雛番鴨基因IX型禽1型副黏病毒分離鑒定及F基因序列分析

傅光華，程龍飛，溫名根，施少華，陳翠騰，傅秋玲，陳紅梅，萬春和，劉榮昌，林群群，黃　瑜

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州350013；2.福建省禽病防治重點實驗室，福建福州350013；3.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建福州350013；4.江西省吉安縣畜牧獸醫(yī)局，江西吉安343100）

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雛番鴨基因IX型禽1型副黏病毒分離鑒定及F基因序列分析

傅光華1，2，3，程龍飛1，2，3，溫名根4，施少華1，2，3，陳翠騰1，2，3，傅秋玲1，2，3，陳紅梅1，2，3，萬春和1，2，3，劉榮昌1，2，3，林群群1，黃瑜1，2，3

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州350013；2.福建省禽病防治重點實驗室，福建福州350013；3.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建福州350013；4.江西省吉安縣畜牧獸醫(yī)局，江西吉安343100）

摘要：自發(fā)病死亡雛番鴨中分離到一株（XBT14株）基因Ⅸ型禽1型副黏病毒，該病毒可引起雛鴨明顯神經(jīng)癥狀及急性死亡，致死率達44.4%；病毒融合（F）蛋白裂解位點處具有強毒株特有的多堿性氨基酸序列（112RRQRR↓F117），與GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)布的基因IX型毒株核苷酸序列同源性高達99.7%～99.9%，與基因VII型毒株核苷酸序列同源性為85.5%～86.6%。該分離株與近來報道的GD09-2等基因IX型毒株處于同一進化分支。以上結(jié)果表明對水禽致死性的禽1型副黏病毒呈現(xiàn)基因型多樣性，水禽禽1型副黏病毒病的防控日益嚴峻。

關(guān)鍵詞：雛番鴨；禽1型副黏病毒；基因Ⅸ型；分離鑒定；F基因

禽1型副黏病毒（Avian Paramyxovirus type 1，APMV-1）又被稱為新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），是禽類最為重要的烈性傳染性病病原之一。APMV-1可感染鳥目中大多數(shù)的物種，其中以火雞、雞及鴿子最易感[1]。盡管所有AP?MV-1分離株均為同一個血清型，但不同毒株間有顯著遺傳差異性。根據(jù)病毒基因組長度及核酸序列可將現(xiàn)有的APMV-1分成I類和II類（Class I和Class II），I類分離毒株多為低毒力毒株?；诓《綟基因47-421位核酸序列差異的遺傳進化分析，II類病毒可分為11種基因型（基因I-XI型）[2]?；騃X型APMV-1最早于1946年在中國雞群中分離獲得，其代表毒株是F48E8毒株。近年來該基因型的病毒在雞群和鴨群中的分離報道日漸增多[2-4]，此外在野生鳥類也分離報道[5]，不同毒株的致病性差異明顯。本研究室對分離自某肉鴨場17日齡病死番鴨的一株基因IX 型APMV-1進行了血清學(xué)鑒定及病原RT-PCR鑒定，并測定了該病毒毒力及毒力相關(guān)基因序列，為深入了解基因Ⅸ型APMV-1的生物學(xué)特性及基因組分子特征提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實驗動物和血清等9日齡SPF雞胚及1日齡SPF雞，購自福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司；7日齡雛番鴨，購自非免疫種鴨場，經(jīng)檢測APMV-1及其抗體均為陰性；禽流感病毒（H5、H7和H9亞型）、APMV-1標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，減蛋綜合征病毒高免血清由本實驗室制備保存?；騐II型APMV-1鴨源分離株FP1/02由本研究室分離保存。

1.2主要試劑DNA/RNA抽提試劑盒、Fast Pfu DNA聚合酶，購自全式金生物技術(shù)有限公司，Su?perscript III反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Invitrogen公司，PCR產(chǎn)物回收試劑盒，購自QIAGEN公司。

1.3樣品處理及病毒分離無菌采集發(fā)病鴨胰腺和肝臟，按常規(guī)方法[6]制備成含抗生素的懸液后，接種9日齡SPF雞胚，無菌收集24～120 h死亡雞胚尿囊液，分別在37℃和4℃下測定病毒對雞紅細胞、鴨紅細胞、綿羊紅細胞的血凝活性，病毒保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4病毒的鑒定參照文獻[6]進行微量血凝（HA）測定，然后以4個血凝單位的分離毒分別與NDV陽性血清，AIV H5亞型、H7亞型、H9亞型陽性血清及EDSV-76等標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進行微量血凝抑制試驗（HI）。參照DNA/RNA抽提試劑盒說明書提取樣品含毒尿囊液核酸，以此作為模板進行病原檢測。參照文獻[7]對樣品檢測番鴨細小病毒、小鵝瘟病毒、產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒、鴨瘟病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鴨甲肝病毒、鴨坦布蘇病毒和鴨呼腸孤病毒。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠純化后，回收PCR產(chǎn)物直接送生工上海生物工程有限公司進行測序。

1.5病毒毒力及雛鴨致病性測定參照OIE于2012年頒布的APMV-1毒力評估標(biāo)準(zhǔn)方法，測定毒株XBT14對1日齡SPF雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI），以此評估該毒株的毒力[8]。7日齡番鴨75只隨機分成3組，每組25只，攻毒組雛鴨通過肌注途徑分別接種0.5 mL毒株XBT14d或毒株FP1/ 02（含病毒5×106EID50）；對照組鴨通過肌注途徑接種無菌PBS緩沖液，0.5 mL/只。各試驗組動物進行隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d，每天對各組動物進行觀察，及時記錄其發(fā)病情況、臨床癥狀及剖檢病變。

1.6病毒融合（F）蛋白序列測定與分析運用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GenBank上已發(fā)布的基因IX型禽1型副黏病毒F48E8毒株（FJ436302），GD09-2毒株（HQ317394）和JS/1/97/Ch（FJ436305）基因組序列，設(shè)計F基因特異性擴增引物，上游為：5′-GTT AGC TCA CCT GTC TAT CGA GT-3′；下游為：5′-TCA CCC AAA TCC GGT AGT T-3′。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

按照DNA/RNA抽提試劑盒使用說明提取病毒RNA，用6堿基隨機引物按照Transcript III試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成第一互補鏈cDNA，獲得的cDNA用1.6.1設(shè)計的引物進行序列擴增。反應(yīng)程序參照Liu等[2]提供方法進行，PCR產(chǎn)物直接送至生工上海生物工程公司測序。應(yīng)用Lasergene 7.0軟件對該病毒基因片段測定結(jié)果進行拼接編輯。使用Lasergene 7.0軟件分析擴增的F基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的分子特征等；采用MEGA 4.1軟件包中NJ程序分析XBT14株F基因與GenBank已發(fā)布的47株不同基因型的APMV-1的F基因序列同源性、遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2　結(jié)果

2.1病毒的分離鑒定病料接種SPF雞胚48 h后開始出現(xiàn)死亡，死亡雞胚胚體全身出血，肝臟腫大、表面散布出血點，至96 h后5枚雞胚全部死亡。該分離毒可凝集雞、鴨和綿羊紅細胞，HA效價分別為25，26和25；血清學(xué)試驗表明，該病毒血凝活性可被APMV-1標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制，HI效價為27，而不被其他陽性血清所抑制；經(jīng)PCR檢測為APMV-1。

2.2XBT14毒株毒力及對鴨致病性結(jié)果表明XBT14毒株對1日齡SPF雞的ICPI值為1.67，參照OIE 2012頒布的毒力評估標(biāo)準(zhǔn)[8]，即當(dāng)分離毒株的ICPI介于1.5～2時，所測定毒株為強毒力AP?MV-1，毒株XBT14為強毒力毒株。雛番鴨接種XBT14后40 h～48 h出現(xiàn)強直性顫抖及偏癱等神經(jīng)癥狀，60 h后陸續(xù)出現(xiàn)死亡。剖檢病死番鴨可見胰腺表面散布大量針尖狀白色壞死點或出血點，腸粘膜、腦膜等出血明顯，14 d后25只番鴨死亡了12只，死亡率為44.4%?；騐II型分離株FP1/02感染雛鴨后引起的臨床癥狀與病理變化與XBT14株相似，但雛鴨致死率較XBT14株高，為55.6%。

表1　不同基因型禽1型副黏病毒F基因序列比對分析　（%）

2.3病毒F基因序列特征克隆獲得的XBT14毒株F基因組全長1 792 nt，與GenBank中發(fā)布的基因IX型其他毒株進行比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)基因的起始序列為ACGGGTAGAA，終止序列為TTAAGAAAAAA，這與基因IX型其他分離株相同。F基因開放閱讀框架為1 662 nt，編碼553個氨基酸殘基，其蛋白裂解位點氨基酸序列為112 RRQRR↓F117，為強毒力毒株氨基酸基序，這與病毒毒力測定結(jié)果一致。應(yīng)用SignalP 4.0和TMHMM Server V2.0對F基因推導(dǎo)氨基酸序列分析表明，該蛋白的前31個氨基酸序列（1-31aa）為蛋白的信號肽序列，503-525位的氨基酸殘基構(gòu)成了該病毒的跨膜錨定區(qū)。在F蛋白胞外區(qū)存在5個潛在的糖基化位點（85NRT87，191NNT193，366NTS368，447NIS449，471NNS473），F(xiàn)蛋白151-171位的氨基酸殘基序列（ILRLKESIAAT?NEAVHEVTDG）是APMV-1高度保守的具有中和活性的抗原表位[9]。

2.4序列同源性、遺傳距離及系統(tǒng)進化分析將XBT14株與GenBank已發(fā)布的47株不同基因型APMV-1的F基因進行比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株與GD09-2等基因IX型毒株的F基因核苷酸及氨基酸序列同源性均在99.6%以上，各毒株間的遺傳距離僅為0.2%；與II類APMV-1其他基因型毒株F基因核苷酸同源性在85.5%～92.9%之間，氨基酸同源性在90.2%～95.4%之間，其中與早期基因型（III型和IV型）毒株的核苷酸序列同源性在91.6%～91.9%之間，遺傳距離均為8.3%，與基因II型的疫苗毒La Sota株F基因核苷酸同源性為87.8%，與晚期基因型（如Ⅶ型）毒株的核苷酸同源性最低，僅在85.5%～86.6%之間，遺傳距離為14.4%；與I類APMV-1 F基因核苷酸同源性在69.2%～70.0%之間，遺傳距離則高達27.4%，不同基因型APMV-1 F基因序列比對分析詳見表1。

基于XBT14株及47株病毒F基因47-420nt區(qū)域片段的系統(tǒng)進化分析表明，XBT14毒株與GD09-2等IX型的毒株處于同一個系統(tǒng)進化分支，與基因I -IV型的早期基因型（Early genotype）病毒株共同構(gòu)成一個大的遺傳進化分支，而基因V-VIII型等晚期基因型（Late genotype）毒株則構(gòu)成了另外一個遺傳進化分支（見圖1）。

圖1　APMV-1 F基因的系統(tǒng)進化分析

3　討論

目前OIE采用病毒對1日齡SPF雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）和病毒F基因裂解位點的氨基酸序列等指標(biāo)來評價所分離的APMV-1毒力，強毒力毒株的F基因裂解位點為多堿性氨基酸序列，其ICPI指數(shù)均在1.5以上，即對1日齡SPF雞表現(xiàn)為高致病性[1]。有學(xué)者認為ICPI指數(shù)并不適合用于流行病學(xué)監(jiān)測過程中從健康家禽分離的AP?MV-1毒株毒力的評價[8]。現(xiàn)有研究表明，所有的基因Ⅸ型APMV-1分離株F基因裂解位點均為多堿性氨基酸序列，但大多數(shù)的分離株對鴨致病性不強[2-4]，對雞致病性也高低不一[2，3，5，10]。本研究所分離的番鴨源基因Ⅸ型毒株XBT14的F基因裂解位點為多堿性氨基酸序列，對1日齡SPF雞的ICPI值為1.67，仍然符合OIE的強毒力株判定標(biāo)準(zhǔn)，且動物實驗表明不僅可導(dǎo)致大量的雞急性死亡，還引起44.4%感染番鴨死亡，即對番鴨具有很強的致病性，致病性稍弱于同期感染的基因VII型毒株FP1/02。Zhang等[10]也報道1株基因IX型GD09-2毒株對北京鴨具有中等致病性，可引起北京鴨明顯的臨床癥狀及組織的病理變化，發(fā)病率達40%，病死率為10%。由此可見，當(dāng)前在鴨群中流行的APMV-1，除了基因VII型的毒株感染可引起鴨死亡外，部分基因IX型的毒株在遺傳演變過程中也逐步獲得了致死鴨的能力，這種致病性改變的分子基礎(chǔ)有待于進一步深入分析。Yu等[11]研究表明，低毒力的水禽源APMV-1在雞體內(nèi)連續(xù)傳代后可顯著增強病毒毒力，這就預(yù)示著AP?MV-1在自然界的雞群和鴨群中交叉往復(fù)傳播過程中會出現(xiàn)毒力和致病性發(fā)生變異的可能。在我國農(nóng)村雞、鴨和鵝混養(yǎng)的現(xiàn)象較為普遍，這為APMV-1發(fā)生適應(yīng)性變異提供了極為有利的生態(tài)條件。因此，加強家禽尤其是水禽中APMV-1的監(jiān)測，實時了解和掌握該病毒流行的優(yōu)勢基因型及其分子變異特點，對我國家禽禽1型副黏病毒病的防控極其重要。

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Identification of genotype IX avian paramyxovirus type-1 and sequenceanalysis of theviral fusion gene

FU Guang-hua1，2，3，CHENG Long-fei1，2，3，WEN Ming-gen4，SHI Shao-hua1，2，3，CHEN Cui-teng1，2，3，F(xiàn)U Qiu-ling1，2，3，CHEN Hong-mei1，2，3，WAN Chun-he1，2，3，LIU Rong-chang1，2，3，LIN Qun-qun1，HUANG Yu1，2，3

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350013，China；

2.Fujian Provincial Key Laboratory for Avian Diseases Control and Prevention，F(xiàn)uzhou 350013，China；3.Fujian Animal

Diseases Control Technology Development Center，F(xiàn)uzhou 350013，China；4.Bureau of Animal Husbandry and

Veterinary Medicine of Zhaosu County of Jiangxi，Ji′an 343100，China）

Abstract：Recently，an avian paramyxovirus type 1（APMV-1）strain XBT14 was isolated from a dead duck.Animal experi?ment showed that this isolate could cause obvious clinical signs with acute death in seven-day old Muscovy duckling，with a mortal?ity rate of 44.4% . Sequence analysis showed that Fusion gene of the strain XBT14 contains multiple basic amino acids（112 RRQRR↓F117）at the cleavage site that implies the high pathogenic characteristics of the virus isolate.Homology analysis showed that the XBT14 shared 99.7% to 99.9% nucleotide acid identity with those of genotype IX viruses，while shared 85.5% to 86.6% homology with those of genotype VII strains（the currently dominant genotype in poultry）. Phylogenetic analysis showed that the XBT14 strain was clustered with a genotype IX virus strain GD09-2.Our data indicate that the genotypic diversity of APMV-1 vir?ulent to waterfowl is increasing，and this will post a heavy threat on the disease prevention and controls.

Key words：duckling；avian paramyxovirus；genotype IX；isolation and identification；Fusion gene

中圖分類號：S852.65+9.5

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0006-04

收稿日期：2016-02-26

基金項目：國家自然科學(xué)基金（30972203）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-43）；福建省農(nóng)科院青年英才計劃項目（YC2015-13）；福建省農(nóng)科院“雙百”行動項目（sbmn1626，sb?mx160）

作者簡介：傅光華（1977-），男，副研究員，博士，主要從事動物病毒學(xué)研究，E-mail：fuyuan163@163.com

通訊作者：黃瑜，E-mail：huangyu_815@163.com

Corresponding author：HUANG Yu