人參皂苷Rh2脂質(zhì)納米粒的制備表征及冰片對(duì)其抗腫瘤活性的協(xié)同作用研究

鄒亮　符佳　李維　雨田　郭曉恒　楊林

[摘要]制備人參皂苷Rh2脂質(zhì)納米粒，并考察其協(xié)同冰片的體外抗腫瘤活性。借助正交設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝，采用超聲輔助溶劑揮發(fā)法制備人參皂苷Rh2脂質(zhì)納米粒，并對(duì)其包封率、載藥率、粒徑分布、Zeta電位、形態(tài)、體外藥物釋放行為等進(jìn)行表征，MTT法初步考察其協(xié)同冰片的抗腫瘤活性。運(yùn)用優(yōu)化工藝制備的納米乳顆粒圓整均勻，形態(tài)良好，3批平均包封率為（773±25）%，載藥率為（72±02）%。，體外具有明顯的緩釋特征，96 h累計(jì)釋放5242%；人參皂苷Rh2納米粒作用24，48 h對(duì)腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞體外增殖作用的IC50分別為2233，1146 μmol·L-1，納米粒配伍冰片后IC50為1636，804 μmol·L-1，并呈現(xiàn)濃度依賴性。

[關(guān)鍵詞]人參皂苷；冰片；納米粒；抗腫瘤

[Abstract]To prepare ginsenosideRh2 lipid nanoparticles， and investigate the synergistic effect with borneol in resisting tumor activity in vitro GinsenosideRh2 lipid nanoparticles were prepared by ultrasonicassisted solvent evaporation method， and orthogonal design was adopted to optimize formulation process Its encapsulation efficiency， drug loading ratio， particle size distribution， Zeta potential， morphology and in vitro drug release behavior were characterized， and synergistic effect with borneol in resisting tumor activity were preliminarily studied by MTT These nanoemulsion particles prepared by the optimized process method were rounding and even in a good shape Encapsulation efficiency and drug loading ratio of three batches of nanoemulsion particles were （773±25）% and （72±02）%， respectively Nanoemulsion particles showed an obvious sustained release characteristics， with 5242% cumulative release within 96 h The killing effect of nanoemulsion particles on glioma cells was dosedependent， with IC50 of 2233 μmol·L-1 and 1146 μmol·L-1 after 24 h and 48 h， respectively After the combination with borneol， the killing effect of nanoemulsion particles on glioma cells was dosedependent， with IC50 of 1636 μmol·L-1 and 804 μmol·L-1 after 24 h and 48 h， respectively

[Key words]ginsenosides； borneol； nanoparticles； antitumor

doi：10.4268/cjcmm20160713

人參Panax ginseng CAMeyer是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)氣益肺、安神益智的功效，藥用歷史悠久，素有“百草藥王”的美譽(yù)，其中人參皂苷是人參中主要有效組分?，F(xiàn)代研究表明，人參皂苷具有顯著抗腫瘤、抗衰老等藥理作用[1]，其中人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）成分是一種次級(jí)苷元，具有廣譜抗腫瘤作用[25]，其主要作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能，抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤新生血管的形成、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性、增強(qiáng)化療抗癌藥物的藥效、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化并抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，還可以預(yù)防或減輕化療的毒副作用等，表現(xiàn)出極強(qiáng)的應(yīng)用前景。但由于人參皂苷Rh2水溶性差、生物利用度低、易被腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的P糖蛋白外排等特點(diǎn)，極大程度限制其抗腫瘤應(yīng)用。

近年來(lái)，將納米載體應(yīng)用于藥物抗腫瘤傳遞研究中，體現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)，可顯著改善藥物水溶性，增加藥物在腫瘤組織的蓄積，提高腫瘤細(xì)胞中藥物濃度，減少藥物毒副反應(yīng)等[6]。目前，納米乳、脂質(zhì)體、聚合物膠束、納米微球等多種納米形式已廣泛應(yīng)用于中藥抗腫瘤活性成分遞藥研究中，并取得良好效果[7]，但目前還較少有研究對(duì)人參皂苷Rh2進(jìn)行納米包載和抗腫瘤的研究。脂質(zhì)聚合物納米粒[8]是一種新型的納米載藥體系，基于脂質(zhì)材料與聚合物材料的良好生物安全性，將脂質(zhì)納米粒的高穩(wěn)定性與聚合物內(nèi)核的優(yōu)良載藥性能相結(jié)合，同時(shí)具有體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)作用和高滲透長(zhǎng)滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR effect）。但由于存在血腦屏障，導(dǎo)致游離藥物或者脂質(zhì)納米粒都很難進(jìn)入腦部病患，目前化療手段對(duì)于腦部病變的治療效果仍有限，以腦膠質(zhì)瘤為代表的腦部疾病治療缺乏有效的遞藥手段。

冰片是龍腦香科植物龍腦香樹(shù)脂的提取物，《本草綱目》記載冰片有“引藥上行”之功效，在許多中成藥中作為“藥引”，可以促進(jìn)藥物跨過(guò)血腦屏障，作為腦部病變的引經(jīng)藥，應(yīng)用于腦靶向給藥系統(tǒng)[911]。目前研究表明冰片與藥物或納米載藥復(fù)合物共用具有促進(jìn)藥物入腦遞送的作用[1213]。本研究針對(duì)人參皂苷Rh2游離形式在水溶性和抗腫瘤作用的不足，采用脂質(zhì)聚合物納米粒將其包載于內(nèi)核，得到具有核殼結(jié)構(gòu)的納米遞藥系統(tǒng)，用以抗腦膠質(zhì)瘤，并與冰片協(xié)同給藥，以增強(qiáng)抗腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用。通過(guò)考察人參皂苷Rh2包載工藝、理化性質(zhì)和協(xié)同冰片后納米粒的體外抗細(xì)胞增殖作用，研究其作為腦膠質(zhì)瘤治療給藥手段的可能性。

1材料

METTELER AE200S型電子分析天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；RTElite恒溫磁力攪拌器（美國(guó)Thermo Scientific公司）；NanoZSP 納米粒度電位分析儀（英國(guó) Malvern儀器有限公司）；MillQ 超純水儀（美國(guó)Millpore公司）；H600型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；FH100型恒流蠕動(dòng)泵（美國(guó)Thermo Scientific公司）；SpectraMax M5 酶標(biāo)儀（美國(guó) Molecular Devices 公司）。

人參皂苷Rh2（純度≥98%，成都曼斯特公司）；（+）冰片（純度≥98%，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；PEG2000DSPE聚二乙醇修飾磷脂（西安瑞禧生物科技有限公司）；PLGA聚（乳酸羥基乙酸）共聚物（山東岱罡生物制品公司）；蛋黃卵磷脂（SIGMAALDRICH 中國(guó)）；腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所）；胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)液（武漢博世德生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；其他試劑均為分析純。

2方法

21人參皂苷Rh2含量測(cè)定采用Waters e2695 HPLCUV測(cè)定人參皂苷Rh2含量。色譜柱Waters C18柱（46 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，流動(dòng)相水乙腈（40∶60），流速10 mL·min-1。精密稱取人參皂苷Rh2對(duì)照品適量于量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度配成儲(chǔ)備液01 g·L-1。分別精密吸取一定量?jī)?chǔ)備液配制成100，50，25，125，625，3125 mg·L-1系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程及線性關(guān)系，并考察日間和日內(nèi)精密度。

22脂質(zhì)聚合物納米粒的制備采用超聲輔助溶劑揮發(fā)法制備納米粒。將一定量蛋黃卵磷脂與PEGDSPE溶于少量無(wú)水乙醇中，緩慢滴加入溫水（水相）中，持續(xù)攪拌一段時(shí)間，另將人參皂苷Rh2與PLGA材料共溶于乙腈（油相）中，超聲后緩慢滴加入脂質(zhì)水溶液中，冰浴超聲再持續(xù)攪拌一段時(shí)間，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去殘余有機(jī)溶劑，過(guò)045 μm濾膜，除去未包載藥物，再過(guò)022 μm濾膜滅菌，得均勻的泛乳光納米溶液。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取蛋黃卵磷脂與PEGDSPE比例、人參皂苷Rh2與PLGA材料比例、油相和水相體積比為考察因素，選取包封率和載藥率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)均為05，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化制備工藝。

23脂質(zhì)聚合物納米粒的表征取適量納米粒溶液（1 g·L-1）滴于銅網(wǎng)上，靜置10 min后用濾紙片吸干，再滴加20%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負(fù)染5 min，自然揮干，用透射電子顯微鏡觀察納米粒形態(tài)。采用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定納米粒平均粒徑和 Zeta 電位。

基于微孔濾膜過(guò)濾法除去游離藥物，分別吸取等體積過(guò)濾前后的納米溶液，根據(jù)體積1∶1加入乙腈超聲使其破乳溶解，并定容至刻度，稀釋至合適質(zhì)量濃度，于1萬(wàn) r·min-1離心10 min，經(jīng)022 μm微孔濾膜濾過(guò)，測(cè)定其中人參皂苷Rh2含量，即分別得到納米粒中藥物含量和投藥總量。包封率=納米粒中藥物質(zhì)量/投藥總質(zhì)量×100%。

將上述過(guò)濾后納米粒溶液凍干，精密稱重，即得到過(guò)濾后納米粒中藥物與載體材料的總量。載藥率=納米粒中藥物質(zhì)量/（納米粒中藥物質(zhì)量+載體材料質(zhì)量）×100%。

24脂質(zhì)聚合物納米粒的體外藥物釋放用透析法測(cè)定納米粒中包載人參皂苷Rh2的體外釋藥特性。將分子截留量3 500的透析袋煮沸并置于蒸餾水中浸泡超過(guò)24 h。分別取2 mL納米粒溶液和游離藥物溶液（人參皂苷Rh2溶解于乙醇與聚氧乙烯蓖麻油（1∶1）置于透析袋中，兩端扎緊，置于37 ℃ 40 mL含01%聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80）的PBS液中，并以 300 r·min-1磁力攪拌器不斷攪拌，分別于025，05，1，2，4，8，12，24，48，72，96 h吸取透析袋外部溶液1 mL，每次補(bǔ)充等量的接收液。HPLC測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)接收液中藥物濃度，計(jì)算藥物的含量，推算得累積釋藥百分?jǐn)?shù)。

25細(xì)胞培養(yǎng)C6細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含45 g·L-1葡萄糖、37 g·L-1碳酸氫鈉、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺、100 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素）。培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2和飽和濕度90%。

26脂質(zhì)聚合物納米粒配伍冰片的抗腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用分別取生長(zhǎng)狀態(tài)良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠源膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，用025%胰蛋白酶EDTA液消化，并反復(fù)吹打制備成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為5×104個(gè)/mL接種于96孔板，每孔體積100 μL然后將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中，37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基。采用無(wú)血清培基分別稀釋游離空白納米粒、冰片、人參皂苷組分、人參皂苷納米粒、納米粒+10 μmol·L-1冰片等組至不同藥物濃度，隨后按濃度梯度在各孔中分別加入稀釋后樣品各100 μL，空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，每組重復(fù)6孔，分別培養(yǎng)24，48 h后吸去培養(yǎng)基，各孔加入100 μL培養(yǎng)基稀釋的MTT溶液，孵育4 h，再加入100 μL DMSO溶解生成的甲瓚，通過(guò)酶標(biāo)儀（570 nm）檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。

3結(jié)果

31納米粒藥物包載工藝的考察試驗(yàn)中由于不溶于水的游離人參皂苷Rh2經(jīng)濾膜已被除去，而溶于水的部分因人參皂苷Rh2在水中溶解度低，與載入聚合物納米粒中質(zhì)量相比，可忽略不計(jì)[1415]，故計(jì)算包封率及載藥率時(shí)，人參皂苷Rh2溶于水的部分不考慮在內(nèi)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各因素水平對(duì)粒徑影響較小，故以包封率和載藥率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，因素水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由直觀分析可知，各因素對(duì)制備工藝的影響順序?yàn)锽>A>C。方差分析結(jié)果表明，因素B對(duì)綜合評(píng)分有顯著性差異，而因素A和C對(duì)評(píng)分影響無(wú)顯著性差異，故確定最優(yōu)工藝組合為A3B3C2，即卵磷脂和PEGDSPE比例為3∶1，Rh2與PLGA比例為1∶3，油水相體積比例為1∶5。

按照最佳處方和工藝條件制備Rh2脂質(zhì)聚合物納米粒，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果其包封率為（773±25）%，載藥率為（72±02）%。

32載藥納米粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)微孔濾膜過(guò)濾前的液態(tài)體系帶淡藍(lán)色乳光，略渾濁，有肉眼可見(jiàn)的細(xì)小微粒懸于其中，靜置2 h內(nèi)均析出細(xì)小沉淀，振搖后不能均勻分散。而經(jīng)022 μm微孔濾膜過(guò)濾后液態(tài)體系為泛淡藍(lán)色乳光的、均勻的半透明膠體溶液，無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)顆粒，靜置72 h后無(wú)沉淀析出。

通過(guò)透射電鏡可觀察到載藥微粒大部分成規(guī)則的球形，表面基本光滑，大小基本均勻，納米粒之間基本無(wú)粘連；采用激光散射儀測(cè)定其載藥納米粒平均粒徑為（964±36） nm，PDI為024±006，電位為（-86±06） mV，見(jiàn)圖1。

33載藥納米粒的體外釋藥行為人參皂苷Rh2從游離溶液中快速釋放，在24 h之內(nèi)即達(dá)到釋放平衡，總釋藥量達(dá)92%，見(jiàn)圖2。而載藥納米粒的釋放則更加緩慢，其釋放曲線可分2個(gè)階段：突釋階段和穩(wěn)定釋放階段。在突釋階段中，微粒釋放藥量在24 h內(nèi)達(dá)到3964%，隨后在擴(kuò)散階段持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，釋藥量保持穩(wěn)定增長(zhǎng)，96 h累積釋藥量達(dá)到5242%，并呈逐漸上升趨勢(shì)。

34載藥納米粒的抗腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用人參皂苷Rh2不同形式在系列濃度下不同作用時(shí)間對(duì)腦膠質(zhì)瘤C6體外增殖作用的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3，4。圖3結(jié)果顯示，空白材料和游離冰片對(duì)C6細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用。由圖4結(jié)果可知，3種人參皂苷Rh2給藥形式對(duì)C6細(xì)胞增殖均呈抑制作用，并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抗細(xì)胞納米微球[19]，人參皂苷Rg固體脂質(zhì)納米粒[20]等。本實(shí)驗(yàn)采用超聲溶劑揮發(fā)法制備脂質(zhì)聚合物納米粒用以包載人參皂苷Rh2。在制備工藝中，隨其PLGA聚合物濃度的不斷增加，單位質(zhì)量納米?？砂嗟娜藚⒃碥?，但輔料的增加可能造成載藥量降低，所以綜合評(píng)分中選擇包封率及載藥量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。而制備過(guò)程隨水相體積增加，包封率及載藥量均降低，原因可能是水相體積增加，有機(jī)相擴(kuò)散到水相的速度加快，而聚合物包載于脂質(zhì)層需要一定時(shí)間，藥物來(lái)不及被聚合物包載便隨有機(jī)相擴(kuò)散到水相中，故包封率及載藥量均降低，綜合評(píng)分降低。

人參皂苷Rh2口服生物利用度很低，其主要原因包括口服后經(jīng)胃腸道吸收的藥量少；易被消化道的酶或微生物分解；肝臟的首過(guò)效應(yīng)明顯。將人參皂苷Rh2制成脂質(zhì)聚合物納米粒后，有望將其制備作為口服給藥。載藥納米粒經(jīng)口服后，可利用脂質(zhì)層的粘附性增加載藥粒子在腸道的停留時(shí)間和接觸面積，改善藥物在腸道中的分布和傳遞，提高口服生物利用度。同時(shí)，藥物經(jīng)包裹后釋藥緩慢，同時(shí)納米粒核殼結(jié)構(gòu)可保護(hù)藥物免受胃腸道消化酶的降解，并實(shí)現(xiàn)緩慢持續(xù)地釋放藥物，促進(jìn)藥物的腸道吸收。

研究結(jié)果證實(shí)，以脂質(zhì)聚合物納米粒為載體包載人參皂苷Rh2后能有效增加成分的水溶性，其粒徑分布均一，形態(tài)圓整，并且具有藥物緩釋特征，同時(shí)體外研究表明納米?？稍黾訉?duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制作用。冰片可迅速透過(guò)血腦屏障，具有“獨(dú)行則勢(shì)弱，佐使則有功”、“芳香走竄，引藥上行”的特點(diǎn)，適宜與他藥配伍。許多中成藥，如安宮牛黃丸、麝香保心丸和冰硼散等都有冰片的配伍應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)將冰片與人參皂苷Rh2納米粒配伍使用以期增加納米粒抗腦部腫瘤效果，結(jié)果表明，聯(lián)合給藥后人參皂苷納米粒的抗腫瘤作用顯著增加，說(shuō)明這種給藥方式可能作為抗腦部腫瘤的有效藥物傳遞途徑。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]