產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶的異源表達(dá)及粗酶性質(zhì)

李乃強(qiáng)，于麗珺，徐巖

1 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫　214122 2 上海凱賽生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司，上?！?01203

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產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶的異源表達(dá)及粗酶性質(zhì)

李乃強(qiáng)1,2，于麗珺2，徐巖1

1 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122 2 上海凱賽生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司，上海201203

李乃強(qiáng), 于麗珺, 徐巖. 產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶的異源表達(dá)及粗酶性質(zhì). 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(4): 537–531.

Li NQ, Yu LJ, Xu Y. Heterologous expression and characterization of Klebsiella oxytoca lysine decarboxylase. Chin J Biotech, 2016, 32(4): 527–531.

摘要:賴氨酸脫羧酶，可以催化賴氨酸脫羧生成戊二胺。戊二胺是重要的平臺(tái)化合物，可以合成新型聚酰胺材料、脂肪族異氰酸酯等新材料。本研究對來自于產(chǎn)酸克雷伯氏菌的賴氨酸脫羧酶進(jìn)行異源表達(dá)。以pUC18質(zhì)粒為載體，將來源于產(chǎn)酸克雷伯氏菌的賴氨酸脫羧酶基因ldc克隆到大腸桿菌，得到菌株LN18。在添加0.5 mmol/L IPTG的LB培養(yǎng)基中，對LN18進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵液酶活可達(dá)到35 U/g發(fā)酵液，從發(fā)酵液制備的賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白的酶活可以達(dá)到30 000 U/g粗蛋白。產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧粗酶蛋白大小約80 kDa，粗酶的最適溫度和pH值分別為55 ℃和5.5，與文獻(xiàn)中報(bào)道的大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶CadA在pH 8.0幾乎沒有酶活不同，產(chǎn)酸克雷伯氏菌的賴氨酸脫羧酶在pH 8.0的酶活達(dá)到最優(yōu)pH下酶活的30%以上。金屬離子對酶活有一定的影響，Mg2+對酶活有促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+、Zn2+、Ca2+有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞:賴氨酸脫羧酶，產(chǎn)酸克雷伯氏菌，戊二胺，異源表達(dá)，pH穩(wěn)定性

Received: August 28, 2015; Accepted: October 25, 2015

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA02A204-04).

Yan Xu. Tel: +86-531-88369463; Fax: +86-531-88567250; E-mail: yxu@jiangnan.edu.cn

一些學(xué)者如Gale和Epps等在20世紀(jì)40年代就研究了賴氨酸脫羧酶，其主要用途被用來定量分析賴氨酸的含量[1]。隨著人們對賴氨酸脫羧酶的認(rèn)識(shí)的提高，在越來越多的生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有賴氨酸脫羧酶的存在，如在大腸桿菌Escherichia coli、尸桿菌Bacterium cadaveris、蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei、產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca等微生物中存在賴氨酸脫羧酶[2-4]。文獻(xiàn)中研究比較廣泛的是大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶，大腸桿菌中存在兩種類型的賴氨酸脫羧酶。一種是在低pH環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生的賴氨酸脫羧酶，其編碼基因?yàn)閏adA[5]，另外一種是組成型的，其編碼基因?yàn)閘dcC[6-7]。Krithika等[8]研究了來自大腸桿菌的兩種賴氨酸脫羧酶CadA和Ldc的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及它們的酶學(xué)性質(zhì)。

賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧得到的戊二胺是一種重要的平臺(tái)化合物，可以合成新型聚酰胺、新型異氰酸酯和哌啶、吡啶等重要化合物。特別是用戊二胺合成的新型聚酰胺，由于其結(jié)晶度、結(jié)晶結(jié)構(gòu)的不同以及內(nèi)部官能團(tuán)被氫鍵飽和的程度不同從而具備新的特性。如聚酰胺56具備阻燃性好、流動(dòng)性好等特點(diǎn)，這些新的特點(diǎn)都為下游的材料提供了新的性能。

生物法合成戊二胺主要有兩條途徑，一種是以葡萄糖為原料，通過微生物發(fā)酵來直接合成戊二胺，其代謝途徑復(fù)雜，得到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率低，生成的戊二胺對微生物有毒害作用。如在菌株谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032過量表達(dá)來源于E. coli的 cadA 基因得到菌株 TM45。TM45可以用50 g/L的葡萄糖生產(chǎn)2.6 g/L的戊二胺[9]。如Qian[10]等通過引入強(qiáng)啟動(dòng)子過表達(dá)賴氨酸脫羧酶、敲除代謝戊二胺的相關(guān)基因等構(gòu)建的大腸桿菌XQ56能產(chǎn)9.6 g/L戊二胺。Kind等[11-13]通過代謝工程系統(tǒng)改造，包括目的基因的啟動(dòng)子、密碼子優(yōu)化、刪除副產(chǎn)物乙酰戊二胺的相關(guān)酶系、提高重組菌分泌戊二胺的能力等。這些改進(jìn)將葡萄糖到戊二胺的轉(zhuǎn)化率提高到17%。另外一條途徑是以賴氨酸為底物，用賴氨酸脫羧酶來催化生成戊二胺，該工藝路徑短、產(chǎn)物單一，但是催化效率需要進(jìn)一步提高，而且由于賴氨酸的價(jià)格不菲，限制了生物法戊二胺的產(chǎn)業(yè)化。生物法制備戊二胺隨著戊二胺濃度的累積，反應(yīng)液的pH不斷上升使得酶活大大降低。Usheer K和 Irina Gutsche等[14]研究表明隨著pH上升，大腸桿菌賴氨酸脫羧酶CadA由十聚體逐步解離成二聚體而喪失酶活。而為了維持酶活，就需要添加大量的pH緩沖試劑，這對后續(xù)的純化和產(chǎn)品質(zhì)量帶來影響。因此尋求不同于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶，發(fā)掘新來源的賴氨酸脫羧酶的新功能，解決上述瓶頸問題，是生物法合成戊二胺的一個(gè)重要方向。

本文主要通過擴(kuò)增來源于產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca的賴氨酸脫羧酶基因，將該基因在E. coli進(jìn)行異源表達(dá)，將重組菌進(jìn)行培養(yǎng)產(chǎn)酶，并對重組菌的賴氨酸脫羧酶進(jìn)行純化，研究其相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)。選擇產(chǎn)酸克雷伯氏菌的主要原因是產(chǎn)酸克雷伯氏菌在食物中廣泛存在，并且產(chǎn)酸克雷伯氏菌有較高的賴氨酸脫羧酶活力，能夠累積一定量的戊二胺[15]。在后續(xù)的研究過程中，作者嘗試了目的基因的密碼子優(yōu)化以及RBS優(yōu)化 (核糖體結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)化)，證明了密碼子優(yōu)化和RBS優(yōu)化都是目的基因提高表達(dá)效率的有效手段。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1引物

本研究所用引物見表1。

表1　本研究所用引物Table 1　Primers in this study

1.1.2主要試劑

瓊脂粉、氯化鈉、酵母粉和蛋白胨等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR試劑盒、內(nèi)切酶SacⅠ、內(nèi)切酶XbaⅠ、內(nèi)切酶EcoRⅠ、連接酶、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖、電轉(zhuǎn)杯等購自上海生工生物工程有限公司。DNA回收試劑盒購自寶生物工程(大連) 有限公司，PCR引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。除非特殊說明，采用的試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1ld c基因的克隆與測序

產(chǎn)酸克雷伯氏菌全基因組購買于DSMZ (DSMZ6673)，以其為模板，根據(jù)GenBank Accession No. CP003683.1來設(shè)計(jì)ldc基因的擴(kuò)增引物為KOldc-F和KOldc-R。設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min ，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得片段膠回收后與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，挑取陽性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切鑒定，并將重組質(zhì)粒命名為pMD18-KOldc，并測序 (測序工作由上海生工完成)。

1.2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

用SacⅠ和XbaⅠ分別酶切pMD18-KOldc和pUC18質(zhì)粒，回收KOldc基因片段和pUC18線性片段后進(jìn)行連接，所得質(zhì)粒命名為pUC18-KOldc。用內(nèi)切酶對pUC18-KOldc進(jìn)行酶切，凝膠電泳驗(yàn)證酶切片段大小，將大小正確的pUC18-KOldc質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化E. coli MG1655 K12感受態(tài)細(xì)胞，得到含有pUC18-KOldc質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞，命名為菌株LN18。

1.2.3重組菌培養(yǎng)

挑取在氨芐青霉素抗性LB平板培養(yǎng)基上的LN18單菌落轉(zhuǎn)接到液體LB培養(yǎng)基中，加入氨芐青霉素鈉至終濃度為100 mg/L，在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)15 h后至OD560達(dá)到5時(shí)，按照1%的比例轉(zhuǎn)接至裝發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基同搖瓶培養(yǎng)基，IPTG的濃度為0.5 mmol/L，37 ℃、200 r/min的攪拌條件下培養(yǎng)過夜，發(fā)酵液的酶活可以達(dá)到35 U/g發(fā)酵液。

1.2.4賴氨酸脫羧酶粗酶制備和SDS-PAGE

所有的純化步驟均在4 ℃下進(jìn)行，緩沖液使用100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 (pH 6.0)。將LN18發(fā)酵液進(jìn)行離心收集，將收集的細(xì)胞懸浮于緩沖液中，使用超聲波振蕩器（HM2412, Honda Electronics Co. Ltd. Toyohashi, Japan）進(jìn)行細(xì)胞破碎。細(xì)胞碎片通過離心去除。離心條件為4 ℃、15 000 r/min離心15 min，上清液為無細(xì)胞提取液。取40 mL無細(xì)胞提取液加入到40%飽和硫酸銨溶液中，在冰上攪拌4 h。然后于17 000 r/min離心20 min。將離心后的不溶物收集，將其溶解在100 mmol/L磷酸鈉緩沖液中，冷凍干燥后存放于–20 ℃冰箱內(nèi)，制備得到賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白。對粗酶蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，分析蛋白的分子量，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.5賴氨酸脫羧酶酶活測定方法

在500 mL三角瓶中加入pH值為5.5的5%的賴氨酸鹽酸鹽溶液100 g，加入5’-磷酸吡哆醛至終濃度為0.1 mmol/L，最后加入上述1.2.4制備的賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白，37 ℃、170 r/min振蕩反應(yīng)10 min，沸水浴終止反應(yīng)，反應(yīng)液測定戊二胺含量，以每分鐘1 g賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白催化產(chǎn)生1 μmol的戊二胺定義為一個(gè)酶活單位，即1 U。

1.2.6戊二胺測定方法

利用核磁共振一維氫譜來定量分析酶反應(yīng)液中的戊二胺。取定量的樣品和含有定量內(nèi)標(biāo)和重水溶液混合。采用的儀器為Bruker 400 Ultrashield Plus NMR核磁共振儀，程序?yàn)镕ID 65536，掃描數(shù)為16，脈沖14.49 μs，功率17 W，樣品溫度27 ℃。為了提高測量的準(zhǔn)確度，所有的樣品都采用稱重的方式。

1.2.7賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白的最適pH和pH穩(wěn)定性

分別配制pH值為4.0–10.0，濃度為5%的賴氨酸鹽酸鹽緩沖溶液，加入5’-磷酸吡哆醛至終濃度為0.1 mmol/L，加入純化的賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白，測定不同pH值下賴氨酸脫羧酶LDC的酶活。

分別將純化的賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白溶解于不同pH值緩沖液中，37 ℃靜置保存36 h后測定酶活，確定此酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.8賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

配制pH值為5.5，終濃度為5%的賴氨酸鹽酸鹽緩沖液100 g，加入5’-磷酸吡哆醛至終濃度為0.1 mmol/L，加入純化的賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白，分別在20 ℃到80 ℃不同溫度下測定酶活，研究酶的最適反應(yīng)溫度。

將純化的賴氨酸脫羧酶蛋白溶解于pH值為5.5緩沖溶液中，靜置于不同溫度的水溶液中水浴保溫36 h，測定酶活力，考察溫度對酶穩(wěn)定性的影響。

1.2.9不同金屬離子對粗酶酶活的影響

在反應(yīng)液中分別加入終濃度為10 mmol/L的各種離子，37 ℃測定賴氨酸脫羧酶LDC酶活，不加金屬離子的作為對照。

2　結(jié)果與分析

2.1ldc基因在大腸桿菌中的表達(dá)

以克雷伯氏菌基因組DNA為模板，用KOldc-F、KOldc-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得到片段與目的基因ldc的2 148 bp大小一致 (約為2.1 kb)，如圖1所示。

膠回收此目的片段，連接pMD18-T載體構(gòu)建得到pMD18-KOldc，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli JM109中，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后送出測序。測序結(jié)果通過Blast進(jìn)行比對，表明PCR擴(kuò)增獲得的基因ldc核苷酸序列與K. oxytoca E718的賴氨酸脫羧酶的基因序列 (GenBank Accession No. CP003683.1) 同源性達(dá)99%，為一個(gè)完整的閱讀框。pMD-KOldc用SacⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，膠回收KOldc片段，將其與經(jīng)相同酶切線性化的pUC18載體連接，將得到的重組表達(dá)載體命名為pUC18-KOldc。并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，通過菌落PCR篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，LB培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ酶切驗(yàn)證確認(rèn)。

圖1　產(chǎn)酸克雷伯氏菌ldc基因的擴(kuò)增Fig. 1　PCR products of ldc gene. M: marker; 1-2: ldc PCR.

重組質(zhì)粒pUC18-KOldc通過電擊轉(zhuǎn)化入E. coli MG1655 K12感受態(tài)細(xì)胞，首先通過菌落PCR篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子液體培養(yǎng)后提取少量質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，酶切驗(yàn)證正確的陽性轉(zhuǎn)化子命名為LN18。將LN18接種至含氨芐青霉素鈉 (終濃度為100 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接，35 ℃培養(yǎng)至OD560約4–5，加入IPTG過夜誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵液酶活可達(dá)到35 U。由于大腸桿菌本身的賴氨酸脫羧酶CadA的表達(dá)需要在低pH、有賴氨酸的誘導(dǎo)下才能表達(dá)，而且野生型的表達(dá)量很低[7]。因此認(rèn)為表達(dá)的為產(chǎn)酸克雷伯氏菌的賴氨酸脫羧酶。將發(fā)酵液按照步驟1.2.4制備得到的粗酶的1×SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，LDC蛋白大小約為80 kDa，結(jié)果見圖2。

圖2　賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig. 2　SDS-PAGE analysis of proteins from strain LN18.

2.2產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

每種酶都有其最適pH，在最適pH下催化反應(yīng)的速率是它的最高值。最適pH的偏離，使得酶活性部位的基團(tuán)離子化發(fā)生變化從而降低酶的活力。本研究考察在pH 4.0–10.0的范圍內(nèi)產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶粗酶的酶活變化，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，酶的最適反應(yīng)pH為5.5左右，酶活達(dá)到30 000 U左右，隨著pH值上升，酶活力逐漸降低，當(dāng)pH值達(dá)到7.5左右時(shí)，酶活幾乎降低一半，當(dāng)pH值偏酸性如pH值為4.0時(shí)，酶活也大幅下降。通過比對前人的文獻(xiàn)[8]，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶的最適pH和大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶CadA相近，最適pH都為5.5，但與大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶CadA在pH 8.0幾乎沒有酶活不同，產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶在pH 8.0的酶活能達(dá)到最適pH值酶活的30%以上。

將粗酶蛋白在不同pH緩沖液 (pH 4.0–10.0) 中于37 ℃處理36 h后，測定其相對酶活，相對酶活為處理前后的酶活百分比，結(jié)果如圖3所示。產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶在pH 5.0–6.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，能保持80%以上的酶活力；pH 7.0以上，酶穩(wěn)定性迅速下降。

2.3產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

溫度從兩方面影響酶促反應(yīng)的速率，升高溫度增加底物分子的熱能，提高反應(yīng)的速率，但是較高溫度會(huì)增加構(gòu)成酶本身蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子熱能，增加了多重弱的非共價(jià)鍵相互作用破裂的機(jī)會(huì)，這些相互作用維系著酶的三維結(jié)構(gòu)，最終將導(dǎo)致酶的變性。酶的三維構(gòu)象會(huì)改變活性部位的結(jié)構(gòu)，從而改變酶的催化活性。本研究將pH值為5.5的賴氨酸脫羧酶溶液放置于20 ℃–80 ℃的環(huán)境中測定酶活，結(jié)果見圖4，由圖4可知該粗酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在該溫度下酶活達(dá)到37 000 U。

圖3　產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性Fig. 3　The optimal pH and pH stability for LDC.

圖4　產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性Fig. 4　The optimal temperature and temperature stability for LDC.

溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶粗酶蛋白在40 ℃以下較穩(wěn)定，相對酶活沒有變化，在40 ℃以上，酶穩(wěn)定性逐漸下降，到達(dá)60 ℃時(shí)LDC相對活力下降接近80%。

2.4不同金屬離子對產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶活性的影響

金屬離子經(jīng)?？梢宰鳛槊复俜磻?yīng)的輔因子，因此在酶促反應(yīng)中經(jīng)常添加某些金屬離子來促進(jìn)酶促反應(yīng)的進(jìn)行。賴氨酸脫羧酶反應(yīng)需要5’-磷酸吡哆醛作為輔酶。反應(yīng)體系中添加各種金屬離子考察對酶活的影響，其中以不加離子時(shí)的酶作為對照，設(shè)其酶活為100%，結(jié)果表明K+、Na+、Co2+金屬離子對酶促反應(yīng)影響較小，Mg2+對酶活有促進(jìn)作用，相對酶活為113，而Fe2+、Zn2+、Ca2+有一定的抑制作用。

3　討論

產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶基因可以在大腸桿菌中得到很好的表達(dá)。構(gòu)建的重組菌LN18經(jīng)過LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后用終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)酵液酶活可以達(dá)到35 U/g發(fā)酵液，對發(fā)酵液的賴氨酸脫羧酶進(jìn)行純化，得到賴氨酸脫羧酶蛋白，酶活可以達(dá)到30 000 U。賴氨酸脫羧酶粗酶的最適反應(yīng)pH值為5.5，最適反應(yīng)溫度為55 ℃。和大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶CadA在pH 8.0幾乎沒有酶活不同，產(chǎn)酸克雷伯氏菌賴氨酸脫羧酶在pH 8.0左右仍然能保持在最優(yōu)pH下酶活的30%以上。這可能使得在生物催化過程中可以減少pH緩沖鹽的加入，有利于后續(xù)的產(chǎn)品純化和提高產(chǎn)品的質(zhì)量，對生物法合成戊二胺的產(chǎn)業(yè)化具備較好的應(yīng)用價(jià)值。離子實(shí)驗(yàn)表明，K+、Na+、Co2+金屬離子對酶促反應(yīng)影響較小，Mg2+對酶有促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+、Zn2+、Ca2+有一定的抑制作用。下一步研究將對該酶進(jìn)行異源表達(dá)優(yōu)化和分子定向進(jìn)化，進(jìn)一步提高酶的表達(dá)量和發(fā)掘酶在高pH下的表現(xiàn)性能，為生物法合成戊二胺的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Heterologous expression and characterization of Klebsiella oxytoca lysine decarboxylase

Naiqiang Li1,2, Lijun Yu2, and Yan Xu1
1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 Cathay Industrial Biotech Ltd., Shanghai 201203, China

Abstract:Cadaverine is a biogenic amine that has the potential to become an important platform chemical for the production of industrial polymers, such as polyamides and polyurethanes. We reported here a lysine decarboxylase from Klebsiella oxytoca. The lysine decarboxylase from Klebsiella oxytoca was cloned to Escherichia coli to get the strain LN18. The specific activity of the crude protein from LN18 reached 30 000 U. The molecular weight was about 80 kDa. The optimum temperature and pH of the crude protein were 55 ℃ and 5.5 respectively. The specific activity could keep over 30% at pH 8.0 compared the one at pH 5.5, much difference from Escherichia coli lysine decarboxylase CadA. Mg2+was positive to the specific activity, whereas Fe2+, Zn2+and Ca2+were negative.

Keywords:lysine decarboxylase, Klebsiella oxytoca, cadaverine, heterologous expression, pH stability

DOI:10.13345/j.cjb.150380

Corresponding authors: Naiqiang Li. Tel: +86-21-50801916; Fax: +86-21-50801386; E-mail: linaiqiang@cathaybiotech.com