紅花紫荊葉總黃酮提取工藝及其抑菌和抗氧化活性

黃素華　林標(biāo)聲　江龍

摘要：研究了超聲波提取紅花紫荊葉黃酮的條件及其抗菌、抗氧化的性能。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)分析，總黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間45 min，超聲溫度70℃，料液比1：20（m：V），該條件下總黃酮提取率為4.11%。紅花紫荊葉總黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均有抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，對(duì)青霉的抑菌效果不明顯：紅花紫荊葉總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌最小抑菌溶度為0.025 g/mL，對(duì)白色念珠菌最小抑茵濃度為0.05g/mL，對(duì)青霉最小抑菌濃度為0.6g/mL。紅花紫荊葉總黃酮對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽均具有一定的清除作用，在濃度0.5～2.5mg/mL的范圍內(nèi)，清除能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，且強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照維生素c的清除能力，抗氧化能力較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：紅花紫荊；總黃酮；提取工藝；抑菌；抗氧化

紅花紫荊，為豆科（Lgemuniosae）羊蹄甲屬常綠中等喬木。羊蹄甲屬植物在全世界約有600種，遍布于世界熱帶地區(qū)，中國(guó)約有40種，4個(gè)亞種，11個(gè)變種，主產(chǎn)于南部和西南部。紅花紫荊為華南地區(qū)最常見的綠化觀賞樹。羊蹄甲屬植物在亞洲、非洲、中美洲、南美洲作為民間用藥，其根皮、莖皮及葉的提取物可治療腹瀉、風(fēng)濕病和糖尿病。目前，對(duì)羊蹄甲屬植物化學(xué)成分和藥理活性的研究主要包括其化學(xué)成分的分離與鑒定、生物堿的抗腫瘤、莖皮提取物的保肝及抑菌研究。羊蹄甲屬植物主要含有黃酮類、酚酸類、甾醇類。紅花紫荊化學(xué)成分和藥理活性的研究鮮見報(bào)道。黃酮類化合物在羊蹄甲屬植物中普遍存在，具有抗氧化、抗癌、抗衰老、抗腫瘤等功效。紅花紫荊在中國(guó)南方資源非常豐富，由于其樹美花艷，是園林和城市美化的首選樹種，但其藥用價(jià)值卻沒有得到有效開發(fā)。本試驗(yàn)以紅花紫荊為材料，采用超聲波乙醇法提取紅花紫荊葉總黃酮，分析紅花紫荊總黃酮最佳工藝并進(jìn)行抑菌、抗氧化活性的研究，為紅花紫荊的開發(fā)、利用提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料 紅花紫荊葉采自龍巖學(xué)院校園，洗滌干凈后于干燥箱中45℃烘干。用微型植物粉碎機(jī)粉碎，密封于4℃冰箱保存。

1.1.2菌種及培養(yǎng)基 細(xì)菌：金黃色葡萄球菌（G+）及大腸桿菌（G-），牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)。霉菌：青霉，馬丁氏培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母：白色念珠菌，馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1超聲波乙醇法提取紅花紫荊葉總黃酮 參照陶亮亮等總黃酮超聲波提取方法，以NANO2-AI（NO3），比色法提取紅花紫荊葉中的總黃酮。精確稱取5 g紅花紫荊葉粉末，按設(shè)定的料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行超聲波試驗(yàn)。選擇料液比（m：V，g/mL，下同）、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波時(shí)間、超聲溫度4因素，進(jìn)行L（3）正交試驗(yàn)，以紅花紫荊葉中的總黃酮得率為指標(biāo)進(jìn)行考察，正交試驗(yàn)因素和水平見表1。總黃酮得率=總黃酮含量/樣品質(zhì)量×100%。在提取液中測(cè)定總黃酮含量，以繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為參照進(jìn)行計(jì)算，所得的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.076 3X-0.000 2，R2=0.999 2.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.2 mg/mL。

1.2.2紅花紫荊葉總黃酮的抑菌試驗(yàn) 將所得總黃酮配制成濃度分別為0.6、0.4、0.2、0.1 g/mL的溶液。將4種供試菌種活化，制成濃度為1×10⁸個(gè)/mL的菌懸液。取100 μL菌懸液注入各自適合的平板內(nèi)，并用涂布棒將菌液涂布均勻。采用牛津杯法測(cè)定不同濃度總黃酮的抑菌能力。各平板牛津杯中加入樣品溶液50μL，以無(wú)菌去離子水為對(duì)照。樣品溶液加好后，細(xì)菌放置于37℃培養(yǎng)箱中，霉菌和酵母置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。測(cè)定各樣品形成的抑菌圈大小，每種菌種按上述步驟重復(fù)3次。

總黃酮最小抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)：根據(jù)抑菌試驗(yàn)結(jié)果，將紅花紫荊總黃酮配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.05、0.025、0.0125 g/mL的溶液，再按照上述步驟進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定MIC。

1.2.3紅花紫荊葉總黃酮的抗氧化試驗(yàn) 參照孟良玉等的研究方法，測(cè)定紅花紫荊總黃酮的抗氧化活性，包括對(duì)羥自由基的清除作用、對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用、對(duì)亞硝酸鹽的清除作用，3個(gè)試驗(yàn)均以維生素c為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算其清除率，各試驗(yàn)均3次重復(fù)，取平均值。

2.結(jié)果與分析

2.1正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，3個(gè)影響因素中，對(duì)紅花紫荊葉總黃酮含量影響的大小順序?yàn)镈、C、B、A，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間>超聲溫度>料液比，最優(yōu)因素水平組合為A2B3C3D2，即料液比1：20，超聲溫度70℃，超聲時(shí)間45 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。在最佳提取工藝下對(duì)紅花紫荊葉總黃酮進(jìn)行提取，3次重復(fù)，總黃酮的提取率為4.11%。經(jīng)過(guò)D101大孔樹脂分離純化后，總黃酮的得率為3.38%。

2.2紅花紫荊葉總黃酮的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，紅花紫荊葉總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌均有較好的抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果尤為明顯，但對(duì)青霉的抑菌效果不明顯。在一定范圍內(nèi)，隨著紅花紫荊葉總黃酮濃度的升高，抑菌效果增強(qiáng)。

由表3、表4可知，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.025 g/mL，白色念珠菌的最小抑菌濃度為0.05 g/mL，青霉的最小抑菌濃度為0.6g/mL。

2.3紅花紫荊葉總黃酮的抗氧化試驗(yàn)

紅花紫荊葉總黃酮對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽的清除作用結(jié)果見圖1、圖2、圖3。結(jié)果表明，在0.5-2.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著紅花紫荊葉總黃酮濃度的升高，其對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽的清除作用越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)，最大清除率分別達(dá)到68.27%、61.16%、25.75%：紅花紫荊葉總黃酮對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基的清除作用要強(qiáng)于對(duì)亞硝酸鹽的清除作用：相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照維生素c，紅花紫荊葉總黃酮對(duì)這3種物質(zhì)的清除能力更強(qiáng)，說(shuō)明其具有較好的抗氧化作用。

3.小結(jié)

試驗(yàn)表明，紅花紫荊葉黃酮提取的最佳條件是乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間45 min，超聲溫度70℃，料液比1：20。影響因素的大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間>超聲溫度>料液比。最佳提取條件下，黃酮的提取率為4.11%。在紅花紫荊葉總黃酮抑菌活性研究中，總黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)青霉的抑菌作用不明顯。最小抑菌濃度也有較大差異，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.025g/mL，對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度為0.05 g/mL，對(duì)青霉的最小抑菌濃度為0.6 g/mL。紅花紫荊葉總黃酮對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽均具有一定的清除作用，在0.5～2.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，清除能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，且強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照維生素c的清除能力，抗氧化能力較強(qiáng)。本試驗(yàn)研究了紅花紫荊葉片總黃酮的提取及抑菌、抗氧化作用，旨在為校園綠化樹種的選擇及植物抗氧劑、抗衰老保健藥品的開發(fā)與利用提供理論參考。