類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的氧化應(yīng)激與SOD抗氧化研究進(jìn)展

許家棟　上官婉　徐孟杰　潘亞囡　余志達(dá)　張偉

【摘 要】 氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基可作為氧化劑和炎癥介質(zhì)參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理過程；超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶，對(duì)維持機(jī)體氧化還原水平的動(dòng)態(tài)平衡具有重要作用。對(duì)氧化應(yīng)激、超氧化物歧化酶在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理中的調(diào)控研究，不僅為揭示“氧化-抗氧化”在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)，也為尋求干預(yù)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物提供新選擇。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；氧化應(yīng)激；超氧化物歧化酶；抗氧化；綜述

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因復(fù)雜的炎癥性自身免疫性疾病?；み^度增殖形成血管翳，并導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨損傷是其典型病理特征[1]。研究表明，氧化應(yīng)激在RA病理過程中具有重要作用[2]。機(jī)體抗氧化系統(tǒng)由抗氧化酶系和非酶抗氧化劑組成，其中超氧化物歧化酶（SOD）是體內(nèi)最重要的抗氧化酶[3]。對(duì)RA患者體內(nèi)氧化應(yīng)激、SOD抗氧化作用及調(diào)控關(guān)系研究，為揭示RA病理機(jī)制、尋找新型抗RA藥物具有重要意義。

1 RA與氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡并傾向氧化的一種狀態(tài)。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，促進(jìn)活性氧簇（ROS）和活性氮簇（RNS）自由基的大量產(chǎn)生。ROS主要包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH）；RNS主要包括一氧化氮（NO）和過氧亞硝基（ONOO-）。過量自由基會(huì)造成機(jī)體內(nèi)多種分子的氧化或硝化損傷，與包括RA在內(nèi)的多種炎癥性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4]。

1.1 自由基來源 ROS是自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增強(qiáng)因子，炎癥促使RA患者關(guān)節(jié)滑液中的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞活化，通過腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、γ-干擾素（IFN-γ）等因子激活NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生大量的ROS（主要為O2-）[5]。RA患者滑膜組織或滑液高表達(dá)的環(huán)氧化酶、脂氧合酶、黃嘌呤氧化酶也參與ROS的生成[6]。此外，滑膜增殖和關(guān)節(jié)囊纖維化導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)壓升高，顯著降低毛細(xì)血管流速，造成滑液PO2低于靜脈血水平，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)內(nèi)重復(fù)性的缺血再灌注損傷，組織損傷又會(huì)促進(jìn)Fe和Cu離子的釋放，催化自由基反應(yīng)產(chǎn)生ROS[5]。環(huán)境因素如抽煙也是誘發(fā)RA的風(fēng)險(xiǎn)因子，煙霧中含有的有機(jī)醌類化合物能產(chǎn)生O2-等自由基，是機(jī)體ROS的重要來源[7]。

體內(nèi)產(chǎn)生的O2-可被SOD催化生成H2O2，H2O2可由CAT/GSH-Px催化分解為H2O和O2，或經(jīng)Fenton反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成為水溶性的·OH，高活性的·OH被認(rèn)為是ROS產(chǎn)生細(xì)胞毒性的主要作用形式[8]。此外，中性粒細(xì)胞相關(guān)髓過氧化物酶（MPO）也能將H2O2轉(zhuǎn)化生成HOCl；HOCl既可與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生單態(tài)氧，也可與氨基酸反應(yīng)生成氯胺[2]。

除ROS外，滑膜成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞在應(yīng)答促炎癥因子反應(yīng)時(shí)，高表達(dá)的一氧化氮合酶（NOS）催化精氨酸生成大量NO，NO能與O2-反應(yīng)生成ONOO-，ONOO-又可轉(zhuǎn)化為ONOOH、·NO2等RNS自由基[9]。

1.2 自由基的損傷作用 對(duì)RA患者血清和滑液檢測發(fā)現(xiàn)，多種氧化標(biāo)記物如丙二醛（MDA）、蛋白羰基、氧化型透明質(zhì)酸、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）等水平顯著增加，表明過量自由基對(duì)多種分子造成了氧化損傷。

1.2.1 對(duì)蛋白的損傷 ROS能對(duì)多種氨基酸氧化并形成特征性產(chǎn)物（如二硫化物、蛋白羰基衍生物、氯化氨基酸等），造成蛋白交聯(lián)并導(dǎo)致蛋白變性而喪失功能[4]。Starmp等[10]發(fā)現(xiàn)，RA患者血清、滑膜組織中的MPO水平顯著升高，且與RA疾病活動(dòng)呈正相關(guān)，由MPO催化生成的HOCl是造成關(guān)節(jié)蛋白氧化損傷的關(guān)鍵因子；此外，MPO還可能通過轉(zhuǎn)化LDL和HDL并使其功能失調(diào)，促使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)形成泡沫細(xì)胞，減少胞內(nèi)膽固醇外流，增強(qiáng)RA患者動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。Vytá?ek等[11]報(bào)道了RA患者血清中兩種晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）水平異常升高，AGEs源自氧化應(yīng)激對(duì)蛋白造成的非酶促損傷，推測其可能參與了RA自身免疫反應(yīng)。

1.2.2 對(duì)脂質(zhì)的損傷 膜脂，特別是磷脂分子上的多不飽和脂肪酸易受ROS氧化，氧化的脂質(zhì)可形成脂自由基（·L）、脂質(zhì)過氧自由基（·LOO）、內(nèi)過氧化物，并最終生成能對(duì)DNA和蛋白造成損傷的MDA和4-羥基壬烯酸[4]。脂質(zhì)過氧化會(huì)導(dǎo)致諸如膜流動(dòng)性降低、膜結(jié)合受體或酶功能喪失等作用，參與多種疾病的病理過程。對(duì)RA患者血漿、紅細(xì)胞、滑膜等組織的檢測發(fā)現(xiàn)其脂質(zhì)過氧化物水平與正常人相比均顯著升高[12-13]。

1.2.3 對(duì)DNA的損傷 ROS不僅能攻擊DNA分子中的堿基和脫氧核糖產(chǎn)生各種加合物，還可與引起DNA的單、雙鏈斷裂或DNA-蛋白交聯(lián)，從而造成DNA突變損傷。鳥嘌呤氧化加合物8-OHdG被認(rèn)為是DNA氧化損傷的特征性分子標(biāo)志物，可參與突變、癌變和衰老過程。Seven等[14]對(duì)20例RA患者血液和滑液中的DNA氧化損傷評(píng)估發(fā)現(xiàn)，患者8-OHdG水平顯著升高且與氧化應(yīng)激增強(qiáng)、總抗氧化水平下降及病情的嚴(yán)重程度相關(guān)；而當(dāng)藥物干預(yù)治療后，患者血清、尿液中的8-OHdG含量則明顯下降[15-16]。Lee等[17]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致RA滑膜成纖維細(xì)胞中參與DNA修復(fù)的關(guān)鍵蛋白hMSH6表達(dá)下降，造成DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)異常，從而干擾DNA堿基突變修復(fù)。因此，氧化應(yīng)激不僅直接對(duì)DNA分子造成損傷，還能抑制DNA修復(fù)系統(tǒng)。

1.2.4 對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的損傷 ROS能破壞透明質(zhì)酸、降解關(guān)節(jié)軟骨并造成骨損傷。透明質(zhì)酸是關(guān)節(jié)滑液的主要生物大分子，也是軟骨蛋白聚糖的重要組分，對(duì)滑液的黏度起重要作用，自由基介導(dǎo)炎癥關(guān)節(jié)滑液中透明質(zhì)酸的降解已得到證實(shí)[18]。ROS不僅能使透明質(zhì)酸解聚，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑液黏度下降、抗蛋白酶失活并誘導(dǎo)骨吸收作用，還可通過抑制軟骨基質(zhì)生成、誘導(dǎo)基質(zhì)分解酶表達(dá)直接降解基質(zhì)的方式參與軟骨降解過程[19]。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）是一種參與氧化應(yīng)激防御的轉(zhuǎn)錄因子，在關(guān)節(jié)炎性條件下，Nrf2被激活并與抗氧化應(yīng)激元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)或增強(qiáng)多HO-1、γ-GCS、硫氧還蛋白等抗氧化酶的表達(dá)，參與氧化應(yīng)激防

御[20]。Wruck等[21]將AIA小鼠的Nrf2基因敲除后發(fā)現(xiàn)，小鼠關(guān)節(jié)組織中的VEGF-A水平顯著升高，關(guān)節(jié)軟骨損傷程度加重，這表明氧化應(yīng)激與RA關(guān)節(jié)軟骨的降解密切相關(guān)。

1.2.5 RNS的損傷作用 RNS除直接造成脂質(zhì)氧化、堿基修飾、DNA斷裂等損傷外，還能激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路[5]。ONOO-質(zhì)子化會(huì)消耗大量的-SH，導(dǎo)致細(xì)胞中GSSG/GSH水平升高從而激活I(lǐng)KK，進(jìn)而使IkB磷酸化并從NF-κB上脫落，NF-κB被激活后誘導(dǎo)環(huán)氧化酶-2（COX-2）、IL-1b、iNOS、TNF-α等多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，加重了RA病情[22]。

2 RA抗氧化體系

機(jī)體自身抗氧化系統(tǒng)由抗氧化酶和非酶抗氧化劑組成，抗氧化酶主要包括SOD、GSH-Px和CAT；非酶抗氧化劑包括維生素C、維生素E、GSH、類胡蘿卜素等。抗氧化酶在體內(nèi)分布廣泛，它們能有效地捕獲自由基并將其轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)；抗氧化劑則主要是通過競爭性作用保護(hù)其他分子免受自由基破壞，對(duì)細(xì)胞膜和血漿脂蛋白的保護(hù)尤為重要。

RA發(fā)生是否與患者體內(nèi)抗氧化水平下降相關(guān)呢？Gambhir等[23]研究認(rèn)為，RA患者機(jī)體酶促/非酶抗氧化系統(tǒng)遭到自由基的破壞，從而使脂質(zhì)過氧化等損傷容易發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，RA患者體內(nèi)抗氧化酶活性確實(shí)顯著下降[24-25]。然而，也有報(bào)道稱，RA患者體內(nèi)抗氧化酶活性變化不大甚至顯著升高[26-27]。Cimen等[28]認(rèn)為，RA患者體內(nèi)過多自由基主要通過黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生，而非抗氧化系統(tǒng)損壞所致。Davies等[29]認(rèn)為，機(jī)體通過誘導(dǎo)抗氧化酶合成來適應(yīng)氧化應(yīng)激的不斷變化，盡管患者體內(nèi)抗氧化水平增強(qiáng)，但氧化損傷依然不可避免。目前，對(duì)RA患者機(jī)體內(nèi)抗氧化水平變化的還不清楚，不同實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的相悖結(jié)論可能源于氧化應(yīng)激調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性和多變性，患者的遺傳多樣性、疾病活動(dòng)水平、性別、年齡、飲食等多個(gè)影響因素[1]。

3 RA與SOD抗氧化研究

3.1 SOD分類 哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在3種類型的SOD同工酶，即Cu/Zn-SOD （SOD1）、Mn-SOD （SOD2）和EC-SOD （SOD3）。其中SOD1為組成性表達(dá)蛋白，SOD2和SOD3為誘導(dǎo)性表達(dá)蛋白，3種SOD的基因位點(diǎn)、分子組成及亞細(xì)胞分布均有不同（表1）[30]。目前已發(fā)現(xiàn)，NF-κB、Sp1、AP-1、AP-2、C/EBP等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與sod基因的表達(dá)調(diào)控[31]。

3.2 SOD在RA中的表達(dá) 早期研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)滑液80%的SOD活性來自SOD3，其活性下降顯著增加了ROS誘導(dǎo)的滑膜組織損傷[32]。隨后多個(gè)研究報(bào)道了RA患者體內(nèi)SOD活性水平較低，人血清SOD3水平與RA疾病活動(dòng)呈負(fù)相

關(guān)[33-34]。Jira等[35]認(rèn)為，SOD活性的降低可能是源于H2O2對(duì)酶的抑制作用。Afonso等[8]發(fā)現(xiàn)，RA患者機(jī)體內(nèi)過量分泌的TNF-α不僅能誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生直接造成細(xì)胞損傷，還會(huì)抑制SOD1和SOD3表達(dá)。Wang等[36]對(duì)RA患者及正常人滑膜成纖維原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)11種氧化還原相關(guān)蛋白的表達(dá)全部下調(diào)，其中與氧化還原高連接度的Hub基因是sod2。然而，有些研究則呈現(xiàn)相反結(jié)論，Kasama等[37]發(fā)現(xiàn)，膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的滑膜、血清等組織中SOD活性顯著增加，推測ROS可能通過誘導(dǎo)SOD表達(dá)以阻止其產(chǎn)生的細(xì)胞毒害作用。Mazzetti等[26]發(fā)現(xiàn)，RA患者血清SOD1水平較高，且與類風(fēng)濕因子呈正相關(guān)。近期也有2篇關(guān)于RA患者體內(nèi)SOD活性顯著增強(qiáng)的研究報(bào)道[1，27]。

3.3 SOD與RA治療 盡管目前對(duì)RA抗氧化機(jī)制還不十分清楚，但SOD確有抗炎作用。酵母來源的SOD1能夠顯著降低關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)IL-12、IFN-γ、IL-6、TNF-α、NO的生成，顯示出良好的抗炎效果[38-39]。Yu等[40]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因鼠滑膜成纖維細(xì)胞中SOD3的過表達(dá)可抑制IL-1β、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等促炎因子的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，SOD3缺陷型關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)促炎因子的水平顯著升高，其關(guān)節(jié)組織損傷程度嚴(yán)重，若將SOD基因轉(zhuǎn)至小鼠體內(nèi)，則能有效減輕炎性癥狀[41]。

Goebel等[42]對(duì)RA患者關(guān)節(jié)內(nèi)注射牛源SOD，結(jié)果顯示，患者滑液中類風(fēng)濕因子水平、前列腺素E2生成、乳酸脫氫酶活性均顯著下降，關(guān)節(jié)炎癥狀得到有效改善。Biagi等[43]報(bào)道合成了一些具有SOD活性的硫化1，2，3-三唑衍生物，其藥物活性與青霉胺、硫普羅寧等RA藥物相當(dāng)或更高。Cruz等[44]應(yīng)用脂質(zhì)體包埋技術(shù)將SOD輸送到關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)，結(jié)果表明，脂質(zhì)體介導(dǎo)的SOD在小鼠體內(nèi)均具良好的抗炎效果。最近，Chen等[45]利用硅納米顆粒與含有反式激活蛋白（TAT）結(jié)構(gòu)域的重組SOD1結(jié)合，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞后能有效地保護(hù)細(xì)胞免受ROS氧化損傷，納米藥物為抗氧化酶在體內(nèi)的靶向輸送及RA治療提供了新選擇。目前，SOD能否用作RA臨床治療藥物仍是爭論的學(xué)術(shù)問題，原因包括：①RA疾病與機(jī)體“氧化-抗氧化”水平的關(guān)聯(lián)性仍不十分明確；②若使用SOD進(jìn)行RA抗氧化治療，如何確?；颊唧w內(nèi)“氧化-抗氧化”平衡？③對(duì)SOD的藥效學(xué)、免疫原性、動(dòng)力學(xué)及靶向輸送研究仍需深入；④長期、大劑量肌注SOD的性價(jià)比和潛在危害。

4 小 結(jié)

氧化應(yīng)激既是RA發(fā)生的重要誘因，也是RA產(chǎn)生的病理結(jié)果。目前，對(duì)RA患者體內(nèi)氧化應(yīng)激、抗氧化水平與疾病活動(dòng)的關(guān)聯(lián)性仍有爭論，需要采集更多臨床樣本進(jìn)行系統(tǒng)性研究，進(jìn)一步完善RA發(fā)生中“氧化應(yīng)激—抗氧化”的作用機(jī)制。同時(shí)，要加強(qiáng)SOD及其他相關(guān)抗氧化酶在RA治療中的應(yīng)用研究，包括重組酶表達(dá)、納米藥物構(gòu)建、藥效學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等，為實(shí)現(xiàn)抗氧化酶在RA臨床診斷、藥物治療、預(yù)后評(píng)價(jià)等方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期：2016-01-30；修回日期：2016-05-30