馬齒莧水提醇沉液對(duì)大腸桿菌體內(nèi)外抗菌試驗(yàn)

(周孝瓊,王華

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012；福建省預(yù)防醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖364012)

陳慧芳，李炳貴，潘燦陽(yáng),邱靈珊

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖364012)

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馬齒莧水提醇沉液對(duì)大腸桿菌體內(nèi)外抗菌試驗(yàn)

(周孝瓊,王華

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012；福建省預(yù)防醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖364012)

陳慧芳，李炳貴，潘燦陽(yáng),邱靈珊

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖364012)

[摘要]為了開(kāi)發(fā)利用綠色中草藥馬齒莧(Portulaca oleracea L.)，進(jìn)行了馬齒莧水提醇沉液對(duì)大腸桿菌的體外抗菌試驗(yàn)和人工感染肉兔大腸桿菌病的防治試驗(yàn)，并測(cè)定血清中的總蛋白、白蛋白和球蛋白。結(jié)果表明，馬齒莧提取物濃度在0.50、1.00、2.00g/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)為中度敏感，且隨濃度的升高，抗菌效果增強(qiáng)；可顯著提高受大腸桿菌攻擊肉兔的存活率，且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果；血清中蛋白含量預(yù)防組、治療組均比健康組和模型組高?？梢?jiàn)馬齒莧水提醇沉液的體內(nèi)、體外抗菌效果表現(xiàn)基本一致，能抵抗大腸桿菌的感染，增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力。

[關(guān)鍵詞]馬齒莧(Portulaca oleracea L.)；水提醇沉液；大腸桿菌；體內(nèi)外抗菌

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)為馬齒莧科馬齒屬的一年生肉質(zhì)草本植物，廣泛分布于溫帶和熱帶地區(qū)，在我國(guó)最為常見(jiàn)，是一種藥食同源的植物，具有清熱解毒、涼血止血的功效，民間廣泛用于治療腹瀉病[1,2]。肉兔大腸桿菌病又稱粘液性腸炎，是由致病性大腸桿菌及其產(chǎn)生的毒素所引起的一種暴發(fā)性腸道性疾病，當(dāng)飼養(yǎng)管理不當(dāng)、氣候環(huán)境突變或患某些傳染病、寄生蟲(chóng)病時(shí)引起抵抗力低下而發(fā)病。該病無(wú)明顯的季節(jié)性，以20日齡至4月齡仔兔易感，尤其是20日齡到斷奶前后發(fā)病率最高，以水樣或膠凍樣和嚴(yán)重脫水為主要特征。該病可經(jīng)消化道傳播引起大批死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究采用馬齒莧水提醇沉液對(duì)大腸桿菌進(jìn)行體外抗菌試驗(yàn)和對(duì)肉兔進(jìn)行體內(nèi)防治試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)肉兔一些血液生化指標(biāo)進(jìn)行分析，以期為馬齒莧的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

中藥材馬齒莧采自福建省龍巖市東肖鎮(zhèn)田野，秋季全草采收，水洗，切碎于50℃烘箱中烘干備用。大腸桿菌菌種由龍巖學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所從接診的病兔中分離純化并鑒定為兔大腸桿菌。

試驗(yàn)動(dòng)物為2月齡加利福利亞兔,共32只，公母各半，體重(2.0±0.2)kg,由福建省龍巖市肉兔養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

試驗(yàn)LB培養(yǎng)基購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司,總蛋白(產(chǎn)品編號(hào)：98-24018-US)、白蛋白(產(chǎn)品編號(hào)：98-24000-US)試劑盒購(gòu)自北京安普生化科技有限公司。

試驗(yàn)儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100為上海愛(ài)朗儀器有限公司產(chǎn)品，一體式超純水系統(tǒng)labtower15EDI為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品，電子滅菌試驗(yàn)裝置HVE-50為日本株式會(huì)社平山制作所產(chǎn)品，電子分析天平AL104-1C為梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品，血液生化分析儀IDEXX-VeTest為美國(guó)愛(ài)德士公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1家兔的飼養(yǎng)管理

采用漏糞底板的籠養(yǎng)方式，不含預(yù)混料的顆粒飼料喂養(yǎng)，自由采食、飲水。

1.2.2提取液的制備

采用水提取醇沉淀法，將馬齒莧10g分別用10、8、6倍量超純水浸泡蒸餾煮提3次，第一次回收蒸餾液，去渣，合并3次濾液，4層紗布過(guò)濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10mL。用75%乙醇醇提，調(diào)節(jié)pH至6.8～7.2，冰箱冷藏浸提48h后，濾紙過(guò)濾去除沉淀物質(zhì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，冷卻后再用85%乙醇醇提，重復(fù)以上操作，回收乙醇，最后加入1mL蒸餾成分，同時(shí)用0.5mL吐溫-80和無(wú)菌水調(diào)節(jié)至10mL，即得1g/mL的濃縮液，高壓蒸汽滅菌備用[3]。

1.2.3菌種的復(fù)壯與擴(kuò)增

將大腸桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24h，復(fù)壯后，用接種環(huán)取菌種一環(huán)置于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h，再用肉湯液稀釋，使菌液濃度每毫升含菌量為9×108，備用[4]。

1.2.4體外抗菌試驗(yàn)

采用牛津杯法，取菌液100μL置于LB瓊脂平板表面，用涂布器反復(fù)涂布均勻后置于37℃恒溫箱中10min，表面干燥后取出，在每個(gè)平板上等距離平放打有標(biāo)記的牛津杯6只，每只杯內(nèi)分別加入等量的不同濃度的藥液240μL,于37℃培養(yǎng)24～48h[5],每種濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)，求平均值。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑≥20mm為極敏，用“”表示；15～19mm為高敏，用“”表示；10～l4mm為中敏，用“”表示；10mm 以下為低敏，用“+”表示；無(wú)抑菌圈為耐藥[6]。

1.2.5體內(nèi)抗菌試驗(yàn)

在預(yù)飼養(yǎng)期間將家兔分為4組，預(yù)防組、治療組、模型組和健康組，每組各8只。健康組不致病不用藥；預(yù)防組、治療組、模型組每只家兔腹腔注射2mL的大腸桿菌菌液。模型組致病后不用藥；預(yù)防組致病前1周給藥，肌肉注射，1次/日，1mL/kg體重，用藥7d，致病后再用藥7d；治療組致病同時(shí)給藥，肌注，1次/日，2mL/kg體重，用藥7d。觀察10d，統(tǒng)計(jì)發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)和存活數(shù)。

1.2.6試驗(yàn)兔血液中蛋白含量的測(cè)定

在接種大腸桿菌后的第3d，心臟采血2mL,離心取血清，用全自動(dòng)血液分化分析儀檢測(cè)血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)的含量。

1.3數(shù)據(jù)分析與處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件的0ne-WayANOVA法進(jìn)行方差分析.差異顯著后進(jìn)行Duncan氏多重比較，以P<0.01(差異極顯著)，P<0.05(差異顯著)作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2結(jié)果與分析

表1　馬齒莧提取液對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果

注：“”表示中敏,“+”表示低敏。

2.1體外抑菌試驗(yàn)

馬齒莧水提醇沉液的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，馬齒莧提取物濃度在2.00、1.00、0.50g/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)為中敏；濃度為0.25g/mL時(shí)，表現(xiàn)為低敏。

2.2體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

統(tǒng)計(jì)各組兔的發(fā)病情況，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　提取物防治試驗(yàn)兔發(fā)病和死亡情況

由表2可知，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組家兔死亡率為62.5%，說(shuō)明此次人工感染肉兔大腸桿菌病的模型是成功的。預(yù)防組和治療組的存活率分別為75.0%和62.5%，明顯高于模型組的37.5%。說(shuō)明馬齒莧提取液對(duì)肉兔大腸桿菌病有一定的防治作用，且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。

2.3各組試驗(yàn)兔血液中的蛋白含量

利用SPSS軟件對(duì)各組試驗(yàn)兔的血液蛋白檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　各組試驗(yàn)兔血液中的蛋白含量　g/L

注：同列數(shù)據(jù)上標(biāo)小寫(xiě)字母相同的表示兩者差異不顯著(P>0.05)，小寫(xiě)字母不同的表示兩者差異顯著(P<0.05)。

由表3可知，與健康組比較，預(yù)防組與治療組總蛋白顯著升高(P<0.05)；白蛋白預(yù)防組顯著高于健康組(P<0.05)；球蛋白治療組顯著高于健康組(P<0.05)。模型組TP、ALB、GLB與健康組差異不顯著，但都略有升高；預(yù)防組和治療組的TP、ALB、GLB與模型組差異不顯著，但均略有升高。

3討論

1)馬齒莧性寒，味甘酸；入心、肝、脾、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明馬齒莧具有抑菌、降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等多種功用[7]。本研究結(jié)果表明，馬齒莧提取液對(duì)大腸桿菌在體內(nèi)外均表現(xiàn)出一定的抑菌作用。在提取物濃度為0.50g/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)為中度敏感，而黃修奇[8]和侯俊然等[9]研究的結(jié)果是高度敏感，這可能與馬齒莧的產(chǎn)地、提取方法等有關(guān)，其原因有待進(jìn)一步探討。但馬齒莧水提醇沉液在動(dòng)物抗感染試驗(yàn)中，卻表現(xiàn)出了明顯的防治效果，而且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果，說(shuō)明馬齒莧提取物可顯著提高受大腸桿菌攻擊肉兔的存活率，能改善動(dòng)物機(jī)體的免疫機(jī)能和提高動(dòng)物防御疾病能力。

2)血液生化指標(biāo)是反映物體內(nèi)物質(zhì)代謝和某些組織器官機(jī)能狀態(tài)變化的標(biāo)志，并被廣泛應(yīng)用于研究中[10]。血清固體成分中含量最多的一類(lèi)物質(zhì)是血清總蛋白，它包括白蛋白和球蛋白2類(lèi)，具有維持血管內(nèi)正常膠體滲透壓和酸堿度、運(yùn)輸多種代謝物、調(diào)節(jié)被運(yùn)輸物質(zhì)的生理作用等多種功能，并與機(jī)體的免疫功能有著密切關(guān)系[11，12]。本研究中，模型組攻毒后食欲下降，拉稀，導(dǎo)致血清中水分減少，使TP、ALB、GLB濃度相對(duì)增高。使用馬齒莧提取物防治，能使血清中蛋白含量升高，說(shuō)明馬齒莧提取物中有效成分有利于機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，調(diào)控蛋白質(zhì)代謝，能抵抗大腸桿菌的感染，增強(qiáng)機(jī)體抗損傷的作用。

3)臨床上常用抗生素類(lèi)藥物來(lái)防治肉兔大腸桿菌病，雖能取得較好的效果，但易造成耐藥性和胃

腸道菌群紊亂，危害機(jī)體健康。長(zhǎng)期大量使用會(huì)造成藥物殘留，影響食品安全，危害人類(lèi)健康。中草藥含有抗菌殺菌物質(zhì)、免疫活性物質(zhì)、改善酶活性物質(zhì)、有機(jī)酸及解毒和促進(jìn)毒素排泄的物質(zhì)等[13]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中，要堅(jiān)持“養(yǎng)重于防、防重于治”的原則，在飼料中添加綠色無(wú)污染的中草藥添加劑，減少肉兔大腸桿菌病的發(fā)生。

[參考文獻(xiàn)]

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1997:289.

[2]戰(zhàn)興花,田英林.馬齒莧的藥用價(jià)值[J].中國(guó)林副特產(chǎn),2000,(1):55.

[3]南京藥學(xué)院.藥劑學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1978:269.

[4]鐘秀會(huì).中獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2003:55.

[5]中國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典1995年版二部附錄[S].

[6]李利紅,陳忠杰,盧婷婷,等.幾種香料植物提取物對(duì)大腸桿菌抑制作用的試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志.2013,49(6):54～56.

[7]馮津津.馬齒莧的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2013,34(7):66～68.

[8]黃修奇.馬齒莧抗菌試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2010,46(6):59～60.

[9]侯俊然,范迎.馬齒莧體外抗感染性腹瀉菌群的作用研究[J].中外醫(yī)療,2010,(28):29.

[10]劉榮欣,魯改儒,郭吉勇.加味白頭翁湯對(duì)人工感染大腸菌肉仔雞血液生化指標(biāo)的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011,(17):115～117.

[11]賈仁勇,李超,殷中瓊,等.青刺果多糖對(duì)雞血清抗體和血液生化指標(biāo)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(17):7247～7248,7481.

[12]趙芙蓉,耿愛(ài)蓮,施正香,等.胸囊腫肉仔雞血液生化指標(biāo)的變化[J].中國(guó)家禽,2008,30(3):22～24.

[13]武彩虹.黃芪多糖對(duì)人工感染法氏囊病毒雛雞紅細(xì)胞免疫功能的影響研究[D].太原:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[收稿日期]2015-11-02

[基金項(xiàng)目]福建省教育廳A類(lèi)項(xiàng)目(JA13309、JA15505)；龍巖學(xué)院服務(wù)海西建設(shè)項(xiàng)目(LQ2013027)。

[作者簡(jiǎn)介]周孝瓊(1977-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事畜禽疾病的中草藥防治研究。通信作者：王華，whomer@163.com。

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q949.745.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2016)09-0050-03

[引著格式]周孝瓊,王華,陳慧芳等.馬齒莧水提醇沉液對(duì)大腸桿菌體內(nèi)外抗菌試驗(yàn)[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ，2016，13(9)：50～52,72.