鯽魚戴氏西地西菌的分離與鑒定

巴翠玉，趙福廣，張培軍，焦　雪，冷東澤，李月紅（.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林長春308；.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，吉林長春30000）

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鯽魚戴氏西地西菌的分離與鑒定

巴翠玉1，趙福廣1，張培軍2，焦雪1，冷東澤1，李月紅1
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林長春130118；2.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，吉林長春130000）

摘要：本試驗旨在從患病鯽魚的鰓、腎、肝、胰臟等病灶部位分離病原菌，并對其進行鑒定。采用革蘭染色的方法觀察其為短桿狀、呈單雙排列的革蘭陰性菌，利用美國BD公司生產(chǎn)的PhoenixTM100型全自動微生物分析儀進行生化鑒定及藥敏試驗分析，結(jié)果為戴氏西地西菌，對亞胺培南、美洛培南、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星等高度敏感；對氨曲南和頭孢唑啉耐藥性最強。并繪制了此菌的生長曲線，發(fā)現(xiàn)2～6 h進入對數(shù)期，對數(shù)期時間較早，22 h后就進入了穩(wěn)定期。后進行回歸試驗發(fā)現(xiàn)死亡率為66.7%，危害較大。因魚類中發(fā)現(xiàn)戴氏西地西菌較少，所以本文對于魚類戴氏西地西菌的研究有重要意義。

關鍵詞：鯽魚；戴氏西地西菌；藥敏試驗

戴氏西地西菌屬西地西菌屬，還包括奈氏西地西菌和拉氏西地西菌。戴氏西地西菌為革蘭陰性桿菌，大小為0.5～0.6 μm×1～2 μm，大多數(shù)菌株能運動，兼性厭氧。是一種條件致病菌，被從人類的尿液、膽汁、痰和血液中檢出，但是魚類中很少發(fā)現(xiàn)[1-3]。2011年熊祝嘉等[4]從患者尿液中檢測出戴氏西地西菌一例，可導致泌尿系感染，而造成間斷躁動6年，加重伴喘憋，呼吸困難等現(xiàn)象。Sevki Kayis等對土耳其-黑海區(qū)南方學院的虹鱒魚細菌進行調(diào)查，春天和夏天都各分離出了

1株戴氏西地西菌，其存在部位有腎臟、脾臟和肝、胰臟，這也證實了魚里面有戴氏西地西菌。本試驗從患病鯽魚中分離到1株戴氏西地西菌，進行藥敏試驗，篩選了防治藥物，為預防和治療戴氏西地西菌引起的鯽魚類疾病提供了一定的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料試驗魚，購自吉林省某漁場，鯽魚出現(xiàn)鰓出血，胸鰭和腹鰭基部及生殖口均出現(xiàn)充血，魚身出現(xiàn)不同的出血點及潰爛。剖檢死魚，發(fā)現(xiàn)鰓部發(fā)紅且有的鰓絲發(fā)白，腸道、肝胰臟、脾臟等處均出現(xiàn)充血癥狀。

1.2試驗儀器及試劑150G全溫振蕩培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、電熱恒溫鼓風干燥箱、超凈工作臺、722N可見分光光度計、革蘭染色試劑盒、美國BD公司PhoenixTM100自動細菌鑒定/藥敏檢測系統(tǒng)、4℃冰箱、微量移液器、試管、直徑90 mm平皿、醫(yī)用1 mL注射器、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、生理鹽水。

1.3方法

1.3.1病原菌的分離無菌的超凈工作臺剖檢患病鯽魚，取其鰓、肝、胰臟和腎臟等病灶部位，制成勻漿。將勻漿稀釋成不同濃度，微量移液器取200 μL勻漿涂布到麥康凱瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長狀態(tài)。挑取優(yōu)勢菌群劃線純培養(yǎng)，待菌落形態(tài)生長一致，挑取單菌落用80%甘油進行保藏。

1.3.2病原菌的鑒定

1.3.2.1革蘭染色法無菌條件下潔凈的載玻片滴少許生理鹽水，用接菌環(huán)將分離純化后的菌株均勻的涂布到載玻片上，干燥固定，后用結(jié)晶紫染液初染、碘液媒染、酒精脫色、番紅染液復染后鏡檢。

1.3.2.2生化鑒定用美國BD公司生產(chǎn)的Phoe?nixTM100型全自動微生物分析儀進行鑒定，鑒定板為革蘭陰性菌鑒定板，51孔，試驗周期15 h結(jié)束后觀察結(jié)果并分析。

1.3.2.3藥物敏感試驗用美國BD公司生產(chǎn)的PhoenixTM100型全自動微生物分析儀進行鑒定，鑒定板為革蘭陰性菌藥敏板，85孔，試驗周期15 h結(jié)束后觀察結(jié)果并分析。

1.3.2.4生長曲線的測定取-80℃保存的菌株，在超凈工作臺內(nèi)取100 μL菌液，加入到液體LB試管中，30℃，150 r/min，培養(yǎng)24 h后同樣方法進行傳代至第3代[5]。取第三代菌液100 μL，加入盛有100 mL液體LB的錐形瓶中，30℃，150 r/min條件下震蕩培養(yǎng)。設此時間為0 h，調(diào)分光光度計波長λ=600 nm。分別測定0、2、3、4、5、6、8、10、12h 和16、18、20、24 h各時段所對應的OD值。每個時段測定3個平行試樣[6]。

1.3.2.5回歸試驗試驗魚選用當年的鯽魚，購自吉林省金龍漁場。馴化7 d，選取體格健壯、規(guī)格整齊、游動活躍平均初體重為（98±0.01）g的鯽魚120尾，隨機分為4組，1組對照組，其余3組為試驗組。將4組魚同時放入相同水環(huán)境不同魚缸中(魚缸規(guī)格80 cm×60 cm×100 cm)。對照組每條魚注射無菌液體LB培養(yǎng)基0.5 mL，試驗組每條魚注射30℃，培養(yǎng)6 h的含致病菌的液體LB 0.5 mL。27℃水溫下飼養(yǎng)7 d，觀察，并記錄[7-8]。從死亡的病灶部位進行病原菌的再分離及鑒定。

2　試驗結(jié)果

2.1革蘭染色結(jié)果顯微鏡下可以觀察到紅色，短桿狀，呈單雙排列。結(jié)果表明該菌為革蘭陰性菌。從鯽魚鰓部、肝、胰臟和腎臟等部位分離的菌株具有相同特征。

2.2生化鑒定結(jié)果該菌與乙酸、Beta-葡二糖和葡萄糖等16項生化指標反應呈陽性，表明該菌能發(fā)酵或利用這些物質(zhì)；而與黏菌素、七葉苷和山梨醇等29項生化指標反應呈陰性。綜上所述，該菌鑒定為戴氏西地西菌，鑒定可信度為99%。

2.3藥物敏感試驗結(jié)果結(jié)果如表1可知該菌對亞胺培南、美洛培南和環(huán)丙沙星等高度敏感；對氨曲南和頭孢唑啉耐藥性最強。

表1　藥敏試驗

2.4生長曲線的測定結(jié)果根據(jù)0、2、3、4、5、6、8、10、12、16、18、20、24 h所測的菌液的OD值結(jié)果，取每組的平均值，繪制菌株OD值隨時間變化的關系圖（如圖1）。可看出該菌株2～6 h進入對數(shù)期，對數(shù)期時間較早，22 h后就進入了穩(wěn)定期。

圖1　菌株OD值隨時間變化的關系

2.5回歸試驗結(jié)果攻毒32 h后，鯽魚精神委頓，很少游動，減食或不食，48 h后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。試驗結(jié)束后，試驗組魚均出現(xiàn)不同數(shù)量的死亡，但對照組沒有任何死亡現(xiàn)象，結(jié)果如表2。死亡鯽魚主要癥狀為胸鰭和腹鰭基部及生殖口均出現(xiàn)充血現(xiàn)象。魚身出現(xiàn)不同的出血點及潰爛。剖檢死魚，鰓部發(fā)紅有的鰓絲發(fā)白，腸道、肝、胰、脾臟等處均出現(xiàn)充血癥狀。與之前的病魚完全吻合。根據(jù)上述革蘭染色反應及生理生化檢驗，得到細菌的特征與上述分離的溫和氣單胞菌的特征完全相符

表2　回歸試驗

3　討論

本試驗首次從發(fā)病鯽魚分離出戴氏西地西菌，該菌使鯽魚胸鰭和腹鰭基部及生殖口均出現(xiàn)充血現(xiàn)象。魚身出現(xiàn)不同的出血點及潰爛。剖檢死魚，鰓部發(fā)紅有的鰓絲發(fā)白，腸道、肝、胰、脾臟等處均出現(xiàn)充血癥狀。革蘭染色結(jié)果為紅色，是革蘭陰性菌，短桿狀大小為0.5～0.6 μm×1～2 μm。生化鑒定結(jié)果可知該菌與乙酸、Beta-葡二糖、L-色氨酸-AMC和葡萄糖等反應呈陽性，表明該菌能發(fā)酵或利用這些物質(zhì)；而與黏菌素、七葉苷、山梨醇和L-阿拉伯糖反應呈陰性?；貧w試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)其死亡率達66.7%，對魚類危害嚴重。本文對其進行了藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)其對亞胺培南、美洛培南、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星等高度敏；感，對氨曲南和頭孢唑啉耐藥性最強。與朱紅楠等[9]2002年在臨床檢驗雜志發(fā)表的痰液中檢出戴氏西地西菌1例的藥敏結(jié)果相符合。

本試驗致病菌最終鑒定為戴氏西地西菌。本文制作了它的生長曲線，為其后面的研究打下了基礎。并利用用美國BD公司生產(chǎn)的PhoenixTM100型全自動微生物分析儀進行藥敏分析，結(jié)果分離出幾種高度敏感的藥物，為減少該菌對鯽魚造成的危害提供實踐和理論基礎。因鯽魚感染戴氏西地西菌的發(fā)病機理及各方面的理論都不成熟，所以還需要進行進一步的探索。

參考文獻：

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[9]朱紅楠，趙永法.痰液中檢出戴氏西地西菌1例[J].臨床檢驗雜志，2002，03：160.

Isolation and identification of cedecea davisaeof crucian carp

BA Cui-yu1，ZHAO Fu-guang1，ZHANG Pei-jun2，JIAO Xue1，LENG Dong-ze1，LI Yue-hong1
（1.Jilin Agricultural University，Jilin 130118，China；2.Jilin Province Health Surveillance Inspection Center，Jilin 130000，China）

Abstract：The purpose of this experiment was to isolate and identify pathogenic bacteria from the gill，kidney and liver of the diseased crucian carp.Using Gram staining method，we observed the short rod and single and double arrangement of gram negative bacteria.And then we used American BD company production of PhoenixTM 100 type automatic microorganism analyzer to do biochemical identification and susceptibility test analysis.The results showed that it was cedecea davisae，which was highly sensitive to the imipenem，meropenem south，levofloxacin and ciprofloxacin，and resistant to aztreonam and cefazolin.And the growth curve of this strain was plotted，and it was found that after 2～6 h it entered the logarithmic phase，and the logarithmic phase was earlier，and then entered the stable period after 22 h.After the regression test, the mortality rate was found to be 50%.Since cedecea davisae is rarely found in fish，our findings have great significance.

Key words：crucian carp；cedecea davisae；drug sensitivity test Corresponding author：LI Yue-hong

中圖分類號：S965.117

文獻標志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0107-03

收稿日期：2015-08-12

基金項目：國家自然科學基金（30972191）；農(nóng)業(yè)部948項目農(nóng)業(yè)（2014Z34），長春市農(nóng)業(yè)先進實用技術的示范推廣項目（2013193）

作者簡介：巴翠玉（1992-），女，碩士生，研究方向為分子病原微生物學與分子免疫學，E-mail：bacuiyu@163.com

通訊作者：李月紅，E-mail：liyhong@sina.com