塘棲產(chǎn)枇杷葉的藥材品質(zhì)分析

馬哲龍 吳增艷 蔣福升 丁志山

[摘要] 目的 評(píng)估塘棲產(chǎn)不同品種枇杷葉的藥材品質(zhì)。 方法 參照2015版《中國藥典》，采用烘干法、灼燒法、熱浸法分析測(cè)定塘棲產(chǎn)不同品種枇杷葉的水分、總灰分和浸出物含量；采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨（67∶12∶21，v/v/v）為流動(dòng)相，柱溫25℃，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為210 nm，對(duì)齊墩果酸和熊果酸的含量進(jìn)行測(cè)定。采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，v/v）為流動(dòng)相，柱溫30℃，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為360 nm，對(duì)槲皮素和山奈酚的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果 塘棲產(chǎn)各品種枇杷葉水分、總灰分、浸出物含量范圍分別為7.87%～9.45%、5.14%～6.22%、25.41%～29.68%；齊墩果酸和熊果酸的含量總和范圍為1.04%～1.25%，均符合2015版《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)；此外，枇杷葉中的槲皮素和山奈酚的總含量范圍為0.17%～0.29%。 結(jié)論 塘棲產(chǎn)地的不同品種枇杷葉均具有較好的品質(zhì)，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

[關(guān)鍵詞] 枇杷葉；齊墩果酸；熊果酸；總黃酮

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）10（c）-0111-04

[Abstract] Objective To evaluate the quality of different varieties of loquat leaves from Tangxi. Methods Reference to the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia， the water content， total ash content and extract content of different varieties of loquat leaves were measured by oven drying method， ignition method and hot-dip method. The oleanolic acid and ursolic acid were detected useing Kromasil C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column， with mobile phase being acetonitrile-methanol-0.5% ammonium acetate （67∶12∶21， v/v/v）， column temperature being at 25℃， flow velocity being 1.0 mL/min， and detection wavelength being at 210 nm. The quercetin and kaempferol were detected by Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）column， with mobile phase being methanol-0.4% phosphoric acid （50∶50， v/v）， column temperature being at 30℃， flow velocity being 1.0 mL/min， and detection wavelength being at 360 nm. Results The range of water content， total ash content， and extract content of different varieties of loquat leaves were 7.87%-9.45%， 5.14%-6.22% and 25.41%-29.68%， respectively， the range of total content of oleanolic acid and ursolic acid was 1.04%-1.25%， all in line with the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia. In addition， the range of total content of quercetin and kaempferol in loquat leaves was 0.17%-0.29%. Conclusion The different varieties of loquat leaves in Tangxi all have good quality and deserve further development and utilization.

[Key words] Loquat leaf； Oleanolic acid； Ursolic acid； Total flavonoid

枇杷葉是一味臨床常用傳統(tǒng)中藥，來源于薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥葉片，收載于歷版《中國藥典》[1]中，性微寒，味苦辛，歸肺、胃經(jīng)，具有清肺止咳、降逆止嘔等功效，是目前中醫(yī)常用藥，臨床使用量大?，F(xiàn)代藥理研究表明，枇杷葉中的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)多樣，主要有三萜酸類、黃酮類、倍半萜、多酚類、糖苷類以及揮發(fā)油類化合物[2-7]。近年來研究表明枇杷葉除具有較好的抗炎和止咳作用外，還具有其他廣泛的藥理作用，如降血糖、抗腫瘤、抗病毒、保肝和抗氧化等[2，8-17]。通過對(duì)枇杷葉化學(xué)成分和藥理作用的研究，可以看出枇杷葉這一傳統(tǒng)中藥具有多方面的用途，可用于多種疾病的預(yù)防和治療，并取得了良好的療效。

我國枇杷資源豐富，主要分布于浙江、江西、廣東、福建、臺(tái)灣、四川、貴州、云南、陜西、甘肅、江蘇、安徽等地。其中杭州市余杭區(qū)塘棲鎮(zhèn)是全國著名的枇杷產(chǎn)區(qū)之一，枇杷栽種歷史悠久，有“中國枇杷之鄉(xiāng)”的美譽(yù)。檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，雖然關(guān)于枇杷葉的相關(guān)研究報(bào)道很多，但目前還沒有關(guān)于塘棲枇杷葉品質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)塘棲這一主要枇杷產(chǎn)地枇杷葉系統(tǒng)研究尚未進(jìn)行過，這與其果實(shí)品質(zhì)不相稱。本研究對(duì)塘棲產(chǎn)不同種源枇杷葉的水分、總灰分、浸出物、齊墩果酸、熊果酸和總黃酮含量進(jìn)行了分析測(cè)定，旨在為塘棲枇杷葉資源利用提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex高效液相色譜儀（美國戴安公司）；Kromasil C18色譜柱（瑞典阿克蘇諾貝爾公司，4.6 mm×250 mm，5 μm）；AR2130精密電子天平（Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA，萬分之一）；KQ-3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率50 kHz，）。

1.2 試劑

色譜級(jí)甲醇（臨海市浙東特種試劑廠，批號(hào)：150519）；色譜級(jí)乙腈（臨海市浙東特種試劑廠，批號(hào)：151029）；甲醇（杭州高晶精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20160122）；雙蒸水；枇杷葉對(duì)照品（安徽省萬生中藥飲片有限公司，批號(hào)：150501）；齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)：110709-200505）、熊果酸對(duì)照品（批號(hào)：110742-200516）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-200907）、山奈酚對(duì)照品（批號(hào)：110861-201209）均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 樣品

塘棲產(chǎn)硬條白砂、軟條白砂、寶珠、大葉楊墩和平頭大紅袍5個(gè)品種的枇杷葉，均于2016年6月采摘于塘棲鎮(zhèn)，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)丁志山教授鑒定為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的樹葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 一般分析

精密稱取塘棲枇杷葉各樣品及對(duì)照品枇杷葉粉末3 g，采用烘干法[1]測(cè)定水分含量，熱浸法[1]測(cè)定浸出物含量，每份樣品重復(fù)3次；精密稱取塘棲枇杷葉各樣品及對(duì)照品枇杷葉粉末2.5 g，采用灼燒法[1]測(cè)定總灰分含量，每份樣品重復(fù)3次。

2.2 齊墩果酸和熊果酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21，v/v/v）；檢測(cè)波長為210 nm，流速1 mL/min，柱溫25℃。理論板數(shù)按熊果酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000[1，15]。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取齊墩果酸對(duì)照品、熊果酸對(duì)照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 mL含齊墩果酸48 μg、熊果酸0.21 mg的混合溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液制備 分別精密稱取不同品種的塘棲枇杷葉樣品及對(duì)照品枇杷葉粗粉約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，加乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。

2.2.4 樣品測(cè)定 將已經(jīng)制備好的對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的含量。

2.3 黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，v/v），檢測(cè)波長為360 nm，流速1 mL/min，柱溫30℃[18]。槲皮素和山奈酚分離結(jié)果見圖1。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取槲皮素、山奈酚對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每1 mL含槲皮素14.4 μg、山萘酚14.2 μg的混合溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取枇杷葉藥材粗粉約1 g，精密稱定，置具塞平底燒瓶中，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，v/v）50 mL，密塞，稱定重量，置水浴中回流1 h，立即冷卻，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取“2.3.2”項(xiàng)制備的對(duì)照品溶液1 mL，分別精密吸取5、10、15、20、25、30 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，求得槲皮素回歸方程為：y = 26.303x - 0.0789（R2 = 0.9996），山奈酚標(biāo)準(zhǔn)方程為y = 29.021x + 0.3549（R2 = 0.9995），結(jié)果表明槲皮素進(jìn)樣量在0.072～0.432 μg范圍內(nèi)、山萘酚進(jìn)樣量在0.071～0.426 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，注入色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，槲皮素和山萘酚的色譜峰面積的RSD分別為0.12%和0.13%。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，注入色譜儀，按0、2、4、8、16、24 h間隔進(jìn)樣，依法測(cè)定槲皮素和山萘酚的色譜峰面積，測(cè)得槲皮素色譜峰面積的RSD為0.40%，山萘酚色譜峰面積的RSD為0.50%。

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品粉末，按“2.3.3”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液并依法測(cè)定槲皮素和山萘酚的色譜峰面積，求得峰面積RSD分別為0.23%和0.76%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取硬條白砂枇杷葉藥材粗粉約0.5 g，精密稱定，共稱取6份，置具塞平底燒瓶中，分別精密加入對(duì)照品貯備溶液槲皮素（0.72 mg/mL）700 μL，山奈酚（0.71 mg/mL）500 μL，再按“2.3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并依法測(cè)定，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算出槲皮素的平均加樣回收率為98.95%（RSD = 1.93%，n = 6），山奈酚的平均加樣回收率為98.88%（RSD = 1.86%，n = 6）。見表1～2。

2.4 塘棲各品種枇杷葉與對(duì)照品枇杷葉中成分含量測(cè)定結(jié)果

取塘棲枇杷葉各樣品及對(duì)照品枇杷葉粉末，分別測(cè)定其水分、總灰分、浸出物的含量；按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并測(cè)定其齊墩果酸和熊果酸的含量；按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并測(cè)定其槲皮素和山萘酚的含量。見表3。

3 討論

本研究參照2015版《中國藥典》對(duì)塘棲各品種枇杷葉的藥材品質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示塘棲產(chǎn)各品種枇杷葉水分含量在7.87%～9.45%之間，總灰分含量在5.14%～6.22%之間，浸出物含量在25.41%～29.68%之間，均符合2015版《中國藥典》中要求的水分不得超過13.0%，總灰分不得高于9.0%，浸出物不得低于18.0%，并且塘棲各品種枇杷葉浸出物含量明顯高于對(duì)照品枇杷葉的含量。

塘棲產(chǎn)各品種枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量總和在1.04%～1.25%之間，遠(yuǎn)高于2015版《中國藥典》中要求的0.7%。塘棲產(chǎn)軟條白砂、寶珠、大葉楊墩三個(gè)品種的枇杷葉中齊墩果酸的含量明顯高于對(duì)照品中的含量，且熊果酸含量也略高于對(duì)照品，硬條白砂和平頭大紅袍兩個(gè)品種的齊墩果酸和熊果酸的含量總和與對(duì)照品相差不大?，F(xiàn)代藥理學(xué)方法研究證明枇杷葉中三萜酸類成分是其抗炎止咳的主要成分[8-10]，齊墩果酸和熊果酸是藥典規(guī)定的枇杷葉中有效成分的質(zhì)控指標(biāo)，枇杷葉中三萜酸含量的多少直接影響其抗炎止咳的藥理作用，由于枇杷的種源較多，不同種源的枇杷葉三萜酸含量差異明顯，因此在采收時(shí)應(yīng)考慮枇杷種源以保證藥材優(yōu)良品質(zhì)。

除三萜類物質(zhì)外，黃酮類化合物也是枇杷葉中的另一類有效物質(zhì)，有文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類物質(zhì)具有鎮(zhèn)咳祛痰作用[19-21]，因此總黃酮含量的多少也是影響枇杷葉藥材品質(zhì)的重要因素。枇杷葉中的黃酮類物質(zhì)主要是以槲皮素、山奈酚為苷元的苷類化合物[2，5]，本研究將枇杷葉中的黃酮類化合物進(jìn)行水解，然后以槲皮素和山奈酚為對(duì)照品對(duì)枇杷葉中的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)測(cè)得塘棲產(chǎn)各品種枇杷葉中總黃酮含量在0.17%～0.29%之間，對(duì)照品枇杷葉總黃酮含量為0.09%，塘棲產(chǎn)枇杷葉中總黃酮含量明顯高于對(duì)照品枇杷葉。

近年來有關(guān)枇杷葉的研究表明枇杷葉除具有良好的抗炎和止咳作用外，枇杷葉三萜酸還具有明顯的降血糖作用[11]，并具有一定的調(diào)節(jié)血脂和抗腫瘤作用[2，11]；枇杷葉總黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可以明顯減少DPPH自由基轉(zhuǎn)化的作用[17]。因此三萜酸和總黃酮的含量多少直接影響枇杷葉的藥用品質(zhì)的優(yōu)劣。

我國枇杷種植范圍分布較廣泛，且品種極為豐富，枇杷葉的品種繁雜也給其藥用品質(zhì)帶來重要影響。中藥品質(zhì)的好壞，取決于有效物質(zhì)含量的多少，本研究測(cè)得塘棲枇杷葉中浸出物、齊墩果酸和熊果酸總量明顯高于2015版《中國藥典》要求。同時(shí)本研究還對(duì)2015版《中國藥典》中未做含量要求的另一類有效物質(zhì)黃酮類成分進(jìn)行了含量測(cè)定，經(jīng)測(cè)定塘棲各品種枇杷葉中總黃酮含量也較對(duì)照品高出很多，提示塘棲枇杷葉的有效物質(zhì)含量較高，藥用品質(zhì)較好。通過對(duì)塘棲枇杷葉的品質(zhì)進(jìn)行研究，期望能促進(jìn)塘棲枇杷葉的開發(fā)，利用當(dāng)?shù)刭Y源，變廢為寶，產(chǎn)生良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 柯仲成，朱志平，徐志遠(yuǎn)，等.枇杷葉的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38（1）：84-87.

[3] 呂寒，陳劍，李維林，等.枇杷葉中三萜類化學(xué)成分的研究[J].中藥材，2008，31（9）：1351-1354.

[4] 陳歡，陳光，任紅梅，等.枇杷葉中三萜類成分的研究[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，34（3）：40-45.

[5] 呂寒，李維林，裴詠萍，等.枇杷葉中黃酮類化學(xué)成分的HPLC-MSn分析[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，22（6）：56-58.

[6] 黃素華，陳秋妹，陳瑞紅，等.枇杷葉多糖的分離純化及組分鑒定[J].食品研究與開發(fā)，2017，38（4）：42-48.

[7] 鐘永康.枇杷葉化學(xué)成分及提取分離方法的研究進(jìn)展[J].今日藥學(xué)，2017，27（9）：646-648.

[8] 葛金芳，李俊，金涌，等.枇杷葉三萜酸的鎮(zhèn)咳祛痰平喘作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41（4）：413-416.

[9] 葛金芳，李俊，姚宏偉，等.枇杷葉三萜酸的抗炎作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（2）：174-178.

[10] 王立為，劉新民，余世春，等.枇杷葉抗炎和止咳作用研究[J].中草藥，2004，35（2）：174-176.

[11] 宋星，王婷婷，楊曉丹，等.枇杷葉中含科羅索酸提取物的分離純化及降血糖活性研究[J].中國新藥雜志，2017，26（2）：214-219.

[12] 洪雷.枇杷葉多糖分離純化及生物活性研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2008：28-43.

[13] 朱敏芳，張捷，馮麗，等.枇杷葉提取物對(duì)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的抑制作用[J].中成藥，2017，39（1）：177-180.

[14] 郭磊，張軒斌.枇杷葉三萜酸對(duì)慢性支氣管炎大鼠的療效及其機(jī)制[J].中藥材，2015，38（10）：2166-2168.

[15] 吳月嫻，呂寒，簡暾昱，等.不同類型枇杷葉三萜酸類成分含量及降糖活性的比較[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2017， 26（4）：101-103.

[16] 譚冰心，黃儀有，彭光天，等.不同產(chǎn)地枇杷葉粗提物抑制磷酸二酯酶4活性研究[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2017，40（6）：769-772.

[17] 呂寒，滕杰暉，陳劍，等.枇杷葉總黃酮的純化工藝及抗氧化活性研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014，31（1）：40-44.

[18] 任冰如，陳劍，呂寒，等.HPLC測(cè)定紅鳳菜總黃酮含量[J].中國野生植物資源，2016，35（1）：28-30.

[19] 韋媛媛，徐峰，陳俠，等.桑白皮總黃酮的鎮(zhèn)咳祛痰作用[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（8）：644-647.

[20] 潘華新，梁瑞燕，曹柳英，等.柚總黃酮祛痰、止咳作用研究[J].中藥材，2007，30（1）：80-82.

[21] 阿迪拉木·阿依甫江，麥合蘇木·艾克木，古孜力努爾·依馬木，等.維藥鐵線蕨總黃酮抗炎平喘作用研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，39（1）：17-20.

（收稿日期：2018-03-28 本文編輯：張瑜杰）