慢阻肺大鼠肺組織中樹突狀細(xì)胞表面因子的表達(dá)變化及CCL20抗體的干預(yù)作用

孫得勝，歐陽瑤，顧延會（.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科，貴州遵義 563003；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，衛(wèi)生部呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030）

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慢阻肺大鼠肺組織中樹突狀細(xì)胞表面因子的表達(dá)變化及CCL20抗體的干預(yù)作用

孫得勝1，2，歐陽瑤1，顧延會1
（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科，貴州遵義 563003；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，衛(wèi)生部呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030）

【摘要】目的 了解樹突狀細(xì)胞表面因子OX62、CD83在慢阻肺大鼠肺部的表達(dá)變化，并探討CCL20抗體的干預(yù)作用。方法 選用30只健康Wistar大鼠，隨機(jī)分為健康對照組（10只）、慢阻肺模型組（10只）、CCL20單抗組（10只），用氣道內(nèi)注入脂多糖（共2次）聯(lián)合煙霧刺激（約28 d）的方法誘導(dǎo)慢阻肺模型。在實(shí)驗(yàn)初始對單抗組大鼠以CCL20單克隆抗體腹腔注射一次。在第29天取大鼠的肺組織觀察其病理學(xué)改變，用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測肺部樹突狀細(xì)胞（DC）的表面因子OX62、CD83的表達(dá)變化。結(jié)果 模型組大鼠肺組織HE染色符合氣道炎癥和肺氣腫的表現(xiàn)，CCL20單抗組大鼠肺部病理表現(xiàn)比慢阻肺組明顯減輕。與健康對照組相比，慢阻肺模型組大鼠的肺組織中OX62的表達(dá)比對照組明顯增多（P＜0. 05），而在CCL20單抗組低于慢阻肺組（P＜0. 05）。慢阻肺模型組大鼠肺組織中CD83的表達(dá)比對照組少（P＜0. 05），而在慢阻肺組與CCL20單抗組之間則沒有明顯的差異（P＞0. 05）。結(jié)論 慢阻肺的發(fā)病可能與肺部OX62的表達(dá)增多及CD83的表達(dá)減少有關(guān)，使用CCL20單抗能部分地抑制這一效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】慢阻肺；樹突狀細(xì)胞；CCL20單抗；OX62；CD83

自1679年Bonet以“龐大容量的肺”描述慢性阻塞性肺疾?。ê喎Q慢阻肺，COPD）到近年GOLD （The Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，慢阻肺全球倡議）對慢阻肺最新定義的認(rèn)識，氣道和肺組織對有害氣體或顆粒的異常炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是其重要特征［1］，且越來越多的研究提示慢阻肺也可能是一種自身免疫性疾病［2］，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在其發(fā)病過程中有免疫細(xì)胞被募集到肺［3］。慢阻肺中的免疫應(yīng)答是在特定的抗原驅(qū)使下完成的［3－4］，同時(shí)它受到樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的嚴(yán)密調(diào)控［5－6］。DC環(huán)繞氣道形成敏感的防御體系，在外來抗原侵襲機(jī)體時(shí)，它們從完好的上皮組織移行到受侵襲的部位并攝取這些抗原［7］，DC表面受體在信號刺激下介導(dǎo)了此過程［8］。DC繼續(xù)遷移到局部引流淋巴結(jié)，提呈所攝取的抗原給相關(guān)的T細(xì)胞。相應(yīng)的炎癥反應(yīng)就是在這些T淋巴細(xì)胞的介導(dǎo)下發(fā)生的。DC的遷移是趨化作用的結(jié)果，在它們的趨化因子與相關(guān)的受體間的相互作用下完成［9］。CCL20是未成熟樹突狀細(xì)胞（immature DC，iDC）的主要趨化因子，當(dāng)氣道發(fā)生炎癥反應(yīng)的時(shí)候，表達(dá)于氣道上皮的CCL20大量增加［10］，它與受體間的相互作用被認(rèn)為是iDC被募集于氣道的一個(gè)可能的重要機(jī)制。

我們通過香煙煙霧刺激和氣道內(nèi)注入細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）制備大鼠慢阻肺模型，分別檢測DC的表面因子OX62和CD83在肺組織中的表達(dá)，并通過阻斷CCL20觀察抗CCL20干預(yù)對慢阻肺大鼠的治療效果。

1　材料和方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級Wistar雄性大鼠（共30只），鼠齡8周，體重200～220 g，由重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供【SCXK（渝）2014－0005】。二部法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒（上?；蚩萍脊荆∈罂勾笫驩X62單克隆抗體（美國R&D Systems公司），兔抗-CD83多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司），大鼠CCL20單克隆抗體（美國R&D Systems公司），羊抗鼠IgG-HRP（北京愛普華美生物科技公司），脂多糖（美國Sigma公司），香煙（黃果樹牌，煙氣煙堿1. 0 mg焦油11 mg一氧化碳量13 mg貴州中煙工業(yè)有限公司）。

1.2模型的建立

實(shí)驗(yàn)在遵義醫(yī)學(xué)院進(jìn)行【SYXK（黔）2014－003】將大鼠隨機(jī)分為健康對照組、慢阻肺模型組和CCL20單抗干預(yù)組（每組10只）。使用香煙煙霧刺激和氣道內(nèi)注入脂多糖的方法制備慢阻肺模型［11］：后兩組大鼠于第1天和第15天氣道內(nèi)注入脂多糖溶液（200 μg/200 μL）；第2～28天（第15天除外）于造模箱（由玻璃制成，25 cm×35 cm×80 cm，箱頂有直徑約2 cm的通氣孔，箱中部從下向上有兩排鐵網(wǎng)，鐵網(wǎng)間擺放并點(diǎn)燃香煙）內(nèi)被動吸煙（每天2次，每次燃12支香煙）。當(dāng)日2次被動吸煙造模間隔2 h，健康對照組不予上述處理。CCL20單抗組大鼠第1天注脂多糖前用CCL20單克隆抗體（100 μg/只）腹腔注射。

1.3標(biāo)本采集

第29天分別選取兩組大鼠麻醉后開胸，剪取左肺予多聚甲醛固定，制作石蠟標(biāo)本及病理切片，并行HE染色及免疫組化實(shí)驗(yàn)。取右肺各葉放入低溫冷凍管，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4指標(biāo)檢測

觀察模型組大鼠肺組織HE染色切片是否有慢支炎、肺氣腫的病理表現(xiàn)，CCL20單抗組的病理改變是否有所減輕。免疫組化實(shí)驗(yàn)的切片于光鏡下選陽性表達(dá)最強(qiáng)的5個(gè)視野，計(jì)算機(jī)采圖后輸入軟件IPWIN 60中分析，計(jì)算積分值光密度（IOD），每幅圖使用此軟件分析3次。在同一切片中隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，分別測得積分光密度值，以其平均值代表樣本中OX62或CD83的表達(dá)水平。

1.5數(shù)據(jù)分析

2　結(jié)果

2.1三組大鼠肺組織的病理表現(xiàn)

對照組：肺泡結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，未見炎性細(xì)胞浸潤，符合正常肺組織病理表現(xiàn)。慢阻肺模型組：肺泡間隔內(nèi)可看到毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，伴炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡間隔斷裂、融合，呈“慢支炎、肺氣腫”改變，符合慢阻肺的典型病理特點(diǎn)。CCL20單抗組：肺泡間隔增寬，伴有炎細(xì)胞浸潤，部分肺泡腔略擴(kuò)大，但病變程度明顯比慢阻肺組減輕（圖1）

圖1　肺組織病理表現(xiàn)（×10）Note：A（controls）；B（COPD models）；C（CCL20 monoclonal antibody treated group）.Fig. 1 Photomicrographs of haematoxylin and eosin stained lung tissue（×10）

2.2三組大鼠肺組織中OX62和CD83的表達(dá)

OX62和CD83的免疫組化陽性染色主要表達(dá)于DC的胞漿，廣泛分布于肺泡以及氣道周圍的相關(guān)淋巴組織和血管附近。慢阻肺模型組大鼠的肺組織OX62表達(dá)比對照組顯著增多（P＜0. 05），而CCL20單抗組的OX62表達(dá)比慢阻肺模型組顯著減少（P＜0. 05）。慢阻肺模型組大鼠的肺組織中CD83的表達(dá)比健康對照組顯著減少（P＜0. 05），而與CCL20單抗組相比，無明顯差異（P＞0. 05）（圖2/表1）

表1　OX62和CD83在三組大鼠肺組織中的表達(dá)（n =10）Tab. 1 Expression of OX62 and CD83 in lung tissues of rats in the three groups（n =10）

3　討論

慢阻肺是一種嚴(yán)重危及人類健康的氣道慢性炎癥性疾病，具有病程長、難治愈、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，以逐漸進(jìn)展、不完全可逆的氣流受限為特征［12］，吸煙和感染被公認(rèn)是引起它發(fā)生發(fā)展的最主要的環(huán)境因素。我們對大鼠進(jìn)行煙霧刺激并注射脂多糖誘發(fā)感染以模擬這種病理生理過程，4周后模型組大鼠肺組織病理表現(xiàn)與早期文獻(xiàn)報(bào)道一致［11－13］，符合慢阻肺肺組織的典型病理特點(diǎn)，CCL20單抗干預(yù)組大鼠肺組織的病理改變比慢阻肺模型組顯著減輕。

本實(shí)驗(yàn)顯示，慢阻肺模型組大鼠肺組織中DC的表面因子OX62的表達(dá)比對照組顯著增加。OX62是大鼠DC的標(biāo)志物［14］，CCL20是未成熟DC （immature DC，iDC）的趨化因子［15］，當(dāng)氣道發(fā)生炎癥反應(yīng)的時(shí)候，在CCL20等趨化因子作用下，部分iDC向肺部遷移［16］，故而引起肺部DC增多、OX62的表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)CCL20單抗組OX62的表達(dá)比慢阻肺模型組減少（P＜0. 05），這很可能由于部分CCL20與注射到體內(nèi)的CCL20抗體結(jié)合，從而使對DC發(fā)揮趨化作用的CCL20減少，使肺部OX62的表達(dá)減少，同時(shí)也使病情減輕。

本研究顯示，慢阻肺模型組大鼠的肺組織中CD83的表達(dá)比健康對照組顯著減少。CD83是成熟DC（mDC）的標(biāo)志物［17］，這也許與肺部mDC在慢阻肺的發(fā)病過程中向局部引流淋巴結(jié)發(fā)生遷移有關(guān)［18］。CCL20單抗組與慢阻肺模型組相比，CD83在肺組織中的表達(dá)無明顯差異（P＞0. 05）。考慮到CCL20是iDC的趨化因子，而mDC的遷移在其他趨化因子的作用下完成，故單抗組大鼠體內(nèi)注入CCL20單抗后并未對mDC產(chǎn)生直接影響，從而該組大鼠肺組織中CD83的表達(dá)與慢阻肺組無明顯差異。

綜上所述，我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢阻肺的發(fā)病可能與肺部OX62表達(dá)的增多及CD83表達(dá)的減少有關(guān)，使用CCL20單抗干預(yù)治療能部分地緩解這種改變，從病理結(jié)果來看，其對慢阻肺的氣道炎癥及病理損害過程有一定的抑制或延緩作用。

圖2　各組大鼠免疫組化染色表現(xiàn)（×20）Note：A.OX62 expression in the controls；B. OX62 expression in the COPD models；C. OX62 expression in the CCL20 monoclonal antibody treated group；D. CD83 expression in the controls；E.CD83 expression in the COPD models；F.CD83 expression in the CCL20 monoclonal antibody treated group.Fig. 2 Immunohistochemical staining of the rats in each group（×20）

參考文獻(xiàn)：

［1］ Kim V，Criner GJ. Chronic bronchitis and chronic obstructive pulmonary disease［J］. Am J Respir Crit Care Med 2013；187：228－237.

［2］ Brusselle G G，Joos G F，Bracke K R. New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease［J］. Lancet，2011，378（49）：1015－1026.

［3］ Givi ME，F(xiàn)olkerts G，Wagenaar GTM，et al. Cigarette smoke differentially modulates dendritic cell maturation and function in time［J］. Respiratory Research. 2015；16：131－140.

［4］ Tanr?verdi H，?rnek T，Erboy F，et al. Comparison of diagnostic values of procalcitonin，C-reactive protein and blood neutrophil/ lymphocyte ratio levels in predicting bacterial infection in hospitalized patients with acute exacerbations of COPD［J］. Wien Klin Wochenschr. 2015；127：756－763.

［5］ Givi ME，Redegeld FA，F(xiàn)olkerts G，et al. Dendritic cells in pathogenesis of COPD［J］. Curr Pharm Des 2012；18：2329 －2335.

［6］ Steinman RM. Decisions about Dendritic Cells：Past，Present，and Future［J］. Ann Rev Immunol 2012；30：1－22.

［7］ Blank F，Rothen-Rutishauser B，Gehr P. Dendritic cells and macrophages form a transepithelial network against foreign particulate antigens［J］. Am J Respir Cell Mol Biol，2007，36 （6）：669 - 677.

［8］ Welte T，Miravitlles M. Viral，bacterial or both？Regardless，we need to treat infection in COPD［J］. Eur Respir J. 2014；44 （1）：11－13.

［9］ Cirone M，Conte V，F(xiàn)arina A，et al. HHV-8 reduces dendritic cell migration through down-regulation of cell-surfaceCCR6 and CCR7 and cytoskeleton reorganization［J］. Virol J. 2012；9：92.

［10］ Demedts IK，Bracke KR，Van Pottelberge G，et al. Accumulation of dendritic cells and increased CCL20 levels in the airways of patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］. Am J Respir Crit Care Med，2007，175（10）：998－1005.

［11］ 顧延會，歐陽瑤.煙熏聯(lián)合脂多糖制備大鼠慢性阻塞性肺疾病動物模型［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（13）：1295－1296.

［12］ Vestbo J，Hurd S S，Agusti A G，et al. Global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease：GOLD executive summary［J］. Am J Respir Crit Care Med，2013，187（4）：347－365.

［13］ 汪珊珊，汪電雷，陶秀華，等.脂多糖誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺病模型大鼠肺支氣管上皮MRP1功能分析［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2014，22（3）：30－34.

［14］ Manuel A Silva，Monica Porras，Jennifer Jury，et al. Characterization of Ileal Dendritic Cell Distribution in a Rat Model of Acute and Chronic Inflammation［J］. Inflamm Bowel Dis 2006，12：457 - 470.

［15］ LaraE Kallal，MatthewA Schaller，DennisM. Lindell，et al. CCL20/ CCR6 blockade enhances immunity to RSV by impairing recruitment of DC［J］. Eur. J. Immunol，2010，40：1042 - 1052.

［16］ 郭佳，黃建華.小鼠樹突狀細(xì)胞亞群與T細(xì)胞關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2006，14（3）：236－240.

［17］ Liao S，Ding T，Rao X，et al. Cigarette smoke affects dendritic cell maturation in the small airways of patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］. Mol Biol Rep 2015，11：219 －225.

［18］ López-Cotarelo P，Escribano-Díaz C，González-Bethencourt IL，et al. A novel MEK-ERK-AMPK signaling axis controls chemokine receptor CCR7-dependent survival in human mature dendritic cells ［J］. J Biol Chem. 2015 290（2）：827－840.

〔修回日期〕2016－01－25

Expression of the surface factors of dendritic cells in the lung tissues of rats with COPD and the effect of CCL20 antibody on it

SUN De-sheng1，2，OUYANG Yao1，GU Yan-hui1
（1. Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China；2. Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Key Laboratory of Pulmonary Diseases of Health Ministry，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China.）

【Abstract】Objective To understand the expression of OX62 and CD83 in the lungs of rats with COPD，and to investigate the effect of the CCL20 monoclonal antibody on it. Methods A total of 30 rats were randomly divided into three groups：normal，model，and CCL20 antibody treated. COPD was induced by cigarette smoke exposure 28 days and LPS solution injection twice. The rats were injected with CCL20 antibody in the last group on the first day. The rats were sacrificed on the 29th day. We investigated the pathomorphology of their lungs by HE staining and evaluated the DC distribution in their lungs by immunohistochemistry. Results The HE staining results of the COPD models are consistent with the typical pathological features of COPD patients，the lung pathology in CCL20 group was significantly attenuated thanthat in the COPD group. Compared with healthy control group，the OX62 + DCs in the COPD model group was significantly increased（P＜0. 05），and the CCL20 group was lower than that in the COPD group（P＜0. 05）. The CD83 + DCs of COPD group was lower than that in healthy control group（P＜0. 05），and the difference was not statistically significant between COPD and CCL20 treated group（P＞0. 05）. Conclusion The pathogenesis of COPD may be related to the increase of OX62 + DC and the decrease of CD83 + DC，and this effect could be partly inhibited by CCL20 antibody.

【Key words】COPD；Dendritic cell；CCL20 antibody；OX62；CD83

【中圖分類號】］R563. 3 R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0011-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 003

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金（81460008）。

［作者簡介］孫得勝（1980－），男，主治醫(yī)師，博士生，主要研究方向：慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機(jī)制。E-mail：sun_desheng@163. com。

［通訊作者］歐陽瑤（1965－），女，主任醫(yī)師，教授，主要研究方向：慢性阻塞性肺疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：ouyangyao116@ sohu. com。