黑格爾七彩神仙魚摩氏摩根菌分離鑒定及耐藥性分析

王磊 孫培英 陳再忠 羅小溪 高建忠 李仲璞 韓靈莉

摘要：【目的】對患病七彩神仙魚進行摩氏摩根菌（Morganella morganii）分離鑒定及藥敏試驗，為七彩神仙魚養(yǎng)殖過程中摩氏摩根菌感染的臨床診斷和科學(xué)用藥提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā繌幕疾∫吧诟駹柶卟噬裣婶~體表分離病原菌，然后對其進行形態(tài)觀察、生理生化指標測定及16S rDNA序列分析，并采用紙片擴散法（K-B）進行藥敏試驗。【結(jié)果】從患病野生黑格爾七彩神仙魚分離獲得一株優(yōu)勢菌株（DS2015），該菌為革蘭氏陰性桿菌，其生理生化測定結(jié)果與摩氏摩根菌的相似度達100%。菌株DS2015的16S rDNA序列1208 bp（GenBank收錄號KR866070），由基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知，菌株DS2015與摩氏摩根菌聚為一簇，Bootstrap檢驗值為99；Biolog微生物自動鑒定結(jié)果也顯示，菌株DS2015最具可能性為摩氏摩根菌。藥敏試驗結(jié)果表明，菌株DS2015對慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復(fù)方新諾明等抗生素高度敏感，對米諾環(huán)素中度敏感，對青霉素G、頭孢氨芐、頭孢拉定、四環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素、克林霉素、萬古霉素和呋喃唑酮等抗生素已產(chǎn)生耐藥性?！窘Y(jié)論】摩氏摩根菌可引起七彩神仙魚身體發(fā)黑、皮膚大量分泌黏液及鰭條潰爛等癥狀，嚴重者甚至引起死亡，生產(chǎn)中可選用慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復(fù)方新諾明等抗生素進行防治。

關(guān)鍵詞： 七彩神仙魚；摩根氏菌；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號： S941.42 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1772-06

0 引言

【研究意義】七彩神仙魚（Symphysodon spp.）隸屬于慈鯛科（Cichlidae）盤麗魚屬（Symphysodon），原產(chǎn)于南美亞馬遜河流域（劉曉東和陳再忠，2008），因其體色鮮艷奪目、花紋變幻，被譽為熱帶魚之王（Giovanetti and Lucanus，2001）。近年來，我國七彩神仙魚雖已實現(xiàn)人工養(yǎng)殖，但每年仍需從原產(chǎn)地進口大量野生魚種進行品系改良，以期對退化的七彩神仙魚種質(zhì)資源進行復(fù)壯。進口野生七彩神仙魚價格昂貴，是人工養(yǎng)殖七彩神仙魚價格的十余倍，且死亡率極高，嚴重挫傷七彩神仙魚養(yǎng)殖戶的生產(chǎn)積極性，對其產(chǎn)業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴重威脅（孫悅等，2013）。此外，七彩神仙魚對水質(zhì)要求較高（適宜生活水溫28～32 ℃，pH 5.5～6.5，硬度1.4～1.8 mmol/L），飼養(yǎng)管理稍有不慎就會引起代謝紊亂、免疫力下降，且其體表鱗被較細、黏液分泌豐富，極易感染各種細菌性、真菌性和寄生蟲性疾?。∣nal et al.，2011；EI-Ghany et al.，2014）。因此，加強七彩神仙魚的病害研究對促進其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】細菌性病原感染是七彩神仙魚運輸和養(yǎng)殖過程中的常見疾病，但至今關(guān)于七彩神仙魚細菌性疾病方面的研究極少，僅EI-Ghany等（2014）報道了嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）可引起七彩神仙魚感染發(fā)病。摩氏摩根菌（Morganella morganii）隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）摩氏摩根菌屬（Morganella）。一般認為摩氏摩根菌是腐生菌，通常存在于人類和其他動物的糞便及污水、土壤中，特別是動物蛋白腐爛的地方（李雪峰和王利，2015），為條件性致病菌，可感染多種養(yǎng)殖動物而致病，我國已從多種患病動物上分離到該菌，包括錦鯉（陸小萏等，2005；韓娜娜等，2013）、袋鼠（趙耘等，2010）、黃喉擬水龜（黎小正等，2010）、中華鱉（孔蕾等，2013）等。陸小萏等（2005）和韓娜娜等（2013）報道，摩氏摩根菌可引起錦鯉肌肉充血、潰瘍，嚴重者甚至引起死亡。黎小正等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，摩氏摩根菌可引起養(yǎng)殖黃喉擬水龜發(fā)病死亡，臨床癥狀表現(xiàn)為食欲減少、流鼻涕、嘴角有滲出物、口腔潰瘍、眼睛有分泌物。李瑞偉等（2014）報道，摩氏摩根菌可引起中國大鯢腹部膨脹，體表有出血點，解剖后發(fā)現(xiàn)患病大鯢腹腔有大量積水，肝臟出血，腎臟失血發(fā)白，腸壁毛細血管充血。李雪峰和王利（2015）研究表明，鱸魚感染摩氏摩根菌后其鱗片脫落，鰭基及魚體兩側(cè)輕度出血，肛門紅腫，脾臟腫大?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)摩氏摩根菌感染引起七彩神仙魚發(fā)病的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對患病七彩神仙魚進行摩氏摩根菌分離鑒定及藥敏試驗，以期為七彩神仙魚養(yǎng)殖過程中摩氏摩根菌感染疾病的臨床診斷和科學(xué)用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

患病黑格爾七彩神仙魚由上海某七彩神仙魚進口商從巴西亞夢達河（Rio Nhamunda）流域進口（圖1），其臨床癥狀表現(xiàn)為鰭條潰爛，體表黏液脫落，呼吸急促，食欲不振等。健康七彩神仙魚由上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院觀賞水族實驗室自行繁殖獲得，體長7.2±0.4 cm，體重23.54±2.15 g。細菌生化反應(yīng)微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1. 2 細菌分離純化

用無菌棉簽在魚體表刮取受傷部位的黏液，稀釋后接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，（28.0±0.5）℃培養(yǎng)24 h后挑取單個菌落，純化2次以獲得純培養(yǎng)菌株（命名為DS2015）。觀察分離培養(yǎng)菌落形態(tài)特征，并進行革蘭氏染色、顯微鏡檢，觀察細菌的形態(tài)和染色特征，將純化的菌株接種于試管斜面培養(yǎng)基保存、備用。

1. 3 生理生化及藥敏試驗

采用細菌生化反應(yīng)微量鑒定管進行菌株DS2015的各項生理生化指標測定，并以紙片擴散法（K-B）進行藥敏性試驗。將菌株DS2015接種于新鮮營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，（30.0±0.5）℃下?lián)u床（200 r/min）培養(yǎng)24 h后用生理鹽水稀釋至OD=0.6左右，取200 μL新鮮菌懸液（濃度約1×107 CFU/mL）均勻涂布于BHI培養(yǎng)基上；在無菌操作下，將10類20種常用抗生素的抗藥敏紙片均勻貼在BHI培養(yǎng)基上，每種抗藥敏紙片3個重復(fù)，（30.0±0.5）℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

1. 4 16S rDNA的PCR擴增及測序分析

將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)過夜的菌株8000 r/min離心2 min后，用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌總DNA。用于PCR擴增的引物為通用引物（正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50.0 μL，即PCR Master Mix（2×） 25.0 μL，正、反向引物（0.2 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，重蒸水22.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像儀下觀察結(jié)果。同時將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序所得菌株16S rDNA序列通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析。選取同源性最近的序列通過MEGA 5.0進行比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 5 Biolog微生物自動鑒定

挑取單個純化菌株接種于Biolog專用IF-A培養(yǎng)液中，配成一定濃度的菌懸液后用濁度計進行校準，使其濃度在標準要求范圍內(nèi)，然后倒入無菌的一次性V型加樣槽中，使用Biolog專用移液排槍將菌懸液按每孔100 μL加到GenIII微孔板的96個孔內(nèi)，標記后恒溫（33 ℃）生化培養(yǎng)16～24 h，將鑒定板裝載于Biolog系統(tǒng)中培養(yǎng)，系統(tǒng)自動讀數(shù)并輸出鑒定結(jié)果。

1. 6 動物感染試驗

將菌株DS2015接種于LB液體培養(yǎng)基29 ℃培養(yǎng)12 h，取0.5 mL菌懸液用生理鹽水稀釋至1.0×108和1.0×109 CFU/mL。感染試驗采用腹腔注射法，每個濃度梯度注射12尾七彩神仙魚，每尾注射菌液0.1 mL，對照組注射0.1 mL無菌生理鹽水。注射后的七彩神仙魚養(yǎng)殖于自動充氣水族箱中（100 cm×50 cm×40 cm），飼養(yǎng)水溫（28.0±0.5）℃，養(yǎng)殖期間停止喂食，日換水量為50%，連續(xù)觀察7 d并記錄試驗結(jié)果。

1. 7 統(tǒng)計分析

以Excel 2007和SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并采用t 檢驗進行組間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌的菌落形態(tài)特征及其培養(yǎng)特性

由圖2可看出，病原菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，其菌落呈圓形，表面光滑、邊緣整齊、中央隆起，乳白色；菌落直徑0.9～1.2 mm，生長豐盛。革蘭氏染色呈陰性，單個菌體呈桿狀、散在、兩端鈍圓。

2. 2 病原菌的生理生化特性

菌株DS2015的生理生化測定結(jié)果與摩氏摩根菌（M. morganii）的相似度達100%，初步確認該菌株為摩氏摩根菌，具體生理生化指標測試結(jié)果見表1。

2. 3 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果

菌株DS2015的16S rDNA序列為1208 bp，將其提交至GenBank，獲得收錄號KR866070；通過NCBI的BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株DS2015的16S rDNA序列與GenBank中已公布摩氏摩根菌不同菌株16S rDNA 序列的相似性均在99%以上。從GenBank中選取10株摩氏摩根菌標準菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株DS2015與摩氏摩根菌聚為一簇（圖3），Bootstrap檢驗值為99，可進一步確定菌株DS2015為摩氏摩根菌。

2. 4 Biolog微生物自動鑒定結(jié)果

恒溫生化培養(yǎng)16～24 h后，其鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠色ID 框顯示“Species ID”，即菌株DS2015得到匹配好的結(jié)果（圖4）。Biolog微生物自動鑒定結(jié)果表明，菌株DS2015最具可能性為摩氏摩根菌。

2. 5 動物感染試驗結(jié)果

分別以1.0×108和1.0×109 CFU/mL的菌懸液感染七彩神仙魚，人工感染4 h后七彩神仙魚游動遲緩，12 h后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，48 h后七彩神仙魚死亡率為42%～

63%。對照組的七彩神仙魚無任何癥狀。人工感染發(fā)病七彩神仙魚體表分泌大量黏液，以死亡七彩神仙魚體表黏液為材料進行細菌分離，再經(jīng)生物學(xué)特征鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其特征特性與菌株DS2015完全相同，說明菌株DS2015是引起七彩神仙魚發(fā)病的致病菌。

2. 6 藥敏試驗結(jié)果

選取20種抗生素對菌株DS2015進行藥敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復(fù)方新諾明等10種抗生素高度敏感，對米諾環(huán)素中度敏感，對青霉素G、頭孢氨芐、頭孢拉定、四環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素、克林霉素、萬古霉素和呋喃唑酮等9種抗生素已產(chǎn)生耐藥性（表2）。

3 討論

摩氏摩根菌是一種條件性致病菌，可感染多種養(yǎng)殖動物而致病， 引起感染動物肺臟淤血、膿腫，腎臟出血等內(nèi)臟器官病變及體表皮膚、肌肉潰爛。近年來，因摩氏摩根菌引起的水產(chǎn)動物疾病日趨嚴重。目前已有研究從患病大鯢、錦鯉、草魚、鱸魚等水生生物體內(nèi)分離鑒定出摩氏摩根菌，其發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為皮膚潰爛、肌肉充血、內(nèi)臟器官病變（Holt et al.，1994；陸小萏等，2005；俞春紅等，2012；李雪峰和王利，2015）。本研究從患病七彩神仙魚體內(nèi)分離獲得摩氏摩根菌，病魚臨床表現(xiàn)出身體發(fā)黑、皮膚大量分泌黏液及鰭條潰爛等癥狀，與摩氏摩根菌引起其他魚類的感染癥狀相似。

目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病仍是采用抗生素來控制其發(fā)生和流行，但化學(xué)藥物防治極易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性（李瑞偉等，2014）。本研究的藥敏試驗結(jié)果表明，菌株DS2015對多數(shù)抗生素不敏感，可能與目前野生七彩神仙魚在進口運輸和暫養(yǎng)過程中常大量使用硝基呋喃類、四環(huán)素類和青霉素類抗生素以預(yù)防細菌性疾病的發(fā)生有關(guān)。七彩神仙魚源摩氏摩根菌與其他水生生物源摩氏摩根菌的藥敏結(jié)果存在明顯差異。陸小萏等（2005）研究表明，錦鯉摩氏摩根菌對氧氟沙星等抗生素敏感，但對生產(chǎn)上的一些常規(guī)抗菌藥物如青霉素類、慶大霉素、磺胺類等不敏感；孔蕾等（2013）對中華鱉摩氏摩根菌進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)其對氨曲南、氟苯尼考、頭孢哌酮等藥物敏感；韓娜娜等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，錦鯉摩氏摩根菌對先鋒霉素、萬古霉素、青霉素等已產(chǎn)生耐藥性，對頭孢曲松、奧復(fù)星、復(fù)方新諾明等敏感；蘭云等（2014）研究表明，從黃喉擬水龜分離獲得的摩氏摩根菌對哌拉西林、頭孢哌酮、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素高度敏感；李瑞偉等（2014）研究表明，從患病大鯢分離獲得的摩氏摩根菌對頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南等10種抗菌藥物高度敏感，但對利福平、阿莫西林等表現(xiàn)出較高的耐藥性；李雪峰和王利（2015）研究發(fā)現(xiàn)，從患病鱸魚分離獲得的摩氏摩根菌對磷霉素、菌必治等高度敏感，對痢特靈、紅霉素和諾氟沙星中度敏感，對氨芐西林和氟苯尼考等11種抗菌藥物不敏感（耐藥）。這可能與不同患病品種的用藥習(xí)慣有密切關(guān)系，長期或多次使用的藥物較易產(chǎn)生耐藥性，但具體原因有待進一步探究。

4 結(jié)論

摩氏摩根菌可引起七彩神仙魚身體發(fā)黑、皮膚大量分泌黏液及鰭條潰爛等癥狀，嚴重者甚至引起死亡，生產(chǎn)中可選用慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復(fù)方新諾明等抗生素進行防治。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）