大鼠腦損傷后EPO及其受體表達與損傷時間的關(guān)系

李　偉，齊　麟（鐵道警察學(xué)院公安技術(shù)系，河南鄭州450053）

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大鼠腦損傷后EPO及其受體表達與損傷時間的關(guān)系

李偉，齊麟
（鐵道警察學(xué)院公安技術(shù)系，河南鄭州450053）

摘要：目的研究大鼠腦損傷后腦組織中促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）及其受體（erythropoietin receptor，EPOR）的表達與損傷時間的關(guān)系。方法72只SD大鼠隨機分為對照組（36只）、腦損傷組（36只），在建模后1、2、4、8、12、24h每組各取6只大鼠處死，取挫傷部位腦組織，應(yīng)用實時熒光定量PCR和Western印跡法檢測不同時間點EPO以及EPOR的mRNA表達和蛋白表達情況。結(jié)果傷后24h內(nèi)，EPO及EPOR的表達隨損傷時間的增加而呈上升趨勢。EPO的mRNA及蛋白表達與損傷時間之間存在相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為0.875、0.911（P<0.05）；EPOR的mRNA及蛋白表達與損傷時間之間存在相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為0.936、0.905（P<0.05）。結(jié)論大鼠顱腦損傷早期EPO及EPOR的表達呈逐步上升趨勢，與損傷時間具有相關(guān)性，可以作為腦損傷時間推斷的參考。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)病理學(xué)；腦損傷；促紅細胞生成素；促紅細胞生成素受體；損傷時間；大鼠

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）及其受體（erythropoietin receptor，EPOR）可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達，在神經(jīng)損傷修復(fù)中具有重要意義［1］。本研究利用自由落體打擊法建立腦損傷模型，檢測大鼠腦損傷后EPO及EPOR隨損傷時間的變化規(guī)律，以探討顱腦損傷后EPO及EPOR的表達與損傷時間的相關(guān)性，為法醫(yī)學(xué)損傷時間的推斷提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組

72只雄性SD大鼠（購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心），體質(zhì)量（250±20）g，隨機分為對照組（36只）和腦損傷組（36只）。

1.1.2主要試劑

兔抗大鼠EPO、EPOR及β－actin多克隆抗體（一抗）為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，堿性磷酸酶羊抗兔IgG（二抗）購自美國安瑪西亞公司，蛋白Marker購自美國Thermo Fisher公司，NC膜購自美國PALL公司，ECL Western blot顯影試劑盒購自美國GE公司，RNA提取試劑盒（Trizol Reagent）購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AMV RNA PCR Ver.3.0）購自日本TaKaRa公司，Real－time qPCR Mix購自日本TOYOBO公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器

9700型PCR擴增儀、7900HT型熒光定量PCR儀（美國AB公司），DYCZ23A型蛋白垂直電泳槽（北京六一生物科技有限公司），Trans－Blot SD型半干轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂公司），PRISIM 7900HD SDS熒光定量PCR分析軟件（美國AB公司），ImageScannerⅢ光密度掃描儀及蛋白分析系統(tǒng)（美國GE公司）。

1.2方法

1.2.1腦損傷模型的建立

腦損傷組均按3mL/kg給予腹腔注射10%水合氯醛，麻醉滿意后，矢狀切開頭皮，顯露右頂骨，在矢狀縫右側(cè)2mm、人字縫前側(cè)2mm處用骨科空心鉆鉆孔。下落擊桿置于骨窗處，用20 g砝碼從40 cm高處自由落體打擊下落擊桿。術(shù)后骨蠟封閉顱骨窗，縫合頭皮。

對照組僅麻醉后行開顱骨骨窗操作，但不進行自由落體打擊，不進行任何外加干預(yù)措施。

1.2.2標(biāo)本采集

腦損傷模型建立后分別在傷后1、2、4、8、12、24h頸椎脫臼處死對照組和腦損傷組大鼠各6只，取出腦組織，于液氮中保存。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測

在NCBI基因文庫中檢測β－actin、EPO及EPOR相應(yīng)的基因序列，設(shè)計并合成引物，詳見表1。提取總RNA后合成cDNA，在7900HT型熒光定量PCR儀上運行并重復(fù)3次實驗后利用PRISIM 7900HD SDS軟件進行相對定量數(shù)據(jù)分析。實驗中以β－actin作為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR。根據(jù)實驗測得的EPO、EPOR和β－actin的循環(huán)閾值（cycle of threshold，Ct），采用2－ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。將對照組中EPO和EPOR的表達量設(shè)定為1。

The prevalence of obesity and overweight in outpatients was higher than in inpatients but was not statistically significant.

表1　EPO及EPOR的引物擴增序列

1.2.4Western印跡法蛋白定量

取腦組織進行超聲裂解、離心，提取總蛋白，經(jīng)SDS－PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜后加入一抗，4℃孵育過夜，再加入二抗，按ECL顯影試劑盒說明書的操作要求，根據(jù)需要選擇曝光時間，膠片掃描。應(yīng)用圖像分析軟件，以β－actin為內(nèi)參，以靶蛋白與β－actin灰度的比值作為相對表達豐度，進行蛋白半定量測定。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

對照組中，EPO及EPOR在不同時間點的mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在腦損傷組中，EPO及EPOR的mRNA表達在傷后即開始升高，不同時間點與前一時間點之間的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與對照組相比，同一時間點的mRNA表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），詳見表2～3。

表2　大鼠腦損傷后不同時間點腦組織中EPO mRNA的表達?。╪=6，±s）

表2　大鼠腦損傷后不同時間點腦組織中EPO mRNA的表達?。╪=6，±s）

注：1）與同一時間點對照組比較，P＜0.05；2）與同組前一時間點比較，P＜0.05

1h　2h　4h　8h　12h　24h對照　2.86±0.31　2.56±0.28　2.72±0.10　2.87±0.29　2.95±0.15　2.94±0.09腦損傷　5.33±0.291）　7.27±0.691）2）　9.87±0.841）2）　11.09±0.731）2）　12.89±1.121）2）　14.53±0.841）2）組別注：1）與同一時間點對照組比較，P＜0.05；2）與同組前一時間點比較，P＜0.05 表3大鼠腦損傷后不同時間點腦組織中EPOR mRNA的表達　　（n=6，±s）1h　2h　4h　8h　12h　24h對照　1.16±0.09　1.13±0.12　1.17±0.07　1.21±0.16　1.26±0.07　1.16±0.17腦損傷　2.92±0.131）　3.16±0.111）2）　3.90±0.091）2）　5.33±0.211）2）　6.89±0.191）2）　7.27±0.081）2）組別

2.2Western印跡法蛋白檢測結(jié)果

表4　大鼠腦損傷后不同時間點腦組織中EPO蛋白的表達　（n=6，±s）

表4　大鼠腦損傷后不同時間點腦組織中EPO蛋白的表達?。╪=6，±s）

注：1）與同一時間點對照組比較，P＜0.05；2）與同組前一時間點比較，P＜0.05

1h　2h　4h　8h　12h　24h對照　0.17±0.02　0.18±0.02　0.17±0.01　0.19±0.01　0.18±0.02　0.17±0.01腦損傷　0.20±0.031）　0.23±0.011）2）　0.30±0.021）2）　0.35±0.011）2）　0.41±0.021）2）　0.48±0.011）2）組別

表5　大鼠腦損傷后不同時間點腦組織中EPOR蛋白的表達?。╪=6，±s）

表5　大鼠腦損傷后不同時間點腦組織中EPOR蛋白的表達　（n=6，±s）

注：1）與同一時間點對照組比較，P＜0.05；2）與同組前一時間點比較，P＜0.05

1h　2h　4h　8h　12h　24h對照　0.16±0.01　0.18±0.01　0.21±0.01　0.19±0.02　0.21±0.01　0.19±0.01腦損傷　0.21±0.011）　0.25±0.011）2）　0.31±0.021）2）　0.48±0.011）2）　0.54±0.021）2）　0.61±0.021）2）組別

2.3EPO及EPOR的mRNA及蛋白表達與損傷時間的相關(guān)性

經(jīng)SPSS 16.0軟件分析，EPO及EPOR的mRNA及蛋白表達與損傷時間呈正相關(guān)，求得損傷時間（y）與腦損傷后EPO的mRNA表達（x1）、蛋白表達（x2）以及EPOR的mRNA表達（x3）、蛋白表達（x4）之間的回歸方程如下：y=2.136 x1－13.207（r=0.875）；y=4.161 x2－11.923（r=0.911）；y=74.736 x3－15.893（r=0.936）；y= 46.754 x4－10.163（r=0.905）。

3　討　論

腦損傷已成為青少年致殘和死亡的重要原因之一［2－3］，在暴力性案件中，顱腦損傷所占的比例較大，準(zhǔn)確推斷腦損傷后的損傷時間能夠縮小偵查范圍，為偵查提供線索，對于刑事偵查工作具有重要的意義。因此，顱腦損傷形成時間的推斷已成為法醫(yī)學(xué)研究的重點和難點問題。傳統(tǒng)的損傷時間推斷方法以損傷后常規(guī)病理形態(tài)學(xué)改變?yōu)橐罁?jù)，但常規(guī)形態(tài)學(xué)的改變往往出現(xiàn)較晚，而且又缺乏明確的時間界限，難以量化，由此推斷的早期損傷時間往往精確度較差。由于顱腦損傷不僅表現(xiàn)為腦組織受各種因素作用所產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)改變，同時繼發(fā)出現(xiàn)的病理生理學(xué)變化對腦損傷的研究具有更加重要的意義，在法醫(yī)病理學(xué)領(lǐng)域，對顱腦損傷時間推斷的研究已經(jīng)從大體形態(tài)學(xué)水平發(fā)展到分子水平和基因水平。大量研究［4－5］證實，腦損傷后不同時間點腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的濃度、細胞因子的含量、部分生物酶的活性及相關(guān)基因和蛋白的表達呈現(xiàn)一定的時序性變化，這些規(guī)律為顱腦損傷時間推斷的研究提供了理論依據(jù)。

EPO是調(diào)節(jié)紅細胞生成的糖蛋白激素，起初多認(rèn)為EPO是一種造血因子，其主要功能是作用于骨髓造血干細胞，促進造血祖細胞的增殖和分化，隨著研究的不斷深入，大量動物實驗和臨床試驗表明，EPO及EPOR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有表達，主要位于神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞以及腦血管內(nèi)皮細胞［6］，而且EPO和EPOR在人類胚胎未分化的神經(jīng)上皮及胎兒腦組織中表達豐富，出生后EPO和EPOR明顯降低［7］，正常人體內(nèi)EPO及EPOR的水平很低。有研究［8］表明，在缺血缺氧的情況下，星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中EPOR的表達可迅速上調(diào)。EPO及EPOR在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中呈高表達、出生后表達下降、神經(jīng)細胞損傷后再次表達上調(diào)的特征可能是由于內(nèi)源性神經(jīng)保護作用。因此，臨床工作者利用EPO及EPOR的這種生物學(xué)特性，開展利用外源性EPO治療腦外傷的理論研究。目前研究多集中于探討EPO在腦損傷后的生物學(xué)效應(yīng)，為EPO在顱腦損傷的臨床治療提供理論支持［9－10］。

本實驗經(jīng)實時熒光定量PCR及Western印跡法蛋白檢測表明，EPO及EPOR在大鼠急性顱腦損傷后的基因和蛋白表達水平均呈升高的趨勢，腦損傷后24 h內(nèi)EPO及EPOR表達量與損傷時間呈較強正相關(guān)，這有助于我們探索EPO及EPOR在腦損傷后的生物學(xué)效應(yīng)，可以考慮作為早期損傷時間推斷的標(biāo)記物，為尋找法醫(yī)學(xué)顱腦損傷時間推斷方法提供理論依據(jù)。

本研究表明，在顱腦損傷早期，腦內(nèi)EPOR蛋白表達與損傷時間的相關(guān)性較EPO蛋白強，用于損傷時間推斷時更有意義。有研究［11］認(rèn)為，腦損傷早期的內(nèi)源性EPO分泌不足，而EPOR的表達量卻明顯升高，導(dǎo)致缺乏充足的EPO與EPOR相結(jié)合，因而無法啟動一系列的神經(jīng)保護信號傳導(dǎo)途徑，可能是造成早期的神經(jīng)細胞損傷的原因之一。因此，本研究從另一角度證實了在腦損傷早期應(yīng)用EPO治療的理論基礎(chǔ)。

機體損傷后調(diào)節(jié)EPOR表達的機制尚未完全明確，有研究［12－13］認(rèn)為，EPOR的表達可能與缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）、白細胞介素－1β （interleukin－1β，IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）等炎癥因子以及NO等因素相關(guān)。本研究通過自由落體造成大鼠顱腦損傷，可通過生化傳導(dǎo)路徑激活炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激引起血管通透性和細胞興奮性毒性升高，導(dǎo)致腦細胞損傷［14］，組織的低氧狀態(tài)可刺激EPOR的表達上調(diào)。

本次實驗表明，顱腦損傷早期，EPO及EPOR的表達上調(diào)具有一定的規(guī)律性，與損傷時間呈正相關(guān)，并建立了相應(yīng)的回歸方程，為腦損傷時間的推斷提供了理論依據(jù)。

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（本文編輯：劉寧國）

Relationship between Injury Time and Expressions of EPO and Its Receptors in Rats Brain after Cerebral Injury

LIWei，QI Lin
（Department of Public Security Technology，Railway Police College，Zhengzhou 450053，China）

Abstract：Objective To explore the relationship between injury age and expressions of erythropoietin （EPO）and its receptor EPOR in the brain tissue of rats after cerebral injury.M ethods Seventy－two rats were random ly divided into control group（36 rats）and cerebral injury group（36 rats）.The rats were sacrificed at 1，2，4，8，12，24h after cerebral injury（6 rats at each time point）and the brain tissues were extracted.The expressions of mRNA and protein of EPO and EPOR at different time points were detected by real－time fluorescent quantitative PCR and Western bloting.Results The expressions of EPO and EPOR increased w ithin 24h after injury.The expressions of mRNA and protein of EPO were related to the injury age，and the correlations were 0.875，0.911，respectively（P<0.05）.The expressions of mRNA and protein of EPOR were related to the injury age，and the correlation coefficients were 0.936，0.905，respectively（P<0.05）.Conclusion The expressions of EPO and EPOR increase gradually in the early stage of the rat's cerebral injury，which are associated w ith the injury age and could be a useful value for estimating injury age.

Key words：forensic pathology；cerebral injury；erythropoietin；erythropoietin receptors；injury time；rats

收稿日期：（2015－01－16）

通信作者：齊麟，男，博士，副教授，主要從事腦損傷法醫(yī)病理學(xué)研究；E－mail：qilin＠rpc.edu.cn

作者簡介：李偉（1973—），男，副主任法醫(yī)師，副教授，主要從事法醫(yī)學(xué)教學(xué)、科研及檢案工作；E－mail：leewei22868＠163.com

基金項目：公安部科技應(yīng)用創(chuàng)新項目（2012YYCXTDGZ138）

文章編號：1004－5619（2016）02－0090－04

中圖分類號：DF795.1

文獻標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.003