脂肪酶Sv-lip5的異源表達(dá)及其在蝦青素酯水解中的應(yīng)用

閆 嬌，高坤鵬，余可欣，孫建安，毛相朝,

1. 中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003

2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237

蝦青素是一種脂溶性酮式類胡蘿卜素[1]，其分子結(jié)構(gòu)中含有11個(gè)共軛雙鍵、2個(gè)β-紫羅蘭酮環(huán)和羥基。蝦青素因具有抗氧化[2-3]、抗炎[4-5]和免疫調(diào)節(jié)[6-7]等作用而受到廣泛關(guān)注，它在保護(hù)人類和動(dòng)物免受包括心血管疾病、糖尿病、癌癥和一些免疫系統(tǒng)疾病方面具有巨大的應(yīng)用潛力[8]，已被廣泛應(yīng)用于食品、膳食補(bǔ)充劑、藥品和化妝品等各個(gè)領(lǐng)域。

蝦青素在自然界的主要存在形式是與不同種類脂肪酸結(jié)合的蝦青素酯[9]，紅球藻 (Haematococcus)中蝦青素組成約為70%的單酯形式、25%的雙酯形式和5%的游離形式[10]。天然的蝦青素酯存在成分復(fù)雜、功能差異大等問題[11]，且大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)不能合成蝦青素，只能從食物等其他途徑獲得[12]。此外，有研究表明游離形式蝦青素的生物利用度更高、更容易被機(jī)體吸收利用[13]，因此將蝦青素酯水解制備游離蝦青素，是提升蝦青素產(chǎn)品品質(zhì)和功能活性的一個(gè)重要研究方向。蝦青素酯的水解反應(yīng)一般通過強(qiáng)堿皂化或酶解的方式進(jìn)行[14]。皂化法是水解蝦青素酯的傳統(tǒng)方法[15-16]，過程中需要使用強(qiáng)堿溶液，反應(yīng)條件劇烈，反應(yīng)過程的廢液會(huì)造成環(huán)境污染隱患，并且蝦青素對熱敏感，高溫反應(yīng)條件可能會(huì)導(dǎo)致蝦青素降解，并容易產(chǎn)生蝦紅素等副產(chǎn)物[17-18]。酶解法具有反應(yīng)條件溫和、水解效率高、副產(chǎn)物少、產(chǎn)物生物安全性好等優(yōu)勢，是皂化法的理想替代方法[19]。孔凡華等[20]通過比較不同脫脂方法所測得的蝦青素含量，總結(jié)出酶解法對蝦青素的含量影響較小，先酶解再進(jìn)行液相色譜分析可以準(zhǔn)確定量樣品中蝦青素的含量。

脂肪酶 (EC 3.1.1.3) 是一種能夠水解三?；视王サ拿福部纱呋セ?、酯交換等反應(yīng)。關(guān)于使用脂肪酶水解蝦青素酯已有相關(guān)研究。Zhao等[21]使用在畢赤酵母 (Pichia sp.)中表達(dá)的堿性脂肪酶用于水解蝦青素酯，以吐溫80作為乳化劑，在pH 7.0、溫度 28 ℃、4.6 U·μg-1脂肪酶劑量和 0.1 mol·L-1磷酸鈉緩沖液的條件下，7 h內(nèi)可回收63.2%的游離蝦青素。Gao等[22]在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中表達(dá)了一種新型的鏈霉菌脂肪酶OUC-Sblip12用于水解蝦青素酯，100 μg蝦青素酯中蝦青素得率為61.43 μg?，F(xiàn)有研究表明利用脂類水解酶酶解制備蝦青素的得率較高，但存在反應(yīng)時(shí)間較長、菌株來源安全性較低的問題。因此，目前需要找到一種水解效率高、反應(yīng)過程溫和、反應(yīng)副產(chǎn)物少、來源安全的酶，快速制備游離蝦青素，為后續(xù)蝦青素的綜合利用提供參考。

本文從淺紫色鏈霉菌 (Streptomyces violascens)ATCC 27968中發(fā)掘Sv-lip5脂肪酶，并使用食品級表達(dá)系統(tǒng)枯草芽孢桿菌WB800對其進(jìn)行克隆表達(dá)。探究了其酶學(xué)性質(zhì)及其在蝦青素酯水解中的應(yīng)用，進(jìn)一步豐富了蝦青素酯水解酶庫，實(shí)現(xiàn)了在短時(shí)間內(nèi)大量制備游離蝦青素，為提升蝦青素的功能活性和生物利用度提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用pP43NMK質(zhì)粒及枯草芽孢桿菌WB800感受態(tài)細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保藏；用于基因克隆的大腸桿菌 (Escherichia coli) TreliefTM5α購自北京天根生化科技。

1.2 主要材料與儀器

蝦青素酯 (蝦青素酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%) 購自云南愛爾發(fā)生物技術(shù)股份有限公司，純度高于96%；蝦青素購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對硝基苯酚棕櫚酸酯購自美國SIGMA公司；膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；色譜級甲醇和甲基叔丁基醚用于液相檢測；其余試劑如二氯甲烷、異丙醇等均為分析純。

BCM-1000型生物凈化工作臺(tái) (蘇州凈化公司)；DYY-6C型核酸電泳儀 (北京市六一儀器廠)；5804R高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf公司)；Thermo Scientific Multiskan FC酶標(biāo)儀 (Thermo Scientific公司)；LC-20A高效液相色譜儀 (日本島津公司)。

1.3 Sv-lip5的克隆表達(dá)及純化

1.3.1 Sv-lip5序列分析

基于本實(shí)驗(yàn)室的淺紫色鏈霉菌 ATCC 27968的測序結(jié)果，找到具有脂肪酶活性的片段，對其進(jìn)行克隆表達(dá)，將蛋白命名為Sv-lip5。根據(jù)已有的分析方法對脂肪酶DNA序列進(jìn)行分類，使用Clustal W進(jìn)行多序列比對，利用ESPript 3.0網(wǎng)站對序列的比對結(jié)果進(jìn)行在線展示和輸出，使用ExPaSy (https://web.expasy.org/protparam/) 計(jì)算理論分子量和等電點(diǎn)。

1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)脂肪酶基因序列及載體序列，使用Snap-Gene軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì) (表1)。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Sequences of primers

以Sv-lip5片段為模板，利用表1設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后以無縫連接的形式構(gòu)建重組質(zhì)粒，測序正確后提取質(zhì)粒pP43NMK-Sv-lip5，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞WB800中表達(dá)蛋白。

1.3.3 Sv-lip5的純化

利用質(zhì)粒上His-tag標(biāo)簽蛋白與鎳柱結(jié)合的性質(zhì)對Sv-lip5純化，依次使用體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的乙醇、水沖洗柱子，后用6倍柱體積的Tris-HCl(0.1 mol·L-1) 緩沖液平衡鎳柱，將凍干后復(fù)溶的酶液過膜后分批加入平衡后的鎳柱中，確保酶與鎳柱充分結(jié)合。使用不同濃度的咪唑Tris-HCl緩沖液洗脫，收集不同濃度的洗脫液，濃縮后通過SDSPAGE蛋白電泳驗(yàn)證純化結(jié)果。

1.3.4 脂肪酶活性測定

使用對硝基苯酚棕櫚酸酯進(jìn)行酶活性測定。吸取甘氨酸氫氧化鈉 (Gly-NaOH) 緩沖液 (0.1 mol·L-1,pH 9.0) 500 μL于 2 mL EP管中，加入 50 μL 酶液和20 μLpNPP底物 (0.02 mol·L-1)，混合后于 40 ℃ 水浴鍋中反應(yīng)5 min，加入330 μL 1%的SDS緩沖液終止反應(yīng)。取200 μL反應(yīng)液于405 nm測定吸光度。

脂肪酶酶活性 (U) 單位的定義：在一定的反應(yīng)條件下，每分鐘水解底物釋放1 μmol對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP) 所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位，即1 U。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)分析方法

1.4.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性測定

取等量酶液在不同溫度 (25、30、35、40、45、50、55、60 ℃) 下水解對硝基苯酚棕櫚酸酯，測定酶活性。將最適溫度下的活性定義為100%，計(jì)算其他溫度下的相對酶活。取等量酶液分別在不同溫度 (35、40、45、50 ℃) 下孵育 42 h，在一定時(shí)間間隔取樣，最適條件下測定酶活，同一溫度下以0 h酶活定義為100%，分別計(jì)算不同溫度下酶的活性。

1.4.2 最適 pH 和 pH 穩(wěn)定性的測定

選取 100 mmol·L-1的 pH 4.0～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、pH 6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液、pH 8.0～9.0的Tris-HCl緩沖液、pH 9.0～10.0的Gly-NaOH緩沖液作為酶反應(yīng)的緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，測定不同pH下的酶活性。將最適pH下的活性定義為100%，計(jì)算其他pH條件下的相對酶活。取等量酶液于上述緩沖液中孵育96 h，在不同時(shí)間間隔取樣，在最適條件下測定酶活，同一pH下酶活最高的時(shí)間點(diǎn)的活性定義為100%，分別計(jì)算在不同pH緩沖液中脂肪酶的活性。

1.4.3 金屬離子及表面活性劑對酶活性的影響

在酶液中分別加入鈷離子 (Co2+)、鉀離子(K+)、鋅離子 (Zn2+)、鎂離子 (Mg2+)、鎳離子(Ni2+)、錳離子 (Mn2+)、鋇離子 (Ba2+)、鈉離子(Na+)、鈣離子 (Ca2+)、銅離子 (Cu2+)、鐵離子(Fe3+) 及化學(xué)試劑乙二胺四乙酸二鈉 (Na2-EDTA)，使其終濃度為1和10 mmol·L-1，將其置于37 ℃下保存1 h，進(jìn)行酶活測定，探究金屬離子及化學(xué)試劑對脂肪酶Sv-lip5的影響。在酶液中添加表面活性劑 (吐溫60、吐溫80、司盤20、司盤80、曲拉通X-100)，探究表面活性劑對脂肪酶活性的影響。對照組中不添加金屬離子或化學(xué)試劑，定義其活性為100%，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與實(shí)驗(yàn)組相同，分別計(jì)算添加金屬離子及表面活性劑的實(shí)驗(yàn)組中脂肪酶活性。

1.5 Sv-lip5在蝦青素酯水解中的應(yīng)用

1.5.1 蝦青素酯水解條件研究

利用Sv-lip5進(jìn)行蝦青素酯的水解，水解反應(yīng)體系為2 mg的雨生紅球藻 (Haematococcus pluvialis) 油，溶于500 μL的無水乙醇中，超聲加速溶解。25 mL的棕色具塞三角瓶作為反應(yīng)容器，加入500 μL的底物，5 mL的Gly-NaOH緩沖液，加入不同量的酶粉后，充入氮?dú)夂竺芊猓瑢⑵渲糜?0 ℃水浴搖床中進(jìn)行反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)定pH為4.0～10.0，加酶量設(shè)置為80～900 mg，反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為0～25 h，分析不同pH、乙醇與緩沖液比例、加酶量和反應(yīng)時(shí)間對水解率的影響。

1.5.2 蝦青素萃取方法

反應(yīng)結(jié)束后取500 μL反應(yīng)液，使用體積比為1∶2的異丙醇和二氯甲烷進(jìn)行萃取，離心去上清，收集有機(jī)相并氮吹至近干，后用1∶1的色譜純甲醇和甲基叔丁基醚1 mL復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜收集樣品至棕色液相上樣瓶中，避光保存待測。通過高效液相色譜 (HPLC) 檢測蝦青素的生成量。

1.5.3 蝦青素檢測方法

HPLC檢測所用色譜柱為YMC-Carotenoid-C30 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)，紫外檢測波長為475 nm，流動(dòng)相為甲基叔丁基醚 (A) 和甲醇 (B)，采用線性梯度洗脫的方式[23-24]，0～15 min，B為90%；15～25 min，B從90%降至40%；25～35 min，B由40%重新升至90%。流速設(shè)置為1 mL·min-1，柱溫箱 35 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。

1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin Pro軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖片處理，數(shù)據(jù)均為3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sv-lip5序列分析

在桿菌狀鏈霉菌ATCC 27968[25]測序結(jié)果中找到脂肪酶Sv-lip5的基因序列，其序列長度為1 014 bp，該蛋白編碼了338個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為34.8 kD、等電點(diǎn)為5.36，對其進(jìn)行脂肪酶多序列比對 (圖1)，結(jié)果表明Sv-lip5屬于脂肪酶第四家族，具有第四家族的特征。

圖1 Sv-lip5進(jìn)化樹分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of Sv-lip5

2.2 Sv-lip5的表達(dá)和純化

陽性克隆驗(yàn)證結(jié)果見圖2-a。驗(yàn)證正確后的菌株在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵12 h后，收集發(fā)酵液進(jìn)行離心，上清液即為粗酶液。使用鎳柱對粗酶進(jìn)行純化，用不同濃度的咪唑Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)進(jìn)行洗脫，收集各濃度洗脫液，濃縮后利用SDSPAGE蛋白電泳進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果見圖2-b，在0.1 mol·L-1的咪唑濃度下洗脫出了目標(biāo)蛋白條帶，蛋白大小與預(yù)測分子量相近，表明蛋白成功純化。

圖2 Sv-lip5的核酸電泳結(jié)果 (a) 和SDS-PAGE蛋白純化結(jié)果 (b)Fig. 2 Nucleic acid electrophoresis results (a) and SDS-PAGE protein purification results (b) of Sv-lip5

2.3 Sv-lip5酶學(xué)性質(zhì)分析

在25～65 ℃測定了Sv-lip5的最適溫度和溫度穩(wěn)定性 (圖3-a)，可以看出Sv-lip5的最適溫度為45 ℃，EST4也顯示出相同的最適溫度，并且可在較寬的溫度范圍內(nèi)高效使用，適用于較高溫度下的生物技術(shù)應(yīng)用[26]。在25～45 ℃內(nèi)，酶活逐漸增強(qiáng)至最大值，相對酶活保持在80%以上，之后隨著溫度的升高酶活逐漸下降，在65 ℃時(shí)相對酶活呈現(xiàn)較低狀態(tài) (22.3%)。酶的溫度穩(wěn)定性見圖3-b，在緩沖液中孵育9 h后，40 ℃時(shí)的酶活迅速下降。經(jīng)孵育42 h后，所有實(shí)驗(yàn)組殘余酶活均在36.8%以上。

本實(shí)驗(yàn)在pH 4.0～10.6內(nèi)考察了Sv-lip5的最適pH及pH穩(wěn)定性 (圖3-c)，表明Sv-lip5在pH為10.0的條件下表現(xiàn)出最佳活性，而在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中活性普遍較低，最高活性僅23.7%，因此Sv-lip5對底物對硝基苯酚棕櫚酸酯的水解活性表現(xiàn)出堿性偏好性。pH會(huì)影響酶活性中心基團(tuán)的解離狀態(tài)，當(dāng)酶處于最適pH條件下，其活性基團(tuán)處于適合與底物結(jié)合的解離狀態(tài)；當(dāng)其處于高于或低于最適pH的環(huán)境時(shí)，其活性基團(tuán)解離狀態(tài)改變，酶活性相應(yīng)降低。pH也會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，過高或過低的pH會(huì)改變酶活性中心的構(gòu)象，使酶活性降低。Sv-lip5在pH 9.0～10.0內(nèi)均有較高的酶活，體現(xiàn)出堿性偏好性；但在pH穩(wěn)定性的測定中，長時(shí)間處于pH 10.0的強(qiáng)堿環(huán)境中，酶活性有較明顯下降，可能pH 10.0的環(huán)境對酶活性中心的構(gòu)象有一定改變 (圖3-c、3-d)。Est16也被發(fā)現(xiàn)是堿性酯酶，其最適pH為8.0～9.0，可在7.0～11.0的寬pH范圍內(nèi)保持活性穩(wěn)定[27]。當(dāng)pH高于10.0時(shí)，Sv-lip5的相對酶活急速下降，當(dāng)pH為10.6時(shí)殘余酶活為50.4%。同時(shí)，在pH同為8.0的不同緩沖液條件下，Sv-lip5的酶活也表現(xiàn)出差異性，這種差異性是酶活性測定中的普遍現(xiàn)象[28]。葉鳳凌等[29]闡述了pH環(huán)境對于植物多酚抑制氧合酶的影響，其中相同pH條件下的硼酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液以及Tris-HCl緩沖液中酶活性存在較大差別，可能是因?yàn)楦骶彌_液中不同的陰離子種類對酶活性的影響程度不同。

圖3-e的金屬離子實(shí)驗(yàn)表明，1 mmol·L-1的Ca2+和 10 mmol·L-1的 Co2+和 Ba2+增強(qiáng)了酶活性，在解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica) 中克隆表達(dá)的脂肪酶YLIP15也表明Ca2+具有增強(qiáng)酶活性的作用，而Mg2+則對YLIP4、YLIP5、YLIP7脂肪酶活性表現(xiàn)出抑制作用[30]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。10 mmol·L-1濃度下除K+和Ni2+顯著降低了酶活性外，其余金屬離子都顯示出輕微抑制。添加表面活性劑會(huì)顯著影響Sv-lip5的活性，司盤20、司盤80、吐溫60、吐溫 80以及曲拉通X-100均對其活性有一定程度的抑制作用 (圖3-f)，司盤20和吐溫60使其活性分別降低了25.7%和55.3%，可能是因?yàn)楸砻婊钚詣┮种屏朔肿娱g和分子內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用[31]。

圖3 Sv-lip5的酶學(xué)性質(zhì)分析Fig. 3 Analysis of enzymatic properties of Sv-lip5

2.4 Sv-lip5水解蝦青素酯

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Sv-lip5對蝦青素酯具有顯著的水解作用，反應(yīng)前后物質(zhì)對比見圖4-a。反應(yīng)前22.5～30 min內(nèi)全部為蝦青素酯，經(jīng)過Sv-lip5作用后，可將其大部分轉(zhuǎn)化為第5.5分鐘出峰的游離蝦青素。蝦青素酯水解反應(yīng)pH優(yōu)化反應(yīng)結(jié)果見圖4-b。由于Sv-lip5是堿性脂肪酶，在堿性條件下顯示出最佳活性且穩(wěn)定性較好。在pH為9.0的緩沖液中水解反應(yīng)效果最佳，反應(yīng)12 h后可產(chǎn)生17.18 μg蝦青素，但在其最適pH 10.0的條件下該酶的水解效果反而顯著降低，僅產(chǎn)生5.03 μg蝦青素，可能是由于該酶在pH 10.0下的穩(wěn)定性較差，12 h的反應(yīng)時(shí)間導(dǎo)致酶活性降低，蝦青素產(chǎn)量也隨之減少。堿性脂肪酶Lipase-YH也存在相同現(xiàn)象，其在pH 6.0～7.0內(nèi)蝦青素產(chǎn)量逐漸增加，但在偏堿性 (pH 8.0～9.0) 條件下卻逐漸減少[32]，可能是堿性環(huán)境下蝦青素存在一定程度的降解。

乙醇和緩沖液比例對于蝦青素酯水解具有一定的影響 (圖4-c)，當(dāng)乙醇和緩沖液比為1∶12時(shí)，水解效果最佳，可產(chǎn)生27.63 μg蝦青素，其余比例下的水解效果均比較微弱，蝦青素產(chǎn)量均小于10.98 μg。

圖4 Sv-lip5在蝦青素酯水解反應(yīng)中的條件優(yōu)化Fig. 4 Optimization of reaction conditions of hydrolysis of astaxanthin ester by Sv-lip5

通過調(diào)整酶量進(jìn)行蝦青素酯的水解研究 (圖4-d)，當(dāng)添加80、160、240 mg脂肪酶時(shí)，蝦青素的含量波動(dòng)較小，水解效率較差，最高蝦青素產(chǎn)量僅15.68 μg。當(dāng)加酶量為320 mg時(shí)，蝦青素產(chǎn)量有微弱的提升，第12小時(shí)水解率最高，可獲得34.31 μg蝦青素。在反應(yīng)體系中添加400和500 mg酶粉時(shí)，水解效果有明顯的轉(zhuǎn)變。向反應(yīng)體系中添加500 mg酶粉，第1小時(shí)的蝦青素產(chǎn)量就可達(dá)87.95 μg，水解前后對比結(jié)果 (圖4-a) 顯示，反應(yīng)完全時(shí)可以得到138.27 μg的蝦青素，水解率為95.13%。Gao等[22]克隆表達(dá)的OUC-Sb-lip12也可用于蝦青素酯的水解，在第12小時(shí)水解率達(dá)96.29%，通過優(yōu)化時(shí)間與加酶量，本研究中Sv-lip5在12 h內(nèi)水解率可達(dá)98.27%，200 μg蝦青素酯中游離蝦青素產(chǎn)量為147.48 μg，高于 Gao等[22]報(bào)道的 OUC-Sblip12水解游離蝦青素產(chǎn)量，可能是由于反應(yīng)過程中蝦紅素等副產(chǎn)物產(chǎn)生較少。經(jīng)測定，Sv-lip5的比酶活為12.46 U·g-1，當(dāng)酶添加量增加至一定程度后，其可高效水解蝦青素酯。后續(xù)可以通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分與酶表達(dá)體系效率，進(jìn)一步降低酶制備成本，保障蝦青素酯的低成本高效水解；同時(shí)，可通過固定化[33-34]等方式提高Sv-lip5的回收利用率，進(jìn)一步降低游離蝦青素的制備成本。此外，Huang等[32]通過優(yōu)化發(fā)酵pH、培養(yǎng)基配方以及甲醇濃度提高酶活性，使其適合大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素，旨在開發(fā)新型高效的酶工藝以減少成本消耗。本實(shí)驗(yàn)也可通過進(jìn)一步水解體系優(yōu)化等手段逐步完善蝦青素酯水解反應(yīng)，彌補(bǔ)光、熱以及氮?dú)獬淙氩痪恍詫ξr青素的部分降解。

當(dāng)酶量添加量較多時(shí)，酶粉與底物充分接觸，1 h內(nèi)就可達(dá)到較高的水解率，隨著時(shí)間的延長，蝦青素酯仍可繼續(xù)降解，但后續(xù)降解速率逐漸變緩。當(dāng)酶量添加較少時(shí)，蝦青素的水解受到極大限制，在第12或第15小時(shí)可達(dá)到最大水解率，隨著時(shí)間的延長，生成的蝦青素也會(huì)受到環(huán)境因素的影響部分分解，19 h后部分曲線有下降趨勢 (圖4-d)。因此加酶量和時(shí)間對蝦青素酯的水解相互影響。只有當(dāng)加酶量到達(dá)一定限度時(shí)，水解反應(yīng)才能以較高速率進(jìn)行，且加酶量的增長可加速水解進(jìn)程。

3 結(jié)論

本研究克隆表達(dá)了來自淺紫色鏈霉菌的脂肪酶Sv-lip5，該酶的蛋白分子量約34.8 kD，比活力為12.46 U·g-1，在45 ℃、pH為10.0的條件下顯示出最佳酶活力，可用于蝦青素酯的水解，水解產(chǎn)物為游離蝦青素。該酶可耐堿性環(huán)境，從而避免了反應(yīng)過程中雜菌的生長，通過優(yōu)化反應(yīng)條件得出，當(dāng)乙醇與緩沖液體積比為1∶12、反應(yīng)pH為9.0、加酶量為900 mg、在40 ℃下反應(yīng)12 h，200 μg蝦青素酯最終可收獲147.48 μg游離蝦青素。