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    南方紅豆杉組織培養(yǎng)體系優(yōu)化

    2016-06-13 02:12:32郄亞微
    關(guān)鍵詞:愈傷組織組織培養(yǎng)優(yōu)化

    郄亞微

    (廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院建筑與城市規(guī)劃系,四川 廣安 638000)

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    南方紅豆杉組織培養(yǎng)體系優(yōu)化

    郄亞微

    (廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院建筑與城市規(guī)劃系,四川 廣安 638000)

    [摘要]為建立南方紅豆杉(Taxus chinensis)愈傷組織的高效誘導(dǎo)體系,提高紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)率和成活率,分別對(duì)南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基、外植體接種方法、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、pH進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn),結(jié)果得出:最適宜的培養(yǎng)基為B5改良型、最佳接種方法為無葉莖段正插入培養(yǎng)基、添加2.0mg/L2,4-D或1.0mg/LNAA、pH控制在6左右,可以分別有效地提高紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)率和成活率。

    [關(guān)鍵詞]南方紅豆杉(Taxus chinensis);組織培養(yǎng);愈傷組織;優(yōu)化

    紅豆杉(Taxuschinensis)是一種珍稀的裸子植物,具有非常重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,其富含的紫杉醇是有效的癌癥治療藥物,近年來隨著對(duì)紫杉醇的需求增加,傳統(tǒng)的種植方式提供的紫杉醇已經(jīng)無法滿足目前藥用的需要。如何采用科學(xué)的方法對(duì)紅豆杉組織進(jìn)行快速培養(yǎng)和大量生產(chǎn),以大量獲得紫杉醇,滿足藥用需求,成為了目前醫(yī)療藥材生產(chǎn)中急需解決的問題[1]。

    植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指在無菌的條件下,將植物組織置于培養(yǎng)基內(nèi),并將培養(yǎng)基放置到適宜的環(huán)境中進(jìn)行連續(xù)的培養(yǎng)得到新的組織[2],這種技術(shù)非常適合大批量的生產(chǎn)和培育特定的植物組織和幼苗,被廣泛地應(yīng)用于生物、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等科技領(lǐng)域的相關(guān)研究中。早在20世紀(jì)中期美國(guó)就采用組織培養(yǎng)技術(shù)成功地取代了傳統(tǒng)的種植繁殖培育出了芹菜幼苗[3],并且在后續(xù)研究中成功地應(yīng)用到多種植物的幼苗和組織培養(yǎng)中,給農(nóng)業(yè)育種帶來了革命性的變化[4]。到20世紀(jì)末,德國(guó)和日本就已經(jīng)利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物,這一技術(shù)后來被廣泛應(yīng)用于各種稀有植物類藥物的生產(chǎn),極大地降低了稀有藥物的價(jià)格,有效地促進(jìn)了醫(yī)藥生物技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步[5]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)被應(yīng)用到紫杉醇大批量生產(chǎn)中,可有效地解決紫杉醇的藥用需求問題[6]。但是從目前來看,在采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行紅豆杉組織培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的過程中,由于培養(yǎng)基的問題,使得實(shí)際生產(chǎn)過程中紅豆杉的組織的成活率和誘導(dǎo)率往往較低,給紫杉醇產(chǎn)量的提升帶來了嚴(yán)重的阻礙[7]。

    為此,本研究在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基體系基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,以建立南方紅豆杉愈傷組織高效誘導(dǎo)體系,提高紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)率和成活率,這對(duì)提高紫杉醇產(chǎn)量和質(zhì)量具有非常重要意義。

    1材料與方法

    1.1材料

    本研究中各試驗(yàn)使用的外植體材料類型如表1所示。

    表1 各試驗(yàn)中使用的外植體類型

    1.2方法1.2.1不同類型培養(yǎng)基的誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)

    選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的新生南方紅豆杉新生枝條和葉片組織,首先用中性洗滌劑去除其表面的灰塵,并用無菌蒸餾水清洗4~5次,用濾紙將其表面的水分吸干后再用75%的酒精對(duì)其進(jìn)行殺菌消毒處理,消毒時(shí)長(zhǎng)為1min,然后用0.1%的HgCl2對(duì)其進(jìn)行消毒,消毒時(shí)間12min,再用無菌蒸餾水對(duì)其進(jìn)行清洗5~6次,將組織切成2~5cm的莖段和1.5~2cm的切片,將外植體接種到B5改良型、B5、SH、MS、WPM、WHITE6種培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境溫度為25℃,每組培養(yǎng)基接種100個(gè)莖段或者切片,在培養(yǎng)過程中按文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行觀察記錄。

    1.2.2不同組織的接種方法的誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)

    選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的南方紅豆杉的新生枝條和葉片組織,采用前述試驗(yàn)中的消毒處理方法進(jìn)行處理后,將新生枝條和葉片組織處理成1~1.5cm的組織切面,接種于含有B5改良型培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行暗培養(yǎng),培養(yǎng)的環(huán)境溫度為25℃。其中6種不同的接種方法如圖1所示,每種接種方法接種100個(gè),在培養(yǎng)過程中記錄愈傷組織的誘導(dǎo)數(shù)和可繼代愈傷組織數(shù),并對(duì)紅豆杉組織細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。

    圖1 不同接種方法示意圖

    1.2.3調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖影響試驗(yàn)

    選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的紅豆杉枝條組織,采用前述試驗(yàn)相同的消毒處理方法對(duì)其進(jìn)行處理,切段接種于含有0.002mg/L TDZ、0.5mg/L 2,4-D、1.0mg/L 2,4-D、2.0mg/L 2,4-D、0.5mg/L NAA、1.0mg/L NAA、0.5mg/L KT、1.0mg/L KT的B5改良型培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行暗培養(yǎng),環(huán)境溫度為25℃,記錄1個(gè)繼代周期的組織細(xì)胞增重、褐化率,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。

    因?yàn)镻BL教學(xué)模式一般都是以小組的形式開展,所以,將學(xué)生進(jìn)行合理地小組劃分是最為關(guān)鍵的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。小組劃分應(yīng)該以激發(fā)學(xué)生的參與積極性和主動(dòng)性為基礎(chǔ),促使學(xué)生主動(dòng)完成規(guī)定任務(wù)。教師則應(yīng)對(duì)學(xué)生的英語口語水平進(jìn)行綜合評(píng)判,并根據(jù)水平差異進(jìn)行小組劃分,防止整體實(shí)力過強(qiáng)或者過弱。這樣一來,才可以進(jìn)一步避免在討論的時(shí)候,出現(xiàn)強(qiáng)勢(shì)或弱勢(shì)極端群體。同時(shí),教師還應(yīng)在小組中,指定一名同學(xué)作為組長(zhǎng),負(fù)責(zé)小組成員的具體任務(wù)劃分,并對(duì)小組成員的活動(dòng)與討論參與性進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)督。這就需要小組組長(zhǎng)既具備良好的英語口語水平,又要具有一定的組織與管理能力。

    1.2.4pH對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響試驗(yàn)

    選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的南方紅豆杉新生枝條,采用前述試驗(yàn)中相同的消毒方法,將其切片接種于pH為7.5、7、6.5、6、5.5的B5改良型培養(yǎng)中進(jìn)行暗培養(yǎng),培養(yǎng)的環(huán)境溫度為25℃,每組培養(yǎng)基接種100個(gè)切片,培養(yǎng)30d時(shí),記錄愈傷組織的誘導(dǎo)數(shù)和可繼代數(shù)。

    1.3紅豆杉組織細(xì)胞的生理評(píng)價(jià)

    根據(jù)前期的預(yù)試驗(yàn)的觀察和數(shù)據(jù)分析,本研究將南方紅豆杉愈傷組織的顏色進(jìn)行分級(jí),分為5個(gè)顏色度,如圖2所示。

    1.白綠色,細(xì)胞透明、呈現(xiàn)玻璃狀;2.白黃色,細(xì)胞較為透明;3.黃色,細(xì)胞不透明;4.深黃色,小部分褐化現(xiàn)象;5.土黃色,大部分褐化現(xiàn)象圖2 紅豆杉細(xì)胞顏色等級(jí)

    對(duì)組織的細(xì)胞質(zhì)地按照如圖3所示的觀測(cè)到的組織細(xì)胞分布來進(jìn)行評(píng)價(jià)。

    1.細(xì)胞松散,有水質(zhì)細(xì)胞粘連;2.細(xì)胞松散,細(xì)胞含水量較高,細(xì)胞不粘連;3.細(xì)胞均勻,蓬松,細(xì)胞呈沙粒狀聚集;4.細(xì)胞緊密,水份較低;5.細(xì)胞結(jié)塊,缺水圖3 紅豆杉細(xì)胞質(zhì)地等級(jí)

    分析過程中采用如下計(jì)算公式對(duì)組織的可繼代愈傷組織率、褐化率和細(xì)胞鮮重進(jìn)行度量和計(jì)算,進(jìn)而通過這3個(gè)指標(biāo)參數(shù)來判斷細(xì)胞的生理指標(biāo):

    可繼代愈傷組織率=(可繼代細(xì)胞的質(zhì)量/誘導(dǎo)愈傷組織質(zhì)量)×100%

    細(xì)胞鮮重=單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞增加的質(zhì)量(g)

    2結(jié)果與分析

    2.1不同類型培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

    由表2可以看出,在不同類型培養(yǎng)基的愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)中,誘導(dǎo)率從大到小分別為B5改良型、B5、SH、MS、WPM、WHITE,可繼代細(xì)胞大小由大到小分別為B5改良型、B5、MS、SH、WPM、WHITE,B5改良型的培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)周期最短,細(xì)胞質(zhì)地均勻,可繼代細(xì)胞數(shù)目最多,B5改良型培養(yǎng)基顯著優(yōu)于其他類型培養(yǎng)基,更適合紅豆杉組織的培養(yǎng)。

    表2 不同類型培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織的試驗(yàn)結(jié)果

    2.2不同組織的接種方法對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的影響

    由表3可以看出:在6種接種方法中,方法1、2和3的誘導(dǎo)率和可接種率都達(dá)到了100%;從時(shí)間上看,方法3的愈傷出現(xiàn)時(shí)間最長(zhǎng)為11d,方法1的時(shí)間最短為8d,顏色和質(zhì)地都一致;但從污染率上看,方法3具有明顯的優(yōu)勢(shì),只有1%的污染率。綜合考慮,采用方法3無葉莖段進(jìn)行接種可以有效地提高紅豆杉組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)率和可接種率,且污染率低,是最適合南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的接種方法。

    表3 不同組織接種方法誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)結(jié)果

    2.3調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響

    調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖影響試驗(yàn)得出的結(jié)果如表4所示。由表4可以看出,2,4-D、NAA的影響最為明顯,2,4-D、NAA濃度越高愈傷組織的誘導(dǎo)率越高,細(xì)胞的質(zhì)地也越好,愈傷組織的細(xì)胞可繼代率越高,因此,在構(gòu)建紅豆杉組織培養(yǎng)體系中可通過添加2.0mg/L 2,4-D或1.0mg/LNAA進(jìn)行調(diào)節(jié),可以有效地改善細(xì)胞的質(zhì)地、誘導(dǎo)率和可繼代率。

    表4 調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響試驗(yàn)結(jié)果

    2.4pH對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響

    由表5可以看出,在pH為6時(shí)南方紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)率和可繼代率都較高。因此,在構(gòu)建紅豆杉培養(yǎng)體系中,pH應(yīng)當(dāng)控制在6左右。

    表5 pH對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響試驗(yàn)結(jié)果

    3結(jié)語

    紅豆杉作為提取紫杉醇藥物的一種重要的植物,采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng),是目前實(shí)現(xiàn)大批量的生產(chǎn)紫杉醇藥物的最佳途徑,是醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)ψ仙即夹枨蟮谋U?。本研究通過不同類型培養(yǎng)基的愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)、不同組織的接種方法的誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)、調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖影響試驗(yàn)和不同pH對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響試驗(yàn),篩選出了適宜南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)、組織細(xì)胞增殖的培養(yǎng)條件,從培養(yǎng)基的組成成分、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、pH和接種方法4個(gè)方面建立了南方紅豆杉愈傷組織高效誘導(dǎo)體系,可以有效地提高紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)率和成活率,對(duì)提高紫杉醇生產(chǎn)效率具有非常重要的意義。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]周玉潔.東北紅豆杉與美麗鐮刀菌的固定化法共生培養(yǎng)[D].無錫:江南大學(xué),2008.

    [2]趙晶.東北紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)高效提取紫杉醇技術(shù)體系研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2014.

    [3]劉麗麗.東北紅豆杉開放式組培育苗關(guān)鍵技術(shù)研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2013.

    [4]袁麗娜.東北紅豆杉工廠化育苗生產(chǎn)模式優(yōu)化及技術(shù)體系的構(gòu)建[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2014.

    [5]凡利.南方紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)紫杉醇的研究[D].長(zhǎng)沙:中南林業(yè)科技大學(xué),2012.

    [6]杜亞填.南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)及其紫杉醇含量調(diào)控的優(yōu)化研究[D].長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

    [7]胡新玲.紅豆杉紫杉烷14β-羥基化酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化的研究[D].北京:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院,2007.

    [8]翟雪霞,楊靖,李友勇.紅豆杉高產(chǎn)細(xì)胞系快速建立和更新的新方法[J].生物技術(shù)通訊,2009,(3):376~379.

    [收稿日期]2015-11-09

    [基金項(xiàng)目]四川省教育廳科研項(xiàng)目(14ZB0390)。

    [作者簡(jiǎn)介]郄亞微(1981-),女,碩士,講師,現(xiàn)主要從事園林植物生物技術(shù)研究,snowy5568@sina.com。

    [中圖分類號(hào)]Q813.1+2

    [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

    [文章編號(hào)]1673-1409(2016)09-0042-04

    [引著格式]郄亞微.南方紅豆杉組織培養(yǎng)體系優(yōu)化[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ,2016,13(9):42~45,49.

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