慶大霉素導(dǎo)致耳毒性中毒的自噬現(xiàn)象

劉丁丁劉永澤麻曉峰陸玲周函錢曉云高下南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（南京210008）

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慶大霉素導(dǎo)致耳毒性中毒的自噬現(xiàn)象

劉丁丁劉永澤麻曉峰陸玲周函錢曉云高下
南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（南京210008）

【摘要】目的慶大霉素是一種臨床上常用的氨基糖苷類抗生素，隨著其使用劑量和作用時(shí)間的增加，它的耳毒性逐漸明顯。本實(shí)驗(yàn)在體外用新生C57BL/6J小鼠的耳蝸基底膜構(gòu)建慶大霉素耳毒性模型觀察自噬的發(fā)生。方法體外原代培養(yǎng)的耳蝸基底膜應(yīng)用慶大霉素之后，行透射電鏡觀察自噬體的結(jié)構(gòu)，免疫熒光、免疫印跡檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-II的變化。結(jié)果在慶大霉素的耳毒性模型中，觀察到了自噬現(xiàn)象的發(fā)生。結(jié)論自噬參與了慶大霉素的耳毒性過程，提示我們干預(yù)自噬可以影響慶大霉素的耳毒性過程。

【關(guān)鍵詞】毛細(xì)胞；慶大霉素；耳毒性；自噬

劉丁丁和劉永澤并列第一作者

This work was supported by the Nanjing Science and technology development Foundation（201303003）and Nanjing Medical Science and technique Development Foundation（QRX11079）of China.

Conflict of interests:The authors declare no conflict of interests.

全世界流行最廣的感覺器官殘疾是聽力損失。依據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織報(bào)告：全世界有3.6億人有殘疾性聽力損失，占全球人口的5％，其中80％殘疾人群生活在中低收入國家。聽力殘疾居于我國殘疾人口數(shù)量的第二位，近年來隨著耳毒性藥物使用增加，聽力損失的人群數(shù)量急劇增長(zhǎng)。聽力損失最影響與他人溝通的能力，會(huì)導(dǎo)致一系列問題。顯而易見，聽力損失已成為影響社會(huì)政治和經(jīng)濟(jì)的全球性的健康問題。目前認(rèn)為哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)元不能自發(fā)再生，一旦受到損傷將會(huì)導(dǎo)致永久性耳聾。

對(duì)于肺結(jié)核的治療以及由需氧革蘭陰性菌產(chǎn)生的其他疾病，氨基糖苷類抗生素有強(qiáng)大的功效（Fujimoto，Mizuno et al.）。然而，隨著氨基糖苷類抗生素使用療程的延長(zhǎng)和（或）劑量的增加往往導(dǎo)致嚴(yán)重腎毒性和耳毒性的發(fā)生，其中耳毒性往往是不可逆轉(zhuǎn)的，特別是對(duì)于那些遺傳易感性的患者［6-7］。由于其價(jià)格低廉、低耐藥、低過敏，目前仍然在許多發(fā)展中國家使用。慶大霉素是一種常用的氨基糖苷類抗生素，因其耳毒性備受關(guān)注，被吸收后在內(nèi)耳淋巴液內(nèi)蓄積［8-10］。內(nèi)耳中的毛細(xì)胞對(duì)其有高度親和力，吸收后會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)胞的死亡。研究已證明在慶大霉素的耳中毒過程中毛細(xì)胞的死亡屬于凋亡［11］，凋亡與自噬聯(lián)系密切［12］，而自噬是否參與毛細(xì)胞的死亡過程尚未可知。

上個(gè)世紀(jì)60年代即在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬現(xiàn)象［13］，但是涉及到自噬的的細(xì)胞成分及機(jī)制則是在酵母中得到了驗(yàn)證［14］?，F(xiàn)在哺乳動(dòng)物的同源基因也被發(fā)現(xiàn)并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬中發(fā)揮了重要作用［15-16］。諸如：LC3，Atg8的哺乳動(dòng)物同源體，通過與腦磷脂結(jié)合形成LC3-II，而其位于自噬體膜上，它的表達(dá)水平反映自噬水平的高低［17］。自噬是通過一系列復(fù)雜的過程，將一個(gè)組件或外來入侵者自我消化的過程；是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和抵抗逆境的重要機(jī)制；是亞細(xì)胞膜構(gòu)造產(chǎn)生動(dòng)態(tài)變化并經(jīng)溶酶體介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過程［14-15，18］。自噬的形成分為四個(gè)過程，即自噬前體的形成、自噬體的形成、自噬體與溶酶體相結(jié)合、消融的一個(gè)過程［19］。自噬作為一種細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)［14-15］。盡管近年來自噬研究飛速發(fā)展，但在慶大霉素的耳毒性過程中研究甚少。

體外培養(yǎng)的耳蝸中加入慶大霉素可以導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞的損傷，自噬現(xiàn)象是否出現(xiàn)在該種模型中，到目前為止仍然無相關(guān)報(bào)道。我們本次的研究利用慶大霉素的耳毒性模型證明了該造模過程中自噬的發(fā)生。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

出生四天的C57BL/6J的小鼠由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供。Millicell購自Millipore公司（PIHT30R48），層粘連蛋白購自BD公司，多聚鳥氨酸、phalloidin均購自Sigma公司，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚購自碧云天，DMEM購自生興。兔抗LC3抗體（Sigma Aldrich L7543），Western blot中使用的蛋白裂解緩沖液（RIPA裂解液）購于南通碧云天生物有限公，GAPDH等抗體購于美國Cell Signaling公司；二抗anti-rabbit IgG購于美國Jackson公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1耳蝸取材及培養(yǎng)

組織包被液的制作參照之前文獻(xiàn)［20］。P4小鼠冰上麻醉后，用75％酒精噴灑C57小鼠頭頸部后再移入超凈臺(tái)內(nèi)斷頭暴露顱底，在顯微鏡下用細(xì)鑷在內(nèi)耳道處分離暴露整個(gè)耳蝸底回并取出耳蝸，在平衡培養(yǎng)液中用鑷子打開整個(gè)耳蝸，充分暴露膜迷路，去除骨性蝸軸、螺旋韌帶、血管紋和蓋膜等其他結(jié)構(gòu)，分離出全耳蝸基底膜Corti'S器進(jìn)行體外培養(yǎng)。吸棄預(yù)孵濾膜的混合液，加入適量培養(yǎng)液，用1ml的加樣槍把耳蝸轉(zhuǎn)移至濾膜表面，區(qū)分正反，在濾膜表面鋪放平整，再次吸棄培液，使組織貼壁牢固，之后緩慢加入培養(yǎng)液，以覆蓋濾膜和基底膜為宜。在37℃和5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h以使基底膜貼壁牢固。24h之后更換組織培養(yǎng)液，耳蝸組織被隨機(jī)分為兩組，空白對(duì)照組即正常培養(yǎng)液組，慶大霉素組即培養(yǎng)液中加入了100μm/L的慶大霉素。分為兩組后再繼續(xù)培養(yǎng)24h后收樣進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫熒光

藥物作用24h之后帶有樣本的濾膜經(jīng)4％福爾馬林磷酸鹽緩沖液在4℃固定2h，用0.1mol/L的PBST漂洗，之后0.1％Triton破膜20分鐘，5％BSA封閉30分鐘，放入用0.1mol/L PBST（含5％的BSA）稀釋（1:200）的LC3抗體，于4℃冰箱孵育過夜。第二天，0.1mol/L的PBST漂洗后加入用0.1mol/L PBST稀釋（1:500）的相應(yīng)的二抗及DAPI（1:2500）和phalloidin（1:500），室溫避光2h，漂洗后將帶有樣本的濾膜用抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片。激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.3透射電鏡觀察

培養(yǎng)48h之后帶有樣本的濾膜經(jīng)2.5％戊二醛磷酸鹽緩沖液在4℃固定過夜（前固定），1％四氧化鋨于4℃固定2小時(shí)（后固定），用1×PBS漂洗3次后梯度脫水：30％丙酮、50％丙酮、70％丙酮、80％丙酮、90％丙酮、100％丙酮各脫水一次，之后浸透、固化，樣品在Reichert超薄切片機(jī)中切片，獲得50-60nm的切片。檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50％乙醇飽和溶液各染色15min。Hitachi-7650透射電鏡觀察，拍片。

1.2.4耳蝸組織的Western blot

耳蝸組織被隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組即正常培養(yǎng)液組，慶大霉素組即培養(yǎng)液中加入了100μm/L的慶大霉素，兩組耳蝸經(jīng)不同處理后在相同的時(shí)間點(diǎn)收取樣本。每組取20個(gè)耳蝸，在0.1mol/L的PBS中蕩洗除去培養(yǎng)液，收集在無酶1.5mlEP管中加入100μL的Lysis Buffer并補(bǔ)充1％的蛋白酶抑制劑PMSF。提取用蛋白定量分析試劑盒測(cè)定蛋白含量，按比例加入Loading Buffer后沸水浴10min，保存在-70℃。配置15％的分離膠及5％的濃縮膠，之后電泳、轉(zhuǎn)膜及顯影。

2　結(jié)果

2.1免疫熒光及細(xì)胞計(jì)數(shù)

耳蝸經(jīng)過不同處理培養(yǎng)之后，毛細(xì)胞數(shù)量會(huì)發(fā)生變化，毛細(xì)胞數(shù)量也間接反映了耳毒性的大小。用FITC-phalloidin標(biāo)記的毛細(xì)胞纖毛（綠色）染色和DAPI（藍(lán)色）染核及自噬標(biāo)記抗體LC3（紅色）的免疫熒光實(shí)驗(yàn)（圖1A）?？瞻讓?duì)照組內(nèi)外毛細(xì)胞沒有明顯的損失。慶大霉素組毛細(xì)胞破壞嚴(yán)重，排列紊亂。同時(shí)，我們每組取6個(gè)耳蝸根據(jù)FITC-phalloidin標(biāo)記的毛細(xì)胞纖毛對(duì)毛細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如下（圖1B）。

圖1　利用免疫熒光和毛細(xì)胞定量分析系統(tǒng)對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)，A:FITC-phalloidin和DAPI及LC3對(duì)耳蝸組織的染色結(jié)果。Apical:頂轉(zhuǎn)Middle：中轉(zhuǎn)Basal：底轉(zhuǎn)。B:根據(jù)FITC-phalloidin染色結(jié)果應(yīng)用毛細(xì)胞定量分析軟件對(duì)細(xì)胞數(shù)目所做的計(jì)數(shù)圖。每組的耳蝸數(shù)均為6個(gè)，毛細(xì)胞計(jì)數(shù)即為6個(gè)耳蝸分別計(jì)數(shù)輸入軟件得到的平均值。bar=10μm。Fig.1 Immunofluorescence and quantitative analysis of hair cells in differet treated groups.（A）Explant culture treated with GM and control（no drug）stained with FITC-phalloidin，DAPI and anti-LC3 labeled protein showed the difference in loss of hair cells in apical，middle and basal region，respectively.（B）Average cytocochleograms represents the percentage of inner hair cell（IHC）and outer hair cell（OHC）loss as a function of percent total distance from the apex of the cochlea.6 specimens were assessed for each condition.

2.2透射電鏡觀察慶大霉素作用后的自噬體結(jié)構(gòu)

透射電鏡的分辨率為0.1～0.2nm，能夠放大倍數(shù)為幾萬～幾十萬倍，是材料研究中的重要技術(shù)手段，能觀察到細(xì)胞內(nèi)細(xì)微結(jié)構(gòu)。取材基底膜制成超薄切片，利用透射電鏡觀察毛細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。電鏡結(jié)果顯示應(yīng)用慶大霉素后耳蝸組織出現(xiàn)大量的自噬體。

圖2　透射電鏡觀察對(duì)照組及慶大霉素組自噬體結(jié)構(gòu)，對(duì)照組沒有觀察到明顯的自噬體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核和表面的纖毛結(jié)構(gòu)清晰、完整。慶大霉素組組毛細(xì)胞破壞嚴(yán)重，觀察到大量的自噬體結(jié)構(gòu)，圖中方框中箭頭指向自噬體。bar=2μm。Fig.2 Autophagy structure within the hair cells observed under transmission electron microscope.Cochlea in each group showed under TEM for autophagy.Structure of cell membrane looks intact，stereocillia arranged in order，and the organelles seemed normal in control group.After GM treatment，the large amount of autophagosomes（red marked）appeared inside the sensory epithelium and cell membrane becomes ruptured，In the box，the arrow points to the autophagosome.bar=2μm.

2.3Western blot檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)

通過Western blot（圖3）分析LC3蛋白的表達(dá)。每組收集20個(gè)耳蝸?zhàn)鳛橐唤M檢測(cè)了對(duì)照組和慶大霉素組LC3蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)慶大霉素組LC3的蛋白量表達(dá)明顯增加。Western blot檢測(cè)LC3有兩條帶，LC3-I和LC3-II，而LC3-II結(jié)合在自噬體膜上，反映自噬水平。

圖3　每組收集20個(gè)耳蝸?zhàn)鳛橐唤M，用組織蛋白裂解液提取耳蝸蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)LC3的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參，慶大霉素組的LC3-II的表達(dá)量明顯增加。Fig.3 The expression of LC3 protein.Western blotting analysis displayed LC3-II formation after GM treatment.Cochleae were incubated with GM for 24h to collect whole cell lysates for immunoblot analysis of LC3.GAPDH was used as a protein loading control.20 specimens were assessed for Western blotting.Abbreviations:

3　討論

對(duì)于慶大霉素?fù)p害的聽覺機(jī)理研究已有很多，研究結(jié)果主要涉及毛細(xì)胞纖毛和外毛細(xì)胞本身的損害從而導(dǎo)致聽力的下降［21］。慶大霉素是一種廣泛使用的氨基糖苷類抗生素，因其耳毒性而備受關(guān)注，氨基糖苷類藥物攝取后在內(nèi)耳淋巴液內(nèi)蓄積累加，與耳蝸毛細(xì)胞親和力較強(qiáng)，引起的耳蝸毛細(xì)胞損害總是從耳蝸底回的外毛細(xì)胞開始逐漸向頂回發(fā)展，外毛細(xì)胞損壞也總是早于內(nèi)毛細(xì)胞。毛細(xì)胞死亡有壞死和凋亡兩種方式。細(xì)胞壞死是某種機(jī)械原因或者代謝原因促使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列降解反應(yīng)，是細(xì)胞的一種被動(dòng)破壞過程。凋亡也稱為“程序性細(xì)胞死亡”，是由基因介導(dǎo)的一系列變化，細(xì)胞依靠它來主動(dòng)的引起自身的破壞。有研究證明，由氨基糖苷類抗生素的代表——慶大霉素引起的急性耳中毒過程中，毛細(xì)胞死亡100％屬于“自殺”，即屬于細(xì)胞凋亡［11］。

阻止慶大霉素的耳毒性的一個(gè)重要目標(biāo)是保護(hù)毛細(xì)胞，眾所周知，凋亡是毛細(xì)胞的主要死亡方式［11］。因此，許多藥物被用來評(píng)估由慶大霉素導(dǎo)致的耳毒性中毛細(xì)胞的保護(hù)作用并且證實(shí)能夠減輕凋亡［22-24］，這些化合物包括鐵鰲合劑［25］和抗氧化劑［26］。而凋亡與自噬的關(guān)系又非常密切［12］。到目前為止，對(duì)于氨基糖苷類抗生素引起的耳聾的發(fā)病機(jī)制仍然不是十分清楚，也無有效治療方法。鑒于此，本研究考慮建立該疾病的離體模型，并通過該模型證明自噬在耳毒性過程中的發(fā)生。近期Jing Cui等在豬中報(bào)道了自噬激活劑雷帕霉素通過增強(qiáng)自噬可以改善慶大霉素導(dǎo)致的腎臟毒性［27］。而慶大霉素的耳毒性與自噬的關(guān)系目前無任何文獻(xiàn)報(bào)道，因此這是今后研究的重點(diǎn)。

自噬與凋亡之間的關(guān)系雖有爭(zhēng)議，但一般都是受一些共同調(diào)節(jié)因素的影響，兩者之間存在相互作用，以及對(duì)細(xì)胞的生存起著重要的作用。目前自噬和凋亡的關(guān)系大致有以下三種關(guān)系［28］：自噬和凋亡都可引發(fā)細(xì)胞的死亡（圖a），這類觀點(diǎn)包括：自噬和凋亡無相互的作用，各自引發(fā)細(xì)胞的死亡；自噬處在凋亡的上游，在誘發(fā)凋亡的同時(shí)也引發(fā)細(xì)胞的死亡；凋亡也可抑制自噬發(fā)生，當(dāng)抑制凋亡時(shí)，才能誘發(fā)自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自噬還可以抑制凋亡通路：自噬通過降解受損蛋白、降低DNA的損傷途徑減少細(xì)胞凋亡（圖b）。自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞自噬本身不引起細(xì)胞的死亡，但它能夠?yàn)榈蛲鲂◇w形成提供能量，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生（圖c）。自噬和凋亡的關(guān)系可以用下圖概括說明（引自文獻(xiàn)28）。

自噬研究已有幾十年，超過30個(gè)自噬相關(guān)基因已被發(fā)現(xiàn)，自噬研究也越來越透徹。有趣的是，自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞存活也可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，盡管很大程度上不知道什么決定了它的最終結(jié)果［29-30］。雖然自噬研究飛速發(fā)展，但很少研究耳蝸組織中的自噬以及它的調(diào)控和病理生理作用。

本實(shí)驗(yàn)主要是在體外培養(yǎng)的耳蝸組織中進(jìn)行，在培養(yǎng)過程中加入慶大霉素可以導(dǎo)致毛細(xì)胞損傷死亡，這種模型已被諸多實(shí)驗(yàn)所證明。研究運(yùn)用多種技術(shù)證明在這種模型中自噬的發(fā)生，包括透射電鏡技術(shù)分析自噬體結(jié)構(gòu)、免疫熒光及免疫印跡技術(shù)分析自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)。對(duì)比這些組織培養(yǎng)技術(shù)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)自噬相關(guān)標(biāo)記的檢測(cè)由于耳蝸的特殊性而被限制。在體外培養(yǎng)的耳蝸中，證明了加入慶大霉素之后能夠破壞毛細(xì)胞并且透射電鏡及免疫印跡均證明了自噬的存在。

結(jié)合研究的結(jié)果，推測(cè)自噬很有可能參與了氨基糖苷類抗生素的耳毒性過程。提示研究者干預(yù)自噬有可能成為治療耳聾新的靶點(diǎn)。這將是關(guān)于毛細(xì)胞凋亡機(jī)制一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)。因此，后續(xù)重點(diǎn)研究自噬的分子機(jī)制及信號(hào)通路，將能更好地了解如何操縱這一信號(hào)通路滿足治療目的。這仍是一個(gè)年輕的研究領(lǐng)域，還有許多未知事物，這項(xiàng)工作才剛剛開始，最后，用藥物調(diào)控這些信號(hào)通路有可能為對(duì)抗疾病指出了一些可能的治療策略。本研究的完成，將證明自噬在氨基糖苷類抗生素耳毒性過程中的發(fā)生，將為認(rèn)識(shí)氨基糖苷類抗生素的耳毒性打開新的篇章，同時(shí)為臨床上相應(yīng)的治療提供新的思路。

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The Phenomenon of Autophagy in Gentamicin Induced Ototoxicity

LIU Dingding，LIU Yongze，MA Xiaofeng，LU Ling，ZHOU Han，QIAN Xiaoyun，GAO Xia
Department of Otolaryngology，Drum Tower Hospital，Medical School of Nanjing University，Nanjing，210008
Corresponding author:GAO Xia，E-mail:xiagaogao@hotmail.com

【Abstract】Objective Gentamicin is a frequently used aminoglycoside antibiotic.With increasing dose and duration，its ototoxicity side effects will gradually appear.The current study aims to study the phenomenon of autophagy in gentamicin induced ototoxicity.Methods The cochlea was cultured with gentamicin exposure.Transmission electron microscopy，immunofluorescence and Western blotting were used to observe the expression of autophagy protein LC3 in the explant culture treated with the gentamicin.Results In vitro administration of gentamicin in mouse cochlear cultures induced the formation of autophagic vesicles and autophagosomes in hair cells.Conclusion Our results demonstrate that autophagy participates in the process of ototoxicity induced by gentamicin and suggest that intervention aimed at autophagy may influence the ototoxicity process.

【Key words】Hair cells；Gentamicin；Ototoxicity；Autophagy

【中圖分類號(hào)】R764

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1672-2922（2016）02-260-5

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.027

基金項(xiàng)目：南京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201303003）南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展資金資助（編號(hào)：QRX11079）

作者簡(jiǎn)介：劉丁丁，碩士在讀，研究方向:耳內(nèi)科基礎(chǔ)

通訊作者：高下，Email:xiagaogao@hotmail.com

收稿日期：（2015-11-04審核人：郭維維）