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    黑格爾七彩神仙魚摩氏摩根菌分離鑒定及耐藥性分析

    2016-05-30 22:02:13王磊孫培英陳再忠羅小溪高建忠李仲璞韓靈莉
    南方農(nóng)業(yè)學(xué)報 2016年10期
    關(guān)鍵詞:藥敏試驗分離鑒定

    王磊 孫培英 陳再忠 羅小溪 高建忠 李仲璞 韓靈莉

    摘要:【目的】對患病七彩神仙魚進行摩氏摩根菌(Morganella morganii)分離鑒定及藥敏試驗,為七彩神仙魚養(yǎng)殖過程中摩氏摩根菌感染的臨床診斷和科學(xué)用藥提供科學(xué)依據(jù)?!痉椒ā繌幕疾∫吧诟駹柶卟噬裣婶~體表分離病原菌,然后對其進行形態(tài)觀察、生理生化指標測定及16S rDNA序列分析,并采用紙片擴散法(K-B)進行藥敏試驗。【結(jié)果】從患病野生黑格爾七彩神仙魚分離獲得一株優(yōu)勢菌株(DS2015),該菌為革蘭氏陰性桿菌,其生理生化測定結(jié)果與摩氏摩根菌的相似度達100%。菌株DS2015的16S rDNA序列1208 bp(GenBank收錄號KR866070),由基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知,菌株DS2015與摩氏摩根菌聚為一簇,Bootstrap檢驗值為99;Biolog微生物自動鑒定結(jié)果也顯示,菌株DS2015最具可能性為摩氏摩根菌。藥敏試驗結(jié)果表明,菌株DS2015對慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復(fù)方新諾明等抗生素高度敏感,對米諾環(huán)素中度敏感,對青霉素G、頭孢氨芐、頭孢拉定、四環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素、克林霉素、萬古霉素和呋喃唑酮等抗生素已產(chǎn)生耐藥性?!窘Y(jié)論】摩氏摩根菌可引起七彩神仙魚身體發(fā)黑、皮膚大量分泌黏液及鰭條潰爛等癥狀,嚴重者甚至引起死亡,生產(chǎn)中可選用慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復(fù)方新諾明等抗生素進行防治。

    關(guān)鍵詞: 七彩神仙魚;摩根氏菌;分離鑒定;藥敏試驗

    中圖分類號: S941.42 文獻標志碼:A 文章編號:2095-1191(2016)10-1772-06

    0 引言

    【研究意義】七彩神仙魚(Symphysodon spp.)隸屬于慈鯛科(Cichlidae)盤麗魚屬(Symphysodon),原產(chǎn)于南美亞馬遜河流域(劉曉東和陳再忠,2008),因其體色鮮艷奪目、花紋變幻,被譽為熱帶魚之王(Giovanetti and Lucanus,2001)。近年來,我國七彩神仙魚雖已實現(xiàn)人工養(yǎng)殖,但每年仍需從原產(chǎn)地進口大量野生魚種進行品系改良,以期對退化的七彩神仙魚種質(zhì)資源進行復(fù)壯。進口野生七彩神仙魚價格昂貴,是人工養(yǎng)殖七彩神仙魚價格的十余倍,且死亡率極高,嚴重挫傷七彩神仙魚養(yǎng)殖戶的生產(chǎn)積極性,對其產(chǎn)業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴重威脅(孫悅等,2013)。此外,七彩神仙魚對水質(zhì)要求較高(適宜生活水溫28~32 ℃,pH 5.5~6.5,硬度1.4~1.8 mmol/L),飼養(yǎng)管理稍有不慎就會引起代謝紊亂、免疫力下降,且其體表鱗被較細、黏液分泌豐富,極易感染各種細菌性、真菌性和寄生蟲性疾?。∣nal et al.,2011;EI-Ghany et al.,2014)。因此,加強七彩神仙魚的病害研究對促進其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?!厩叭搜芯窟M展】細菌性病原感染是七彩神仙魚運輸和養(yǎng)殖過程中的常見疾病,但至今關(guān)于七彩神仙魚細菌性疾病方面的研究極少,僅EI-Ghany等(2014)報道了嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)可引起七彩神仙魚感染發(fā)病。摩氏摩根菌(Morganella morganii)隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)摩氏摩根菌屬(Morganella)。一般認為摩氏摩根菌是腐生菌,通常存在于人類和其他動物的糞便及污水、土壤中,特別是動物蛋白腐爛的地方(李雪峰和王利,2015),為條件性致病菌,可感染多種養(yǎng)殖動物而致病,我國已從多種患病動物上分離到該菌,包括錦鯉(陸小萏等,2005;韓娜娜等,2013)、袋鼠(趙耘等,2010)、黃喉擬水龜(黎小正等,2010)、中華鱉(孔蕾等,2013)等。陸小萏等(2005)和韓娜娜等(2013)報道,摩氏摩根菌可引起錦鯉肌肉充血、潰瘍,嚴重者甚至引起死亡。黎小正等(2010)研究發(fā)現(xiàn),摩氏摩根菌可引起養(yǎng)殖黃喉擬水龜發(fā)病死亡,臨床癥狀表現(xiàn)為食欲減少、流鼻涕、嘴角有滲出物、口腔潰瘍、眼睛有分泌物。李瑞偉等(2014)報道,摩氏摩根菌可引起中國大鯢腹部膨脹,體表有出血點,解剖后發(fā)現(xiàn)患病大鯢腹腔有大量積水,肝臟出血,腎臟失血發(fā)白,腸壁毛細血管充血。李雪峰和王利(2015)研究表明,鱸魚感染摩氏摩根菌后其鱗片脫落,鰭基及魚體兩側(cè)輕度出血,肛門紅腫,脾臟腫大?!颈狙芯壳腥朦c】目前,有關(guān)摩氏摩根菌感染引起七彩神仙魚發(fā)病的研究鮮見報道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】對患病七彩神仙魚進行摩氏摩根菌分離鑒定及藥敏試驗,以期為七彩神仙魚養(yǎng)殖過程中摩氏摩根菌感染疾病的臨床診斷和科學(xué)用藥提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1. 1 試驗材料

    患病黑格爾七彩神仙魚由上海某七彩神仙魚進口商從巴西亞夢達河(Rio Nhamunda)流域進口(圖1),其臨床癥狀表現(xiàn)為鰭條潰爛,體表黏液脫落,呼吸急促,食欲不振等。健康七彩神仙魚由上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院觀賞水族實驗室自行繁殖獲得,體長7.2±0.4 cm,體重23.54±2.15 g。細菌生化反應(yīng)微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司。

    1. 2 細菌分離純化

    用無菌棉簽在魚體表刮取受傷部位的黏液,稀釋后接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,(28.0±0.5)℃培養(yǎng)24 h后挑取單個菌落,純化2次以獲得純培養(yǎng)菌株(命名為DS2015)。觀察分離培養(yǎng)菌落形態(tài)特征,并進行革蘭氏染色、顯微鏡檢,觀察細菌的形態(tài)和染色特征,將純化的菌株接種于試管斜面培養(yǎng)基保存、備用。

    1. 3 生理生化及藥敏試驗

    采用細菌生化反應(yīng)微量鑒定管進行菌株DS2015的各項生理生化指標測定,并以紙片擴散法(K-B)進行藥敏性試驗。將菌株DS2015接種于新鮮營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,(30.0±0.5)℃下?lián)u床(200 r/min)培養(yǎng)24 h后用生理鹽水稀釋至OD=0.6左右,取200 μL新鮮菌懸液(濃度約1×107 CFU/mL)均勻涂布于BHI培養(yǎng)基上;在無菌操作下,將10類20種常用抗生素的抗藥敏紙片均勻貼在BHI培養(yǎng)基上,每種抗藥敏紙片3個重復(fù),(30.0±0.5)℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

    1. 4 16S rDNA的PCR擴增及測序分析

    將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)過夜的菌株8000 r/min離心2 min后,用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌總DNA。用于PCR擴增的引物為通用引物(正向引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',反向引物1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50.0 μL,即PCR Master Mix(2×) 25.0 μL,正、反向引物(0.2 μmol/L)各1.0 μL,DNA模板1.0 μL,重蒸水22.0 μL。擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,進行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在凝膠成像儀下觀察結(jié)果。同時將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,將測序所得菌株16S rDNA序列通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析。選取同源性最近的序列通過MEGA 5.0進行比對分析,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

    1. 5 Biolog微生物自動鑒定

    挑取單個純化菌株接種于Biolog專用IF-A培養(yǎng)液中,配成一定濃度的菌懸液后用濁度計進行校準,使其濃度在標準要求范圍內(nèi),然后倒入無菌的一次性V型加樣槽中,使用Biolog專用移液排槍將菌懸液按每孔100 μL加到GenIII微孔板的96個孔內(nèi),標記后恒溫(33 ℃)生化培養(yǎng)16~24 h,將鑒定板裝載于Biolog系統(tǒng)中培養(yǎng),系統(tǒng)自動讀數(shù)并輸出鑒定結(jié)果。

    1. 6 動物感染試驗

    將菌株DS2015接種于LB液體培養(yǎng)基29 ℃培養(yǎng)12 h,取0.5 mL菌懸液用生理鹽水稀釋至1.0×108和1.0×109 CFU/mL。感染試驗采用腹腔注射法,每個濃度梯度注射12尾七彩神仙魚,每尾注射菌液0.1 mL,對照組注射0.1 mL無菌生理鹽水。注射后的七彩神仙魚養(yǎng)殖于自動充氣水族箱中(100 cm×50 cm×40 cm),飼養(yǎng)水溫(28.0±0.5)℃,養(yǎng)殖期間停止喂食,日換水量為50%,連續(xù)觀察7 d并記錄試驗結(jié)果。

    1. 7 統(tǒng)計分析

    以Excel 2007和SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,并采用t 檢驗進行組間差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2. 1 病原菌的菌落形態(tài)特征及其培養(yǎng)特性

    由圖2可看出,病原菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好,其菌落呈圓形,表面光滑、邊緣整齊、中央隆起,乳白色;菌落直徑0.9~1.2 mm,生長豐盛。革蘭氏染色呈陰性,單個菌體呈桿狀、散在、兩端鈍圓。

    2. 2 病原菌的生理生化特性

    菌株DS2015的生理生化測定結(jié)果與摩氏摩根菌(M. morganii)的相似度達100%,初步確認該菌株為摩氏摩根菌,具體生理生化指標測試結(jié)果見表1。

    2. 3 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果

    菌株DS2015的16S rDNA序列為1208 bp,將其提交至GenBank,獲得收錄號KR866070;通過NCBI的BLAST比對分析,發(fā)現(xiàn)菌株DS2015的16S rDNA序列與GenBank中已公布摩氏摩根菌不同菌株16S rDNA 序列的相似性均在99%以上。從GenBank中選取10株摩氏摩根菌標準菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株DS2015與摩氏摩根菌聚為一簇(圖3),Bootstrap檢驗值為99,可進一步確定菌株DS2015為摩氏摩根菌。

    2. 4 Biolog微生物自動鑒定結(jié)果

    恒溫生化培養(yǎng)16~24 h后,其鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠色ID 框顯示“Species ID”,即菌株DS2015得到匹配好的結(jié)果(圖4)。Biolog微生物自動鑒定結(jié)果表明,菌株DS2015最具可能性為摩氏摩根菌。

    2. 5 動物感染試驗結(jié)果

    分別以1.0×108和1.0×109 CFU/mL的菌懸液感染七彩神仙魚,人工感染4 h后七彩神仙魚游動遲緩,12 h后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,48 h后七彩神仙魚死亡率為42%~

    63%。對照組的七彩神仙魚無任何癥狀。人工感染發(fā)病七彩神仙魚體表分泌大量黏液,以死亡七彩神仙魚體表黏液為材料進行細菌分離,再經(jīng)生物學(xué)特征鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其特征特性與菌株DS2015完全相同,說明菌株DS2015是引起七彩神仙魚發(fā)病的致病菌。

    2. 6 藥敏試驗結(jié)果

    選取20種抗生素對菌株DS2015進行藥敏試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復(fù)方新諾明等10種抗生素高度敏感,對米諾環(huán)素中度敏感,對青霉素G、頭孢氨芐、頭孢拉定、四環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素、克林霉素、萬古霉素和呋喃唑酮等9種抗生素已產(chǎn)生耐藥性(表2)。

    3 討論

    摩氏摩根菌是一種條件性致病菌,可感染多種養(yǎng)殖動物而致病, 引起感染動物肺臟淤血、膿腫,腎臟出血等內(nèi)臟器官病變及體表皮膚、肌肉潰爛。近年來,因摩氏摩根菌引起的水產(chǎn)動物疾病日趨嚴重。目前已有研究從患病大鯢、錦鯉、草魚、鱸魚等水生生物體內(nèi)分離鑒定出摩氏摩根菌,其發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為皮膚潰爛、肌肉充血、內(nèi)臟器官病變(Holt et al.,1994;陸小萏等,2005;俞春紅等,2012;李雪峰和王利,2015)。本研究從患病七彩神仙魚體內(nèi)分離獲得摩氏摩根菌,病魚臨床表現(xiàn)出身體發(fā)黑、皮膚大量分泌黏液及鰭條潰爛等癥狀,與摩氏摩根菌引起其他魚類的感染癥狀相似。

    目前,水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病仍是采用抗生素來控制其發(fā)生和流行,但化學(xué)藥物防治極易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性(李瑞偉等,2014)。本研究的藥敏試驗結(jié)果表明,菌株DS2015對多數(shù)抗生素不敏感,可能與目前野生七彩神仙魚在進口運輸和暫養(yǎng)過程中常大量使用硝基呋喃類、四環(huán)素類和青霉素類抗生素以預(yù)防細菌性疾病的發(fā)生有關(guān)。七彩神仙魚源摩氏摩根菌與其他水生生物源摩氏摩根菌的藥敏結(jié)果存在明顯差異。陸小萏等(2005)研究表明,錦鯉摩氏摩根菌對氧氟沙星等抗生素敏感,但對生產(chǎn)上的一些常規(guī)抗菌藥物如青霉素類、慶大霉素、磺胺類等不敏感;孔蕾等(2013)對中華鱉摩氏摩根菌進行藥敏試驗,發(fā)現(xiàn)其對氨曲南、氟苯尼考、頭孢哌酮等藥物敏感;韓娜娜等(2013)研究發(fā)現(xiàn),錦鯉摩氏摩根菌對先鋒霉素、萬古霉素、青霉素等已產(chǎn)生耐藥性,對頭孢曲松、奧復(fù)星、復(fù)方新諾明等敏感;蘭云等(2014)研究表明,從黃喉擬水龜分離獲得的摩氏摩根菌對哌拉西林、頭孢哌酮、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素高度敏感;李瑞偉等(2014)研究表明,從患病大鯢分離獲得的摩氏摩根菌對頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南等10種抗菌藥物高度敏感,但對利福平、阿莫西林等表現(xiàn)出較高的耐藥性;李雪峰和王利(2015)研究發(fā)現(xiàn),從患病鱸魚分離獲得的摩氏摩根菌對磷霉素、菌必治等高度敏感,對痢特靈、紅霉素和諾氟沙星中度敏感,對氨芐西林和氟苯尼考等11種抗菌藥物不敏感(耐藥)。這可能與不同患病品種的用藥習(xí)慣有密切關(guān)系,長期或多次使用的藥物較易產(chǎn)生耐藥性,但具體原因有待進一步探究。

    4 結(jié)論

    摩氏摩根菌可引起七彩神仙魚身體發(fā)黑、皮膚大量分泌黏液及鰭條潰爛等癥狀,嚴重者甚至引起死亡,生產(chǎn)中可選用慶大霉素、新霉素、卡那霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星和復(fù)方新諾明等抗生素進行防治。

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    (責(zé)任編輯 蘭宗寶)

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