半滑舌鰨AKT-ineracting protein基因的克隆及免疫應(yīng)答表達(dá)分析

孫璐明于孟君陳亞東陳學(xué)杰劉 洋仇雪梅沙珍霞（.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連 6023； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 26607； 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266200； 4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 20306）

半滑舌鰨AKT-ineracting protein基因的克隆及免疫應(yīng)答表達(dá)分析

孫璐明1，2于孟君1，2陳亞東2，3陳學(xué)杰2，4劉 洋1仇雪梅1沙珍霞2，3
（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連 116023； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266071； 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266200； 4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

摘要：研究克隆了半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis膜蛋白AKT-interacting protein（AKTIP）基因，研究了其在健康組織中的表達(dá)模式、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染后免疫組織和不同病原物刺激外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)特征。通過常規(guī)克隆和RACE技術(shù)，獲得的半滑舌鰨AKTIP基因全長(zhǎng)cDNA序列為1224 bp，其中包括5′-UTR為116 bp，3′-UTR為117 bp和完整的ORF序列891 bp，編碼296個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（PI）為9.12，分子量是33.74 kD； 同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨AKTIP的氨基酸序列在不同物種之間具有較高的保守性； 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)到半滑舌鰨各個(gè)組織中均有AKTIP基因的表達(dá)，在卵巢中表達(dá)量最高； 鰻弧菌感染半滑舌鰨后，AKTIP基因在肝、鰓、血液、腸、頭腎和脾中均上調(diào)表達(dá)； 病原模擬物PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鰨外周血淋巴細(xì)胞均誘導(dǎo)AKTIP基因下調(diào)表達(dá)。研究表明半滑舌鰨AKTIP基因參與了機(jī)體免疫反應(yīng)，為給半滑舌鰨免疫防御技術(shù)的研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：半滑舌鰨； AKT-interacting protein基因； 基因克隆； 免疫應(yīng)答； 基因表達(dá)

AKT-interacting protien（AKTIP），又稱蛋白激酶B相互作用蛋白，是PI3K（磷酸肌醇3-激酶）/ PDK1（3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶）/ Akt信號(hào)通路中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的支架蛋白［1，2］，參與PI3K/PDK1/ Akt信號(hào)通路的調(diào)控，是介導(dǎo)Akt與其上游激酶PDK1相互作用的橋梁［3，4］，在動(dòng)物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要的作用，并參與許多生物學(xué)過程，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫防御等［5］。有文獻(xiàn)報(bào)道AKTIP也可以通過活化NF-kB 參與免疫調(diào)節(jié)［6］。到目前為止，僅有數(shù)篇關(guān)于AKTIP的研究文獻(xiàn)，大多集中在哺乳動(dòng)物和人中，但對(duì)AKTIP免疫方面的研究還不透徹，在魚類中至今沒有關(guān)于AKTIP的任何報(bào)道。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚類，病害問題特別是弧菌病對(duì)半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［7］。對(duì)半滑舌鰨免疫機(jī)制的研究有助于病害問題的解決。本研究擬對(duì)AKTIP基因的鑒定、表達(dá)及在免疫反應(yīng)中的應(yīng)答模式進(jìn)行分析，以期為半滑舌鰨病害防御提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

半滑舌鰨購自日照東鑫現(xiàn)代漁業(yè)技術(shù)研究所，魚為1.5齡左右，平均體重220 g，平均體長(zhǎng)30.6 cm。實(shí)驗(yàn)前將魚在24℃水箱中暫養(yǎng)7d，消除環(huán)境脅迫。鰻弧菌（Vibrio anguillarum）由本實(shí)驗(yàn)室保存，外周血淋巴細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得。

1.2 樣品采集

取3條健康半滑舌鰨進(jìn)行健康組織收集，分別采集后腎、腦、胃、脾、頭腎、心臟、鰓、血、肌肉、皮膚、肝、腸、卵巢13種組織，立即投入液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃分別保存，以備RNA提取。

鰻弧菌感染方法參照Sha等［8］略作修改:設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組用3.18×105CFU/g（半致死劑量，LD50）對(duì)半滑舌鰨進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組參照實(shí)驗(yàn)組注射與體重相應(yīng)劑量的PBS注射。在注射后0、6h、12h、24h、48h和72h各取3尾魚，取鰓、肝、腸、頭腎、脾、血液6種免疫組織，并立即投入液氮中，隨后將其轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中分別保存，用于提取總RNA。

分別用病原模擬物脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）、多聚胞甘酸（poly I:C）和葡聚糖（WGP）刺激6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種的半滑舌鰨外周血淋巴細(xì)胞，使終濃度分別為50、100、50和50 μg/mL，PBS組設(shè)為對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。感染30min后收集細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5min去除包含感染源的培養(yǎng)基，用Hank's緩沖液反復(fù)洗滌細(xì)胞，繼續(xù)用新鮮DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。分別收集感染0、2h、6h、12h和24h后的淋巴細(xì)胞到相應(yīng)的離心管中。離心后倒掉培養(yǎng)基并加入1 mL Trizol試劑（Invitrogen，美國(guó)），然后儲(chǔ)存在-80℃冰箱中，以備提取總RNA。

1.3 總RNA提取及cDNA的合成

使用試劑盒（Tiangen，中國(guó)）提取半滑舌鰨不同組織樣本的總RNA。提取方法參照試劑盒說明書。體外培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞RNA提取采用Trizol試劑提取。總RNA使用Agilent 2100生物分析儀（Applied Biosystems，美國(guó)）檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，RNA的完整性用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)。按照PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa，大連）試劑盒合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 半滑舌鰨AKTIP基因cDNA序列的獲得

通過對(duì)半滑舌鰨轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選了AKTIP基因部分cDNA序列，并對(duì)該序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物P1、P2和P3、P4（表 1），以半滑舌鰨總cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化連接轉(zhuǎn)化后，對(duì)產(chǎn)生的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。在克隆獲得的序列3′端設(shè)計(jì)RACE（Rapid-Amplification of cDNA Ends）引物P5（表1）和巢式特異性引物P6（表1），使用Clontech公司的SMARTTerTMRACE cDNA Amplification Kit 試劑盒獲得該基因的3′端序列，將克隆的序列進(jìn)行拼接獲得AKTIP基因的cDNA全長(zhǎng)序列。

1.5 生物信息學(xué)分析

對(duì)克隆獲得的cDNA進(jìn)行BLASTX（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov）比對(duì)，利用ORF Finder軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預(yù)測(cè)該基因的ORF，利用Expasy軟件（http://www.expasy.org/）預(yù)測(cè)其氨基酸序列，蛋白的理化特性預(yù)測(cè)使用Protparam（http://au.expasy.org/tools/protparam.html），采用Clustal X軟件對(duì)不同物種AKTIP 基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，利用MEGA 5.1構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.6 半滑舌鰨AKTIP基因?qū)崟r(shí)定量分析

表 1 PCR擴(kuò)增所用的特異性引物Tab.1 Specific primers used in this study

采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)AKTIP基因的表達(dá)特征?；贏KTIP保守區(qū)設(shè)計(jì)定量特異引物P7、P8（表 1），用半滑舌鰨18S rRNA基因作為內(nèi)參（表1）。在ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。健康組織中是相對(duì)肝組織做的相對(duì)定量分析，采用2-△△Ct法計(jì)算，Ct值取3個(gè)平行的平均值。使用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 半滑舌鰨AKTIP基因克隆及其序列特征

半滑舌鰨AKTIP基因經(jīng)過幾輪PCR擴(kuò)增獲得，將兩對(duì)特異性引物P1、P2和P3、P4擴(kuò)增克隆出的兩段序列和RACE獲得的序列經(jīng)過拼接，獲得AKTIP基因完整的cDNA序列，全長(zhǎng)為1224 bp，其中包含5′-UTR為116 bp，3′-UTR為117 bp和完整的開放閱讀框（ORF）序列891 bp，GC含量是47.7%，共編碼296個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的AKTIP蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（PI）為9.12，分子量是33.74 kD。

2.2 半滑舌鰨AKTIP系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨AKTIP氨基酸序列與大西洋鮭（Salmo salar）（NP_00113339 4.1）、斑馬魚（Danio rerio）（NP_956399.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）（NP_001086693.1）、紅原雞（Gallus gallus）（NP_001005838.1）、美洲鷲（Cathartes aura）（KFP53204.1）、大鼠（Rattus norvegicus）（NP_001011926.1）、小鼠（Mus musculus）（NP_00 1289197.1）、恒河猴（Macaca mulatta）（AFJ71 159.1）、人（Homo sapiens）（NP_001012398.1）的 AKTIP氨基酸序列相似性分別為89%、88%、77%、77%、77%、76%、76%、76%和75%。利用MEGA5.1軟件對(duì)上述各個(gè)物種的AKTIP氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖 1）。結(jié)果表明，AKTIP被分為兩個(gè)大的分支，半滑舌鰨與大西洋鮭（NP_001133394.1）、斑馬魚（NP_956399.1）AKTIP聚為一支，兩棲類非洲爪蟾（NP_001086693.1）與紅原雞（NP_001005838.1）、大鼠（NP_0010 11926.1）和人（NP_001012398.1）等的AKTIP聚為一支，但哺乳動(dòng)物、鳥類和兩棲類又按親緣關(guān)系遠(yuǎn)近都聚成相應(yīng)的亞類。

2.3 AKTIP基因在半滑舌鰨健康組織表達(dá)特異性分析

采用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析了AKTIP基因在半滑舌鰨不同健康組織中的表達(dá)特征（圖 2）。結(jié)果顯示:AKTIP基因在健康半滑舌鰨的后腎、腦、胃、脾、頭腎、心臟、鰓、血、肌肉、皮膚、肝、腸、卵巢組織中均有表達(dá)，表達(dá)量由低到高，AKTIP的相對(duì)表達(dá)量在卵巢組織（17.01）中最高，其次是腸（1.24）和肝（1.02），在后腎和腦中的表達(dá)量低（后腎0.21、腦0.24）。AKTIP在不同組織中表達(dá)存在組織差異性。

2.4 AKTIP在半滑舌鰨感染鰻弧菌后免疫組織中的表達(dá)特征

圖 1 AKTIP基因家族氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

鰻弧菌感染半滑舌鰨后可誘導(dǎo)AKTIP在免疫組織中的表達(dá)變化，在PBS對(duì)照組和感染組感染0、6h、12h、24h、48h、72h后，AKTIP在肝臟、腸、頭腎、脾臟、血液和鰓6種組織中的表達(dá)水平如圖 3所示。AKTIP在腸中的表達(dá)量為6h最低，隨后迅速升高，48h是0的1.5倍，總體趨勢(shì)為先降低又升高再降低； 在脾中表達(dá)峰值出現(xiàn)在鰻弧菌感染后48h，是初始表達(dá)量的1.77倍，其總體表達(dá)趨勢(shì)為隨著感染時(shí)間表達(dá)量先降低又升高隨后下降； 在鰓中的表達(dá)變化是6h降到最低，然后一直升高，72h達(dá)到最高，其表達(dá)量是初始值的2.77倍； 在血中表達(dá)量是隨著感染時(shí)間表達(dá)量表現(xiàn)為先下降后升高，在24h出現(xiàn)最高值，是0表達(dá)量的1.3倍，然后又降低；在頭腎中也是隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量先降低后升高，12h表達(dá)極低然后迅速升高，在24h出現(xiàn)峰值后又降低，24h表達(dá)量是初始值的2.24倍； 肝中AKTIP在12h的表達(dá)量極低，最后在72h達(dá)到峰值，其表達(dá)量是初始表達(dá)量的5.33倍。以上數(shù)據(jù)表明，鰻弧菌感染半滑舌鰨后，可誘導(dǎo)AKTIP在腸、脾、血、鰓、肝臟和頭腎中表達(dá)上調(diào)。

圖 2 AKTIP基因在半滑舌鰨健康組織中的實(shí)時(shí)定量表達(dá)

2.5 AKTIP在半滑舌鰨外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)

病原模擬物L(fēng)PS、poly I:C、PGN、WGP分別刺激半滑舌鰨外周血淋巴細(xì)胞后，AKTIP基因的實(shí)時(shí)定量表達(dá)結(jié)果如圖 4所示，LPS對(duì)其誘導(dǎo)的表達(dá)趨勢(shì)為:先是持續(xù)下降，在12h稍有升高，然后再下降，24h的表達(dá)量是0 的0.28倍； 在PGN的誘導(dǎo)下表現(xiàn)2h先降低，其表達(dá)量是0的0.71倍，然后有緩慢升高，但總體是下降趨勢(shì)； Poly I:C的誘導(dǎo)表達(dá)表現(xiàn)為先略有升高，2h的表達(dá)量與0相當(dāng)，然后持續(xù)下降，24h 的表達(dá)量是0的0.40倍； WGP的誘導(dǎo)表達(dá)趨勢(shì)為:先降低，從6h后趨于平緩，6h的表達(dá)量是0的0.59倍。總體上，四種病原模擬物L(fēng)PS、poly I:C、PGN、WGP對(duì)AKTIP在半滑舌鰨淋巴細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)趨勢(shì)非常相似，都呈下調(diào)表達(dá)。

3 討論

AKTIP是PI3K/PDK1/Akt信號(hào)通路的支架蛋白，AKTIP可直接或通過與PDK1的相互作用間接作用于蛋白激酶B（PKB/Akt），通過增強(qiáng)Akt的磷酸化調(diào)節(jié)Akt的活性，從而參與PI3K/PDK1/Akt信號(hào)通路的調(diào)控［4］，AKTIP作為Akt活性的調(diào)控蛋白，在PI3K/PDK1/Akt信號(hào)通路的調(diào)控中起關(guān)鍵性作用；有研究表明AKTIP也參與動(dòng)物的多種免疫防御過程［5］，通過磷酸化Akt活化IkB激酶（IKKα），使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)中釋放出來進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)下游基因的調(diào)控，從而參與調(diào)節(jié)大量關(guān)鍵的生理過程，如細(xì)胞增殖［9］、凋亡［10］、固有免疫和適應(yīng)性免疫［11，12］?？梢夾KTIP通過調(diào)節(jié)Akt活性參與免疫防御等多種生物學(xué)過程。但是到目前為止，AKTIP的確切作用機(jī)制還沒有被闡明。

本研究首先克隆獲得半滑舌鰨AKTIP的cDNA全長(zhǎng)，并利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)AKTIP在半滑舌鰨健康組織、感染后的各個(gè)組織和感染后淋巴細(xì)胞中的表達(dá)譜，以期為探討AKTIP在半滑舌鰨機(jī)體中的免疫機(jī)制提供理論依據(jù)。研究結(jié)果表明AKTIP在半滑舌鰨各個(gè)健康組織中均有表達(dá)，在卵巢中的表達(dá)最高，在肝和腸中的表達(dá)相對(duì)其他組織也較高，推測(cè)其可能在免疫調(diào)控以及免疫細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮及其重要的作用。鰻弧菌感染半滑舌鰨72h內(nèi)，AKTIP在肝、腸、鰓、頭腎、血和脾組織中均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的情況，說明AKTIP在病原入侵后參與了機(jī)體的免疫應(yīng)答，半滑舌鰨被鰻弧菌感染后為了維持細(xì)胞活性，可能大量合成AKTIP基因抵抗細(xì)胞凋亡； 或者磷酸化Akt激活NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)各階段許多分子的調(diào)控［13］，這與Nakamura 等［14］研究結(jié)果相一致；LPS、PGN、poly I:C和WGP感染半滑舌鰨外周血淋巴細(xì)胞均誘導(dǎo)AKTIP下調(diào)表達(dá)，但PGN刺激后，AKTIP基因的變化幅度不大，poly I:C和WGP刺激引起的變化相當(dāng)，LPS誘導(dǎo)AKTIP基因表達(dá)變化倍數(shù)最大，說明外周血淋巴細(xì)胞AKTIP基因?qū)Σ煌拿庖咛娲锏拿庖邞?yīng)答具有特異性。

圖 3 鰻弧菌感染半滑舌鰨后AKTIP在腸、脾、血、鰓、頭腎和肝臟不同免疫組織不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)水平

AKTIP在半滑舌鰨各個(gè)組織均有表達(dá)，病原以及革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌等模擬物刺激后，其在免疫組織和免疫細(xì)胞中均出現(xiàn)差異表達(dá)，說明AKTIP在半滑舌鰨機(jī)體免疫中具有一定的重要作用。綜上所述，AKTIP參與了病原感染半滑舌鰨后機(jī)體免疫相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，本研究為探討AKTIP在半滑舌鰨機(jī)體內(nèi)重要的免疫作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。但總體來說在病原和模擬物處理后AKTIP基因的表達(dá)變化并不是很顯著，推測(cè)AKTIP基因在半滑舌鰨中只是間接參與了免疫應(yīng)答反應(yīng)，其在免疫中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討研究。

圖 4 AKTIP在PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鰨淋巴細(xì)胞中的表達(dá)

參 考 文 獻(xiàn)：

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AKT-INTERACTING PROTEIN GENE CLONING AND ITS EXPRESSION PROFILE IN RESPONSE TO PATHOGEN INFECTION IN HALF SMOOTH TONGUE SOLE（CYNOGLOSSUS SEMILAEVIS）

SUN Lu-Ming1，2，YU Meng-Jun1，2，CHEN Ya-Dong2，3，CHEN Xue-Jie2，4，LIU Yang1，QIU Xue-Mei1and SHA Zhen-Xia2，3
（1.College of Fishers and Life Sciences，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China； 2.Key Laboratory for Sustainable Development of Marine Fisheries，Ministry of Agriculture，Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China； 3.Laboratory for Marine Fisheries and Aquaculture，Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Qingdao 266200，China； 4.College of Fishers and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Abstract:AKT-interacting protien（AKTIP）is a kind of membrane protein，involvimg in the regulation of PI3K/PDK1/Akt pathway.AKTIP gene is still unknown in fish.In the present study，AKTIP gene of Cynoglossus semilaevis was first cloned and full length of cDNA was 1224 bp in size，including 5′-untranslated region（UTR）of 116 bp，3′-UTR of 117 bp and a complete open reading frame（ORF）of 891 bp，encoding 296 amino acids.Theoretical isoelectric point（PI）of predicted protein was 9.12 and molecular weight was 33.74 kD.Homologous comparison showed that the amino acids sequence of AKTIP in C.semilaevis had a high identity with those of other species.The AKTIP gene was expressed in all tested tissues in the health C.semilaevis and the highest expression was in the ovary.In order to investigate the expression patterns of the AKTIP gene in immune response，the specific expression of AKTIP was performed after Vibrio anguillarum infection and in peripheral blood lymphocytes with different pathogens stimulated.The results showed that the expression of AKTIP gene was up-regulated in the liver，gill，blood，intestinal，head kidney and spleen after V.anguillarum infection.While the AKTIP gene expression in peripheral blood lymphocytes was down-regulated after PGN，LPS，WGP and poly I:C stimulation.The research revealed that AKTIP gene involved in C.semilaevis immune response.These results provide the evidence to explore AKTIP defense mechanism and to control C.semilaevis disease in the further study.

Key words:Cynoglossus semilaevis； AKT-interacting protein； Gene clone； Immune response； Gene expression

中圖分類號(hào)：Q522

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0467-07

doi:10.7541/2016.62

收稿日期：2015-09-17；

修訂日期：2016-01-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2012AA10A401-4）； 國(guó)家自然科學(xué)基金（31172439）資助［Supported by the National High Technology Research and Development Program of China（863 Program）（2012AA10A401-4）； the National Natural Science Foundation of China（31172439）］

作者簡(jiǎn)介：孫璐明（1990—），女，山東臨沂人； 碩士研究生； 主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail:sunluming9966@163.com

通信作者：沙珍霞，女，研究員； 主要從事魚類分子免疫學(xué)、基因組學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究。E-mail:shazx@ysfri.ac.cn