赤眼鱒MyD88基因cDNA克隆與表達(dá)特性研究

王榮華李 偉肖調(diào)義，2劉巧林，2金生振周智愚（.湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)中心，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙 4028； 2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)調(diào)同創(chuàng)新中心，常德 45000）

赤眼鱒MyD88基因cDNA克隆與表達(dá)特性研究

王榮華1李 偉1肖調(diào)義1，2劉巧林1，2金生振1周智愚1
（1.湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)中心，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙 410128； 2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)調(diào)同創(chuàng)新中心，常德 415000）

摘要：實(shí)驗(yàn)使用RACE-PCR技術(shù)獲得了赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus）髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）的cDNA全長(zhǎng)，命名為ScMyD88。ScMyD88的cDNA全長(zhǎng)為1779 bp，其中開(kāi)放閱讀框855 bp，共編碼284個(gè)氨基酸殘基，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為33.053 kD，理論等電點(diǎn)為5.66。赤眼鱒MyD88具有典型的MyD88結(jié)構(gòu)特征，包括死亡結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域（Toll-IL-1 receptor domain，TIR），其氨基酸序列和鯉科魚(yú)類具有高度保守性，相似性達(dá)到了90%以上，特別是和武昌魚(yú)相比，相似性達(dá)到了98%。在檢測(cè)的9個(gè)赤眼鱒組織和器官中均有MyD88表達(dá)，其中肝臟、頭腎和體腎中表達(dá)水平最高，在腦中表達(dá)量最低。在草魚(yú)呼腸弧病毒（Grass carp reovirus，GCRV）感染初期（12h內(nèi)），MyD88在赤眼鱒免疫組織中表達(dá)水平急劇上升，特別是在脾臟和體腎中尤為明顯，隨后恢復(fù)正常水平。研究表明，MyD88在赤眼鱒抵抗GCRV入侵的免疫應(yīng)答反應(yīng)初期發(fā)揮了重要作用。

關(guān)鍵詞：赤眼鱒； 髓樣分化因子88（MyD88）； 基因克隆； 組織表達(dá)

Toll樣受體（Toll Like Receptors，TLRs）家族是脊椎動(dòng)物先天性免疫系統(tǒng)中一類重要的病原微生物模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs），能特異性識(shí)別病原微生物及其產(chǎn)物共有的一類或一群非特異性、高度保守的分子結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMP）［1］。TLRs家族識(shí)別PAMP后，TLRs通過(guò)MyD88（Myeloid differentiation factor 88）依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和非MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活機(jī)體免疫系統(tǒng)［2］。除TLR3和TLR22外，TLRs均可介導(dǎo)MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［3，4］，TLRs胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域（Toll-IL-1 receptor domain，TIR）通過(guò)招募My D88激活白介素相關(guān)受體激酶家族（Interleukin-1 receptor-associated kinases，IRAKs）如IRAK1、IRAK4，活化的IRAKs和腫瘤壞死因子受體相關(guān)受體6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）相互作用引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［5—7］，進(jìn)一步激活核因子（Nuclear factor-kap B，NF-κB）和促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs），誘發(fā)炎癥反應(yīng)［8，9］。

1990年，MyD88首次在小鼠髓樣細(xì)胞中克隆得到［10］，但是直到1997年，其功能特別是涉及TIR結(jié)構(gòu)域的信號(hào)傳導(dǎo)功能才發(fā)現(xiàn)［11］。目前MyD88已經(jīng)在人（Homo sapiens）［12］、小鼠（Rattus norvegicus）［13］、大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）［14］、中華鱉（Trionyx sinensis）［15］、鯉（Cyprinus carpio）［16］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［17］、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）［18］等中克隆及鑒定。MyD88由N端死亡結(jié)構(gòu)域（Death domain，DD）和C端TIR結(jié)構(gòu)域兩部分組成，TIR結(jié)構(gòu)域在TLRs和MyD88相互作用中發(fā)揮重要作用［19］，而DD結(jié)構(gòu)域主要功能是募集具有DD結(jié)構(gòu)域IRAKs家族如IRAK1，IRAK2，IRAK4等［20—22］，在死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等方面具有重要的作用［23］。

赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus），俗稱野草魚(yú)，屬于鯉形目，鯉科，雅羅魚(yú)亞科，赤眼鱒屬［24］。赤眼鱒具有抗病性強(qiáng)的特點(diǎn)，迄今為止，尚未見(jiàn)赤眼鱒暴發(fā)性疾病的報(bào)道。近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，赤眼鱒具有比草魚(yú)更好的抵抗草魚(yú)呼腸弧病毒（Grass carp reovirus，GCRV）入侵的特性［25—27］，但是關(guān)于先天性免疫基因在赤眼鱒抵抗GCRV入侵中的作用研究相對(duì)較少，彭慧珍等［28］獲得了赤眼鱒Mx基因cDNA全長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)其參與了赤眼鱒抗 GCRV-104病毒的免疫反應(yīng)。MyD88作為連接TLRs家族和免疫系統(tǒng)的橋梁，克隆MyD88基因并探討其結(jié)構(gòu)特性和表達(dá)特性，對(duì)解析TLRs家族在機(jī)體先天性免疫反應(yīng)中的作用至關(guān)重要。因此，本文克隆了赤眼鱒MyD88（ScMyD88）基因的cDNA 全長(zhǎng)，并對(duì)其的結(jié)構(gòu)特性和GCRV感染后赤眼鱒免疫組織（肝、脾、頭腎、體腎）中MyD88的表達(dá)特性進(jìn)行研究，以期為深入了解赤眼鱒 MyD88 的基因結(jié)構(gòu)、功能以及其在TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用機(jī)制奠定分子基礎(chǔ)，同時(shí)也可為草魚(yú)抗病毒新品種的選育提供部分基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

赤眼鱒（13.5±2.2）cm由湖南省瀏陽(yáng)市烏龍漁場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)前于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1個(gè)月，水溫控制在（28±1）℃，每天按實(shí)驗(yàn)魚(yú)體重的2%投喂。GCRV-106 由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所魚(yú)類病害研究室惠贈(zèng)。

1.2 方法

總RNA提取及cDNA合成 取50—80 mg的赤眼鱒脾臟組織，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction（TaKaRa，China）提取總RNA，使用核酸蛋白儀檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性，完整性好且A260/A280值為1.8—2.0的總RNA用于下一步實(shí)驗(yàn)。

取2 μg總RNA，采用RevertAid? First Strand cDNA Synthesis（Fermentas，USA）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，利用oligo（dT）18引物合成cDNA第一鏈，用于中間序列克隆和熒光定量分析。

ScMyD88基因cDNA全長(zhǎng)克隆 中間序列的獲得:參考GenBank中已有的物種特別是鯉科魚(yú)類的MyD88序列，使用primer6.0和oligo7.0設(shè)計(jì)引物。使用引物MyD88F和MyD88R以ScMyD88基因cDNA為模板擴(kuò)增ScMyD88中間序列，1.2%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，切膠回收，克隆至pMD19-T載體（TaKaRa，China），送上海生工生物有限公司測(cè)序。

3′末端序列獲得:根據(jù)已獲得的ScMyD88中間序列，設(shè)計(jì)MyD3′PF和MyD3′NPF上游巢式PCR反應(yīng)引物，其中MyD3′PF位于MyD3′NPF的上游。cDNA合成使用3′RACE Olig（T）-Adaptor引物，第一次PCR反應(yīng)使用MyD3′PF和3′RACE Adaptor為引物，擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3min； 94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，共20個(gè)循環(huán)； 72℃延伸10min。產(chǎn)物稀釋50倍后，用MyD3′NPF和3′RACE Adaptor做巢式PCR，反應(yīng)條件同上。PCR產(chǎn)物切膠回收后，克隆至pMD19-T載體，送上海生工生物有限公司測(cè)序。

5′末端序列獲得:根據(jù)已獲得的ScMyD88中間序列，設(shè)計(jì)MyD5′PF和MyD5′NPF下游巢式PCR反應(yīng)引物，其中MyD5′PF位于MyD5′NPF的下游。cDNA合成使用MyD5′PF特異性引物，將獲得的cDNA用DNA純化試劑盒（TaKaRa，China）純化，使用末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶（TaKaRa，China）對(duì)純化的cDNA末端加A。巢式PCR方法步驟同3′末端序列克隆。PCR產(chǎn)物切膠回收后，克隆至pMD19-T載體，送上海生工生物有限公司測(cè)序。

ScMyD88序列生物信息學(xué)分析 ScMyD88基因cDNA序列拼接使用DNAStar軟件模塊SeqMan 5.01； 序列的相似性使用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）分析； cDNA序列和氨基酸序列編輯使用DNAMAN7.0； 氨基酸序列分析使用蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)Expasy（http://www.expasy.org/），結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)使用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）；I-TASSER（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu）和PYMOL 軟件對(duì)3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析； 多序列比對(duì)使用Clustal X2.1； 使用MEGA6.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行1000 次自展檢驗(yàn)（bootstrap）評(píng)估進(jìn)化樹(shù)分支可信度。

ScMyD88的組織表達(dá)特性分析 隨機(jī)選擇3尾健康赤眼鱒，分別提取肝、脾、腎、頭腎、腦、心、肌肉、腸、鰓等組織總RNA，使用oligo（dT）18引物合成第一鏈cDNA后，選用β-actin基因最為內(nèi)參基因，用特異性熒光定量引物MyD88-RTF和MyD88-RTR擴(kuò)增MyD88的片段，β-actin基因的擴(kuò)增引物為Actin-RTF和Actin-RTR。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

GCRV感染后MyD88在赤眼鱒免疫組織表達(dá)水平研究 取180尾健康赤眼鱒，隨機(jī)分為6組，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚(yú)，實(shí)驗(yàn)組每尾魚(yú)腹腔注射200 μL GCRV病毒懸液，對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS，分別在0、6h、12h、24h、48h、72h、96h和120h提取3尾赤眼鱒肝，脾、腎和頭腎組織的總RNA，按Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以β-actin作為內(nèi)參基因，使用SYBR Green I染液在CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad，USA）進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為:10 μL SYBR Green PCR master mix（CWBIO，China），上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，9 μL稀釋后的cDNA模板，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10min； 95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 15s，35個(gè)循環(huán)； 溶解曲線程序?yàn)閺?5℃升溫至95℃，每5s增加0.5℃。數(shù)據(jù)收集和分析均使用CFX manager software 3.1（Bio-Rad，USA），作圖使用GraphPad Prism 6。

表 1 本文所用的引物序列Tab.1 The primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 赤眼鱒MyD88序列分析

ScMyD88基因cDNA全長(zhǎng)為1779 bp（GenBank登錄號(hào)為KR604719），包括5′ 端非編碼區(qū)域（Untranslated region，UTR）302 bp，ORF編碼區(qū)域855 bp和3′端非編碼區(qū)域622 bp，編碼284個(gè)氨基酸；其中3′UTR無(wú)終止信號(hào)，有不穩(wěn)定ATTTA結(jié)構(gòu)和保守的PloyA序列。ORF編碼區(qū)域共編碼284個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為33.053 kD，理論等電點(diǎn)為5.66。SMART結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ScMyD88具有典型的MyD88結(jié)構(gòu)特征，包含DD結(jié)構(gòu)域（DD，11-101aa）和TIR結(jié)構(gòu)域（TIR，148—284aa）（圖 1A）。KinasePhos磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件顯示ScMyD88包含3個(gè)蘇氨酸，2個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。使用 ExPASy在線分析中的 SOPMA 功能對(duì)赤眼鱒MyD88氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其中α 螺旋占全結(jié)構(gòu)的42.96%，延伸序列占19.72%，β折疊占9.15%，不規(guī)則卷曲占28.17%。使用I-TASSER 構(gòu)建的赤眼鱒MyD88蛋白3D結(jié)構(gòu)如圖 2B，ScMyD88共有11個(gè)α螺旋（α-helix）和3個(gè)β折疊（β-sheet），而3個(gè)β-折疊全部分布在TIR結(jié)構(gòu)域中（圖 1B）。

圖 1 ScMyD88基因的結(jié)構(gòu)特征

2.2 多序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

多序列比對(duì)結(jié)果顯示，赤眼鱒 MyD88 氨基酸序列和武昌魚(yú)MyD88一致性最高，達(dá)到了98%，和其他鯉科魚(yú)類（鯉、黑鯽、斑馬魚(yú)）的一致性也達(dá)到了90%以上，和哺乳動(dòng)物豚鼠、大猩猩、獼猴、人等同源性相對(duì)較低，一致性在59.5%—60.4%（表2）。硬骨魚(yú)類MyD88基因TIR結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)結(jié)果（圖 2）顯示，硬骨魚(yú)類MyD88基因TIR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列高度保守，同時(shí)赤眼鱒MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)高度保守的區(qū)域:Box 1（FDAFICY）； Box 2（LCVFDRDVLPG）； Box 3（FWTRL）。MyD88基因的TIR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與比對(duì)的魚(yú)類MyD88基因TIR結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)域Box 1和2氨基酸序列完全一致，box 3氨基酸序列和鯉科魚(yú)類完全一致，而和斑點(diǎn)叉尾鲖、虹鱒、條石鯛存在一個(gè)位點(diǎn)的突變。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果（圖 3）顯示，整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為兩支:硬骨魚(yú)類分支和哺乳動(dòng)物分支。在硬骨魚(yú)類中，淡水性魚(yú)類和海洋魚(yú)類分隔明顯； 赤眼鱒MyD88和武昌魚(yú)聚為一簇，鯉和黑鯽MyD88聚為一簇，整個(gè)鯉科魚(yú)類聚為一個(gè)亞支。

2.3 MyD88在赤眼鱒不同組織的表達(dá)

MyD88在赤眼鱒檢測(cè)的9個(gè)組織和器官中均有表達(dá)（圖 4），其中頭腎、肝臟、體腎中表達(dá)水平最高，鰓、脾臟、心臟中表達(dá)量次之，肌肉和腸中的表達(dá)水平較低，腦中表達(dá)量最低。

2.4 GCRV感染后MyD88在赤眼鱒免疫組織的表達(dá)水平變化

赤眼鱒人工感染GCRV初期（0—12h），其免疫組織中MyD88的表達(dá)量均表現(xiàn)出明顯的上調(diào)，特別是在脾臟和體腎中，MyD88的表達(dá)水平急劇增高（圖 5A，B，D），而在6h，頭腎中MyD88出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的情況（圖 5C）； 48h赤眼鱒免疫組織中MyD88的表達(dá)量基本恢復(fù)正常水平，在120h，4個(gè)組織中MyD88的表達(dá)水平均有上調(diào)的趨勢(shì)（圖 5）。

表 2 赤眼鱒MyD88氨基酸序列和其他物種的相似性比較Tab.2 Percentage identities in amino acid sequence of ScMyD88 with other species

3 討論

TLRs家族是目前研究最多的PRRs，其接頭蛋白MyD88也得到了廣泛的關(guān)注。目前，MyD88已在哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚(yú)類等多數(shù)動(dòng)物中得到克隆，且有研究發(fā)現(xiàn)，除TLR3和TLR22外，其他TLRs蛋白均可通過(guò)MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路向下游傳遞信號(hào)［9］。

本實(shí)驗(yàn)克隆了赤眼鱒MyD88的cDNA全長(zhǎng)，GenBank的登錄號(hào)為KR604719，編碼284個(gè)氨基酸。在鯉科魚(yú)類中，MyD88氨基酸序列具有高度的保守性，赤眼鱒MyD88氨基酸序列和武昌魚(yú)的相似性最高，達(dá)到了98%，和其他鯉科魚(yú)類（斑馬魚(yú)、鯉、黑鯽等）相似性也達(dá)到了90%以上。赤眼鱒MyD88具有典型的MyD88結(jié)構(gòu)特性，包含DD結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域。TIR結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ScMyD88基因TIR結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)保守區(qū)域box 1、2和3，且box 1和2的氨基酸序列在魚(yú)類中完全一致，box 3氨基酸序列和鯉科魚(yú)類完全一致，而和斑點(diǎn)叉尾鲖、虹鱒、條石鯛存在一個(gè)位點(diǎn)的突變。位點(diǎn)突變研究表明，box 1與2在MyD88和具有TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用中發(fā)揮重要作用，而box 3則通過(guò)與細(xì)胞骨架相互作用，參與受體的定位［29，30］。因此，推斷魚(yú)類MyD88在免疫調(diào)節(jié)方面的功能具有一定的相似性，同時(shí)也有一定的差異性。

圖 2 赤眼鱒MyD88基因TIR結(jié)構(gòu)域和其他魚(yú)類MyD88基因氨基酸序列比對(duì)

圖 3 赤眼鱒MyD88氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（ScMyD88加粗顯示）

對(duì)魚(yú)類MyD88研究結(jié)果顯示，MyD88在機(jī)體的各個(gè)組織中均有表達(dá)，但是不同物種，不同的組織其表達(dá)量存在差異［16，31，32］。Yao等［14］發(fā)現(xiàn)大黃魚(yú)MyD88在脾中表達(dá)最高； 歐洲鰻鱺MyD88在肝臟中表達(dá)量最高［33］； 鯉MyD88在鰓中表達(dá)水平最高［16］。在本研究中，MyD88在赤眼鱒各個(gè)檢測(cè)的9個(gè)組織中均有表達(dá)，且其在赤眼鱒頭腎、肝臟、體腎中表達(dá)水平最高，鰓、脾臟、心臟次之，肌肉和腸中的表達(dá)水平較低。

圖 4 赤眼鱒MyD88 的組織表達(dá)特性

圖 5 GCRV感染后MyD88在赤眼鱒肝、脾、頭腎和體腎中表達(dá)水平變化

MyD88在抗病原微生物先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重大作用，在抗細(xì)菌的先天性免疫方面，斜帶石斑魚(yú)［34］、歐洲鰻鱺［33］、大西洋鮭［35］等中均發(fā)現(xiàn)細(xì)菌病原相關(guān)分子模式（PNG、LPS）刺激后，其MyD88的表達(dá)水平要顯著升高； 病毒對(duì)MyD88表達(dá)的影響研究目前相對(duì)比較少，研究重點(diǎn)集中于病毒核酸類似物ploy（I:C）刺激后MyD88的表達(dá)水平變化。ploy（I:C）刺激后，除4h和12h外，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中MyD88表達(dá)水平低于對(duì)照組，而對(duì)蝦白斑病毒（雙鏈D N A病毒）能顯著提高凡納濱對(duì)蝦MyD88的表達(dá)量［36］； SAV3（單鏈RNA病毒）人工感染大 西洋鮭后，其脾臟組織中MyD88表達(dá)量在28d內(nèi)都保持在較高水平［35］。在本實(shí)驗(yàn)中，GCRV人工感染后，赤眼鱒免疫組織中MyD88表達(dá)量在感染初期（12h內(nèi)）顯著上調(diào)，而到48h后，恢復(fù)正常水平，與凡納濱對(duì)蝦和大西洋鮭應(yīng)對(duì)病毒刺激后的反應(yīng)不一致。這可能和刺激機(jī)體病毒的核酸類型不同相關(guān)，同時(shí)不同的TLRs家族成員其識(shí)別配體不同，且TLRs可通過(guò)MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和非MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活機(jī)體免疫系統(tǒng)。在病毒感染初期（12h內(nèi)），TLR2和TLR4識(shí)別病毒蛋白后［19］，通過(guò)MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路級(jí)聯(lián)信號(hào)擴(kuò)大向下游傳遞信號(hào)，故MyD88在12h內(nèi)赤眼鱒免疫組織中MyD88表達(dá)量顯著升高； 而病毒入侵細(xì)胞后，只有核酸進(jìn)入細(xì)胞，TLR7/8，9分別能識(shí)別單鏈RNA和DNA，通過(guò)MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路向下游傳遞信號(hào)［19］，因此，凡納濱對(duì)蝦和大西洋鮭MyD88在人工感染病毒后表達(dá)水平顯著升高，且保持較長(zhǎng)時(shí)間； 然而，GCRV是雙鏈RNA病毒，由TLR3和TLR22發(fā)揮識(shí)別作用，通過(guò)非MyD88依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路向下游傳遞信號(hào)［4］。因此，赤眼鱒免疫組織中MyD88的表達(dá)量回歸正常水平； 實(shí)際情況是否如此還需通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)克隆了赤眼鱒MyD88基因的cDNA全長(zhǎng)，且對(duì)其結(jié)構(gòu)和表達(dá)特性進(jìn)行了研究。赤眼鱒MyD88具有DD結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域，其在赤眼鱒肝、頭腎和體腎中表達(dá)量最高； 且GCRV感染前期（12h），MyD88在赤眼鱒肝、脾、體腎和頭腎中的表達(dá)水平顯著升高，提示MyD88在赤眼鱒抵抗GCRV入侵前期發(fā)揮了重要作用。

參 考 文 獻(xiàn)：

［1］Lester S N，Li K.Toll-like receptors in antiviral innate immunity［J］.Journal of Molecular Biology，2014，426（6）:1246—1264

［2］Rauta P R，Samanta M，Dash H R，et al.Toll-like receptors（TLRs）in aquatic animals:Signaling pathways，expressions and immune responses［J］.Immunology Letters，2014，158（1—2）:14—24

［3］Matsuo A，Oshiumi H，Tsujita T，et al.Teleost TLR22 recognizes RNA duplex to induce IFN and protect cells from birnaviruses［J］.Journal of Immunology，2008，181（5）:3474—3485

［4］Palti Y.Toll-like receptors in bony fish:From genomics to function［J］.Developmental & Comparative Immunology，2011，35（12）:1263—1272

［5］Moresco E M Y，LaVine D，Beutler B.Toll-like receptors［J］.Current Biology，2011，21（13）:488—493

［6］Kawai T，Akira S.Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity［J］.Immunity，2011，34（5）:637—650

［7］Wei Y C，Sun B B，Lu C L，et al.Prokaryotic expression and protein purification of the MyD88 gene in grouper Epinephelus coioides［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2014，38（1）:200—202［韋友傳，孫寶寶，陸專靈，等.斜帶石斑魚(yú)MyD88基因的原核表達(dá)及蛋白純化.水生生物學(xué)報(bào)，2014，38（1）:200—202］

［8］Nishiya T，Kajita E，Horinouchi T，et al.Distinct roles of TIR and non-TIR regions in the subcellular localization and signaling properties of MyD88［J］.FEBS Letters，2007，581（17）:3223—3229

［9］Kawai T，Akira S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors［J］.Nature Immunology，2010，11（5）:373—384

［10］Lord K A，Hoffman-Liebermann B，Liebermann D A.Nucleotide sequence and expression of a cDNA encoding MyD88，a novel myeloid differentiation primary response gene induced by IL6.［J］.Oncogene，1990，5（7）:1095—1097

［11］Wesche H，Henzel W J，Shillinglaw W，et al.MyD88:an adapter that recruits IRAK to the IL-1 receptor complex［J］.Immunity，1997，7（6）:837—847

［12］Hardiman G，Rock F L，Balasubramanian S，et al.Molecular characterization and modular analysis of human MyD88［J］.Oncogene，1996，13（11）:2467—2475

［13］Shang T，Ran F，Qiao Q，et al.Tanshinone ⅡA attenuates elastase-induced AAA in rats via inhibition of MyD88-dependent TLR-4 signaling［J］.Vasa-European Journal of Vascular Medicine，2014，43（1）:39—46

［14］Yao C，Kong P，Wang Z，et al.Molecular cloning and expression of MyD88 in large yellow croaker，Pseudosciaena crocea［J］.Fish & Shellfish Immunology，2009，26（2）:249—255

［15］Li X，Zhu B，Chen N，et al.Molecular characterization and functional analysis of MyD88 in Chinese soft-shelled turtle Trionyx sinensis［J］.Fish & Shellfish Immunology，2011，30（1）:33—38

［16］Kongchum P，Hallerman E M，Hulata G，et al.Molecular cloning，characterization and expression analysis of TLR9，MyD88 and TRAF6 genes in common carp（Cyprinus carpio）［J］.Fish & Shellfish Immunology，2011，30（1）:361—371

［17］Rebl A，Goldammer T，F(xiàn)ischer U，et al.Characterization of two key molecules of teleost innate immunity from rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）:MyD88 and SAA［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2009，131（1—2）:122—126

［18］Ren Q，Chen Y，Ding Z，et al.Identification and function of two myeloid differentiation factor 88 variants in triangle-shell pearl mussel（Hyriopsis cumingii）［J］.Developmental & Comparative Immunology，2014，42（2）:286—293

［19］Janssens S，Beyaert R.A universal role for MyD88 in TLR/IL-1R-mediated signaling［J］.Trends in Biochemical Sciences，2002，27（9）:474—482

［20］Akira S，Takeda K.Toll-like receptor signaling［J］.Nature Reviews Immunology，2004，4（7）:499—511

［21］Kawai T，Akira S.Signaling to NF-κB by Toll-like receptors［J］.Trends in Molecular Medicine，2007，13（11）:460—469

［22］West A P，Koblansky A A，Ghosh S.Recognition and signaling by toll-like receptors［J］.Annual Review of Cell and Developmental Biology，2006，22（1）:409—437

［23］Weber C H，Vincenz C.The death domain superfamily:a tale of two interfaces［J］？ Trends in Biochemical Sciences，2001，26（8）:475—481

［24］Li G F，Liu L B，Tan Y L，et al.In vitro effect of levamisole on the cell viability，phagocytosis and respiratory burst of Barbel chub（Squaliobarbus curriculus）macrophages［J］.Aquaculture Nutrition，2011，17（2）:263—270

［25］Liu Q L.Studies on genetic characteristics and grass carp reovirus resistance of F1hybrids between grass carp（Ctenopharyngodon idellus）and barbel chub（Squaliobar-bus curriculus）［D］.Thesis for Doctor of Science.Hunan Agriculture University，Changsha.2013［劉巧林.草魚(yú)與赤眼鱒雜交F1遺傳特征及對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒抗性的研究.博士學(xué)位論文，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙.2013］

［26］Peng H Z.Identification and analysis of Ctenopharyngodon idellus and Squaliobarbus Curriculus microRNA response to GCRV infection［D］.Thesis for Doctor of Science.Hunan Agriculture University，Changsha.2014［彭慧珍.感染GCRV草魚(yú)和赤眼鱒miRNA的鑒定與分析.博士學(xué)位論文，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙.2014］

［27］Wang H Q.Analyse immune characteristics of grass carp improved the resistance of GCRV［D］.Thesis for Doctor of Science.Hunan Agriculture University，Changsha.2014［王紅權(quán).基于GCRV抗性提高的草魚(yú)免疫特性分析.博士學(xué)位論文，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)沙.2014］

［28］Peng H Z，Liu M，Liu Q L，et al.Molecular cloning and tissue expression analysis of Mx gene in Squaliobarbus curriculus［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2014，38（6）:993—1001［彭慧珍，劉敏，劉巧林，等.赤眼鱒Mx 基因全長(zhǎng)cDNA克隆及其經(jīng)GCRV攻毒后的組織表達(dá)分析.水生生物學(xué)報(bào)，2014，38（6）:993—1001］

［29］Virtue A，Wang H，Yang X.MicroRNAs and toll-like receptor/interleukin-1 receptor signaling［J］.Journal of Hematology & Oncology，2012，5（1）:66

［30］Patnaik B B，Patnaik H H，Seo G W，et al.Gene structure，cDNA characterization and RNAi-based functional analysis of a myeloid differentiation factor 88 homolog in Tenebrio molitor larvae exposed to Staphylococcus aureus infection［J］.Developmental & Comparative Immunology，2014，46（2）:208—221

［31］Burns K，Martinon F，Esslinger C，et al.MyD88，an adapter protein involved in interleukin-1 signaling［J］.Journal of Biological Chemistry，1998，273（20）:12203—12209

［32］Janssens S，Burns K，Tschopp J，et al.Regulation of interleukin-1- and lipopolysaccharide-induced NF-kappaB activation by alternative splicing of MyD88［J］.Current Biology，2002，12（6）:467—471

［33］Yao Z G，F(xiàn)eng J J，Wang Y L，et al.Molecular cloning and immune function analysis of MyD88 gene in Anguill anguilla［J］.Journal of Fisheries of China，2015，39（3）:305—317［姚志剛，馮建軍，王藝?yán)?，?歐洲鰻鱺MyD88基因的克隆及其免疫功能分析.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2015，39（3）:305—317］

［34］Wei Y C，Gao Q，Chang M X，et al.Cloning and expression of MyD88 gene in orange-spotted grouper Epinephelus coioides［J］.Genomics and Applied Biology，2011，30（3）:288—295［韋友傳，高謙，昌明先，等.斜帶石斑魚(yú)MyD88基因的克隆與表達(dá).基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2011，30（3）:288—295］

［35］Skj?veland I，Iliev D B，Strandskog G，et al.Identification and characterization of TLR8 and MyD88 homologs in Atlantic salmon（Salmo salar）［J］.Developmental & Comparative Immunology，2009，33（9）:1011—1017

［36］Zhang S，Li C Z，Yan H，et al.Identification and function of myeloid differentiation factor 88（MyD88）in Litopenaeus vannamei［J］.PLoS One，2012，7（10）:47038

MOLECULAR CLONING，CHARACTERIZATION AND EXPRESSION OF MyD88 IN SQUALIOBARBUS CURRICULUS

WANG Rong-Hua1，LI Wei1，XIAO Tiao-Yi1，2，LIU Qiao-Lin1，2，JIN Sheng-Zhen1and ZHOU Zhi-Yu1
（1.Hunan Engineering，Technology Research Center of Featured Agnatic Resouces Utihzation，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China； 2.Collaborative Innouation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province，Changde 415000，China）

Abstract:The full cDNA sequence of Myeloid differentiation factor 88（MyD88）in the barbel chub Squaliobarbus curriculus（designated as ScMyD88）has been cloned by using RACE-PCRs method.The complete sequence of ScMyD88 cDNA was 1779 bp that contained 855 bp open read frame encoding 284 amino acid residues with calculated molecular weight of 33.053 kD and a theoretical isoelectric point（PI）of 5.66.The ScMyD88 protein has typical structural features of the MyD88 family with a Death domains and a TIR domain.According to the comparison with known MyD88 amino acid sequences，the putative protein of ScMyD88 showed the highest identities with cyprinid fishes（90%—98%）and other bony fishes（67%—74%）but low identities（60%）with mammalian.MyD88 expressed in all the nine tested tissues and organs with highly expressed in the liver，head kidney and trunk kidney，and lowly expressed in the brain.The ScMyD88 was obviously up-regulated in the immune tissue at 12h and returned to the normal level after 48h challenged with GCRV.These result showed that ScMyD88 might play important roles during the immune response of barbel chub against GCRV.

Key words:Squaliobarbus curriculus； Myeloid differentiation factor 88（MyD88）； Gene cloning； Tissue expression

中圖分類號(hào)：Q785； S965

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0459-08

doi:10.7541/2016.61

收稿日期：2015-06-09；

修訂日期：2015-11-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31272652）資助［Supported by the National Natural Science Foundation of China（31272652）］

作者簡(jiǎn)介：王榮華，男，湖南益陽(yáng)人； 博士； 主要研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物遺傳育種。E-mail:ronghua_201@163.com

通信作者：肖調(diào)義，教授； 主要研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物遺傳育種。E-mail:tyxiao1128@163.com