007 (下) 完整蛋白去卷積處理圖譜Fig. 1　Deconvoluted mass spectrum of intact Omalizumab (up) and CMAB007 (down).

抗體分子的結(jié)構(gòu)是抗體藥物重要屬性，而氨基酸序列是抗體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，《指導(dǎo)原則》中也要求生物類似藥和原研藥進(jìn)行頭對(duì)頭的對(duì)比分析[16]。我們選用本單位制備的重組抗IgE單克隆抗體 (CMAB007) 以及市面上購買的奧馬珠單抗進(jìn)行對(duì)比分析，進(jìn)行去卷積處理后的質(zhì)譜原圖如下 (圖1)，奧馬珠單抗和CMAB007單抗四個(gè)高豐度糖型異質(zhì)體對(duì)比下來差別都在2?3 Da之間，兩者基本沒有差別，在質(zhì)譜檢測(cè)的誤差范圍內(nèi)，說明我們的抗體和原研抗體具有相同的氨基酸序列理論分子量，糖型分布的豐度差別主要是由于糖的修飾比例有些許差別。

2.2單抗經(jīng)DTT還原后的輕鏈、重鏈分析

單抗經(jīng)過DTT還原后，打開二硫鍵，解鏈為輕鏈和重鏈片段，再經(jīng)過質(zhì)譜分析得到輕重鏈去卷積質(zhì)譜圖，圖2是兩個(gè)抗體輕鏈的質(zhì)譜對(duì)比圖，可以看出CMAB007與奧馬珠單抗是完全一致的。

兩個(gè)抗體重鏈的質(zhì)譜圖上可以看出兩個(gè)主峰質(zhì)量數(shù)分別為50 694 Da和50 856 Da，相差162 Da正好符合不同糖型間由于半乳糖殘基的差異造成的質(zhì)量數(shù)差異，也符合G0F和G1F糖型修飾的重鏈分子量。再加上51 018 Da這個(gè)峰的質(zhì)量數(shù)也符合G2F的重鏈分子量，這里兩個(gè)單抗的差異很小，差別也只是在糖型修飾所占比例上。

使用Biopharmalynx 1.3.3軟件分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，兩種單抗在轉(zhuǎn)錄后修飾的過程中都發(fā)生了比較完全的C端賴氨酸切除，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，末端賴氨酸的截除并不影響抗原和抗體的結(jié)合、FC片段介導(dǎo)的功能、抗體的半衰期以及其他生物學(xué)作用[17]，所以這個(gè)差異不會(huì)引起抗體功能的改變。

圖2　奧馬珠單抗 (上) 和CMAB007 (下) 輕鏈去卷積處理圖譜Fig. 2　Deconvoluted mass spectrum of the light chain of Omalizumab (up) and CMAB007 (down).

圖3　奧馬珠單抗 (上) 和CMAB007 (下) 重鏈去卷積處理圖譜Fig. 3　Deconvoluted mass spectrum of the heavy chain of Omalizumab (up) and CMAB007 (down).

2.3肽圖分析

這里我們用胰蛋白酶對(duì)兩個(gè)單抗進(jìn)行酶切，反相C18柱進(jìn)行極性差異洗脫分離，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測(cè)一級(jí)和二級(jí)信息，再使用Biopharmalynx 1.3.3軟件進(jìn)行分析。CMAB單抗和奧馬珠單抗的質(zhì)量肽圖譜總離子流圖見圖4和圖5，兩個(gè)單抗的肽圖峰形及出峰時(shí)間相似。

1) 質(zhì)量肽圖覆蓋率

我們把每個(gè)肽段和理論酶切肽段進(jìn)行對(duì)比，得到能在質(zhì)譜中找到理論分子量的肽段覆蓋率，CMAB007的質(zhì)譜肽圖覆蓋率輕、重鏈分別是100%和100%，奧馬珠單抗輕、重鏈的覆蓋率分別是100%和99%。兩個(gè)單抗覆蓋率差別不大，而且覆蓋較全。

2) N-端氨基酸序列分析

輕鏈N-端第一個(gè)肽段理論序列是DIQLTQ SPSSLSASVGDR，共18個(gè)氨基酸，CMAB007單抗和奧馬珠單抗輕鏈的N-端氨基酸序列的質(zhì)量數(shù)分別是1 860.936 Da和1 860.932 Da與理論質(zhì)量數(shù)1 860.930 Da一致。

圖4　CMAB007質(zhì)量肽圖譜TIC圖Fig. 4　Total ion chromatogram of CMAB007 peptide mapping.

圖5　奧馬珠單抗質(zhì)量肽圖譜TIC圖Fig. 5　Total ion chromatogram of Omalizumab peptide mapping.

重鏈N-端第一個(gè)肽段理論序列是EVQLVE SGGGLVQPGGSLR，共19個(gè)氨基酸，CMAB007單抗和奧馬珠單抗重鏈的N-端氨基酸序列的質(zhì)量數(shù)分別是1 882.006 Da和1 882.007 Da與理論質(zhì)量數(shù)1 882.003 Da一致。

3) C-端賴氨酸修飾分析

重鏈C-端的賴氨酸在抗體表達(dá)的翻譯后修飾階段會(huì)被羧肽酶部分切除，這里我們根據(jù)質(zhì)譜圖譜對(duì)此翻譯后修飾的比例進(jìn)行了粗略估算，結(jié)果顯示CMAB007單抗的賴氨酸剪切比例是93.3%，而奧馬珠單抗的比例是93.5%。此結(jié)果說明兩種單抗在翻譯后修飾的過程中均發(fā)生了較為完全的賴氨酸剪切，而且兩者的剪切比例也比較類似。

2.4游離寡糖分析

單克隆抗體是高度復(fù)雜的糖蛋白，由各種多肽結(jié)構(gòu)域組成，其中一些存在糖基化。這些結(jié)構(gòu)域組織在一起形成兩種類型的功能區(qū)-Fab 和Fc，它們?cè)谥委熤邪l(fā)揮著各自不同的功能性作用，而其中的聚糖則可以調(diào)整或者協(xié)調(diào)這些活性的強(qiáng)度[18]；單克隆抗體的各種作用模式包括對(duì)靶物質(zhì)的中和作用，補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用 (CDC) 以及抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 (ADCC)。ADCC和CDC作用機(jī)制在治療腫瘤的抗體藥物研發(fā)過程中有著非常重要的意義[19]，但由于正常細(xì)胞也表達(dá)靶標(biāo)抗原，因此這兩種效應(yīng)對(duì)正常組織細(xì)胞也有一定傷害力，往往引起體內(nèi)的不良反應(yīng)。特別是CDC作用目前已被證實(shí)與某些不良反應(yīng)相關(guān)。

目前對(duì)抗體糖型研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過增加半乳糖基化水平 (Galactosylation)，可顯著提高IgG1型單抗的CDC活性；通過降低巖藻糖基化水平 (Fucosylation)，則可大大增加IgG1型單抗的ADCC活性。此外，含更多高甘露糖型(Man5、Man6、Man7) 的IgG1型抗體在體內(nèi)的清除速度增加。因此采用抗體糖基化工程技術(shù)，在減少半乳糖基化水平的同時(shí)增加巖藻糖基化水平 (即提高G0F的總比例)，將有助于降低ADCC和CDC效應(yīng)，從而減少體內(nèi)的不良反應(yīng)；同時(shí)減少高甘露糖含量，從而減緩抗體的體內(nèi)清除速率，延長(zhǎng)抗體的半衰期[20]。

從圖6和圖7 CMAB007單抗和奧馬珠單抗的主要糖形2-AB熒光色譜圖中可以看出，兩種單抗的糖形分布基本一致，均符合CHO細(xì)胞表達(dá)單克隆抗體的糖形分布特征：以G0F、G1F糖形為主，有部分去巖藻糖的糖形，以及少量末端唾液酸化的糖形和高甘露糖糖形。CMAB007單抗和奧馬珠單抗帶核心巖藻糖糖形的比例分別為約81.09%和約89.99%，帶唾液酸修飾糖形的比例分別為約0.38%和約0.60%，這些比例都基本一致。CMAB007和奧馬珠單抗的高甘露糖形比例分別為約2.92%和約4.23%(高甘露糖形的比例我們只統(tǒng)計(jì)積分含量在0.1%以上的Man5和Man6)。這里CMAB007更少的高甘露糖形比例有可能延長(zhǎng)抗體的半衰期。

圖6　CMAB007游離寡糖熒光檢測(cè)FLR積分圖 (積分含量在0.1%以上)Fig. 6　Fluorescence chromatogram of released free glycans from CMAB007 (content above 0.1%).

圖7　奧馬珠單抗游離寡糖熒光檢測(cè)FLR積分圖 (積分含量在0.1%以上)Fig. 7　Fluorescence chromatogram of released free glycans from Omalizumab (content above 0.1%).

3　結(jié)論

在本研究中，我們通過超高壓液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜 (LC-ESI-Q-Tof) 技術(shù)從不同水平對(duì)重組抗IgE人源化單抗和奧馬珠單抗的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)的分析鑒定，在各個(gè)水平上對(duì)兩個(gè)單抗進(jìn)行了對(duì)比分析。在完整蛋白水平的質(zhì)譜數(shù)據(jù)上看，CMAB007和原研單抗糖形分布基本一致。還原狀態(tài)下，輕鏈部分沒有N-端糖基化，重鏈部分不同的糖修飾也基本相同。不管是從兩個(gè)抗體的質(zhì)量肽圖覆蓋率還是C-端賴氨酸切除比例來看，兩種單抗的差異都很小。在游離寡糖的質(zhì)譜分析中，CMAB007高甘露糖形比例較低，其他糖形比例則差異不大。綜合所有的表征分析指標(biāo)來看，單抗CMAB007具有與Omalizumab一致的一級(jí)序列，糖基化方式與程度與奧馬珠類似，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與臨床研究均證實(shí)了其高度類似性 (數(shù)據(jù)未列出)，質(zhì)量與活性也與原研藥基本類似。有望成為國(guó)內(nèi)最先上市的抗IgE生物類似藥。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

生物技術(shù)與方法

Structural characterization and analysis of Omalizumab and its biosimilar CMAB007 by LC-MS

Jun Xu1,3, Dapeng Zhang1,2, Hao Wang1,2, and Huaizu Guo1,2
1 Shanghai Zhangjiang Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 201203, China 2 State Key Laboratory of Antibody Medicine and Targeted Therapy, Shanghai 201203, China 3 School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China

Abstract:We compared the similarity of Omalizumab (Xolair; a humanized anti-immunoglobulin E monoclonal antibody) and it’s biosimilar CMAB007. An in depth characterization of a candidate biosimilar was carried out using a systematic approach, the approach provides a set of routine tools that combine accurate intact mass measurement, peptide mapping, and released glycan profiling. CMAB007 and Omalizumab had the same primary structure and exhibited almost the same content of C-terminal lysine variants. The types of detected free oligosaccharides were very similar, such as sialylation, fucosylation and high mannose types. CMAB007 could be considered as a highly similar molecular to Omalizumab and expected to be the first humanized anti-immunoglobulin E monoclonal antibody drug in China.

Keywords:monoclonal antibody, Omalizumab, asthma, liquid chromatography mass spectrometry, biosimilar

DOI:10.13345/j.cjb.150339

Corresponding author:Huaizu Guo. Tel: +86-21-60129255; Fax: +86-21-60129270; E-mail: guohuaizu@163.com