多倍體育種對(duì)植物次生代謝影響的研究

徐治朋　李凌　魯朝暉　李曉東

摘要：多倍體育種是提高植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的手段之一。從次生代謝產(chǎn)物、次生代謝途徑及其基因調(diào)控方面綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究人員關(guān)于多倍體育種對(duì)植物次生代謝產(chǎn)生影響的研究進(jìn)展，探討了在研究過(guò)程中尚需解決的問(wèn)題，并展望了多倍體育種的研究前景。

關(guān)鍵詞：植物；多倍體育種；次生代謝；人工誘導(dǎo)

一般來(lái)講，多倍體是指染色體組的數(shù)目在3以上（≥3n）的個(gè)體、居群和種。在植物的進(jìn)化過(guò)程中，幾乎所有的真核生物都有過(guò)加倍的過(guò)程。染色體組的多倍化是推動(dòng)植物進(jìn)化的一個(gè)重要因素，是物種形成的重要途徑之一。由于多倍體染色體組倍數(shù)的不同，基因組擴(kuò)張，細(xì)胞核通常會(huì)增大，細(xì)胞的體積也會(huì)變大。因?yàn)槿旧w組的累積效應(yīng)，植物多倍化后使得其植株產(chǎn)生許多新的表型，如生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、器官膨大、生物量、營(yíng)養(yǎng)成分或有效成分增多、生長(zhǎng)期延長(zhǎng)等，同時(shí)由于植株基因活性及酶的差異性使植株的生態(tài)適應(yīng)性和抗病、抗逆性能增強(qiáng)，使其更適合自身或農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要。因此，人工合成多倍體的實(shí)踐與應(yīng)用越來(lái)越普遍，在蔬菜、果樹(shù)、園藝作物、藥用植物等領(lǐng)域，人工培育的多倍體新品種得到廣泛應(yīng)用。

1.多倍體的主要特點(diǎn)

在高等植物中，多倍體由于染色體組來(lái)源不同，可分為同源多倍體和異源多倍體。人們利用其多倍體的特點(diǎn)來(lái)人工誘導(dǎo)培育多倍體植物，其多為同源多倍體。多倍體具有如下幾個(gè)主要特點(diǎn)：①器官巨大性。細(xì)胞核內(nèi)染色體的加倍，使相應(yīng)的細(xì)胞核、細(xì)胞以及組織器官等明顯加大。②綜合抗性增強(qiáng)。多倍體植物由于生理生化特性發(fā)生了不同的變化，一般能適應(yīng)惡劣的環(huán)境條件，具有耐寒、耐旱，耐鹽等特性，表現(xiàn)更為良好。③有機(jī)合成速率提高。由于多倍體染色體數(shù)目增多，基因加倍，新陳代謝比較旺盛，酶活性加倍，從而提高蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、植物堿、單寧等的物質(zhì)的合成速率。

2.多倍體與次生代謝

植物的次生代謝是植物體利用初生代謝產(chǎn)物，在一系列酶的催化作用下，進(jìn)行合成或分解代謝，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物稱為次生代謝產(chǎn)物，如生物堿、糖苷、黃酮類、揮發(fā)油等，這些化合物分子一般很小。許多植物在受到病原微生物的侵染后，產(chǎn)生并大量積累次生代謝產(chǎn)物，以增強(qiáng)自身的免疫力和抵抗力。由于多倍體的基因劑量倍增，從而使植物的一些生理生化過(guò)程隨之加強(qiáng)，新陳代謝旺盛，其體內(nèi)的某些生化成分的含量也相應(yīng)提高及某些成分組成發(fā)生改變。因此可以通過(guò)誘導(dǎo)多倍體的方式對(duì)植物次生代謝進(jìn)行調(diào)控，從而提高次生代謝物的產(chǎn)量或改變次生代謝物的成分組成，也可以提高植物的防御能力。大量有益的次生代謝物可用于食品生產(chǎn)、醫(yī)藥生產(chǎn)和人類疾病的防治等方面。

3.多倍體對(duì)次生代謝產(chǎn)物成分的影響

植物次生代謝產(chǎn)物種類繁多，在來(lái)源、結(jié)構(gòu)和功能方面均有不同之處，目前已知的結(jié)構(gòu)達(dá)3萬(wàn)余種。植物次生代謝產(chǎn)物根據(jù)結(jié)構(gòu)異同可分為酚類、萜類和含氮化合物等三大類。各大類再根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)又可分為黃酮類、簡(jiǎn)單酚類、醌類、揮發(fā)油類、萜類、生物堿類和胺類等。

多倍體誘變過(guò)程中發(fā)生的染色體重排、重復(fù)基因組的表達(dá)和基因劑量倍增，從而使多倍體植株的一些生理生化過(guò)程隨之發(fā)生改變，最終引起株系次生代謝物的含量和成分的改變。染色體倍性的增加往往影響植物生理結(jié)構(gòu)變化，如葉片密度大小、氣孔大小、細(xì)胞大小和單位細(xì)胞的葉綠體數(shù)目等方面的變化，因而加倍后植物的葉片往往比二倍體的葉面積大而且厚度也偏大，進(jìn)而引起多倍體植物的光合作用大幅度提高，各種酶作用加強(qiáng)，生理代謝功能提高，次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也相應(yīng)提高。大量資料顯示黃酮類、揮發(fā)油類、堿類提高比較明顯，如多倍體丹參中有效化學(xué)成分丹參酮含量高于二倍體對(duì)照品種；四倍體白芷藥材中歐前胡素含量達(dá)0.46%，二倍體對(duì)照藥材僅為0.225%，含量增加了104.4%；四倍體藥用薯蕷中的薯蕷皂甙元含量比二倍體對(duì)照提高了20%；多倍體人參中人參皂苷的含量比二倍體有顯著提高；多倍體杜仲的幼苗中綠原酸含量比沒(méi)有誘導(dǎo)的杜仲幼苗提高了17.78%；四倍體紫錐菊中菊苣酸、綠原酸和烷基酰胺類化合物的含量都要高于對(duì)照二倍體；四倍體埃及天仙子中莨菪堿含量相比二倍體提高了200%。國(guó)內(nèi)外研究主要集中在藥用植物上面，大多數(shù)多倍體植株中次生代謝產(chǎn)物的含量都有所增加，對(duì)于很多藥用植物，次生代謝產(chǎn)物為藥用有效成分，非常具有實(shí)用價(jià)值。已知多種中藥材染色體加倍后有效次生代謝物大幅度提高，并且已經(jīng)應(yīng)用到了實(shí)際生產(chǎn)中，部分研究成果見(jiàn)表1。

植物染色體的多倍化在不少情況下雖然可以提高次生代謝物成分含量，但染色體倍性的增加與化學(xué)成分含量的變化并不完全呈正比關(guān)系，Yankoulov等對(duì)胡椒薄荷誘導(dǎo)出的同源五倍體與二倍體、四倍體和六倍體的精油含量和產(chǎn)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二倍體優(yōu)于四倍體，而五倍體和六倍體都比二倍體和四倍體低：另外，多倍體與二倍體植物相比，并不只限于在次生代謝物含量上有影響，也能改變次生代謝物的成分組成及產(chǎn)生新的次生代謝物。胡彥[32利用秋水仙素處理二倍體紫蘇后，篩選出了5個(gè)具有潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值的紫蘇多倍體新品系，其中多紫2號(hào)葉片揮發(fā)油的組分與二倍體親本相比，缺乏紫蘇醛，但產(chǎn)生了含量較高的新組分—檸檬烯（6.32%）：李彬等對(duì)四倍體菘藍(lán)根的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)一種新的化合物——4-（1，2，3-三羥基丙基）-2，6-二甲氧基苯-1-0-B-D-葡萄糖苷。

4.多倍體對(duì)次生代謝途徑及其基因表達(dá)的影響

次生代謝過(guò)程被認(rèn)為是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中對(duì)生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，它在處理植物與生態(tài)環(huán)境的關(guān)系中充當(dāng)著重要的角色。植物次生代謝途徑是高度分支的途徑，這些途徑在植物體內(nèi)或細(xì)胞中并不全部開(kāi)放，而是定位于某一器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中并受到獨(dú)立的調(diào)控。由于多倍體植物染色體數(shù)目增多，基因劑量加倍，同工酶活性增強(qiáng)，從而提高次生代謝產(chǎn)物的合成速率。與二倍體植株相比，多倍體植株中某些特定次生代謝物產(chǎn)量的提高可以在宏觀上得以體現(xiàn)。植物的次生代謝途徑較為復(fù)雜，由多種基因調(diào)控，多倍體植株中基因調(diào)控過(guò)程的變化還有待進(jìn)一步研究。

4.1多倍體對(duì)次生代謝途徑的影響

次生代謝物產(chǎn)生的途徑多種多樣，而且產(chǎn)量很少，其產(chǎn)物具有不穩(wěn)定性難以分離，許多途徑目前仍不清楚。次生代謝物化合物的合成過(guò)程一般可分為3個(gè)階段：中間體的生成、類化合物的合成和最后的修飾。參與生物合成途徑的酶種類多樣，其中關(guān)鍵酶決定了下游產(chǎn)物合成與積累的量，這些酶一般位于途徑的分支點(diǎn)或產(chǎn)物合成的下游，催化合成前體和各種中間體的形成。通過(guò)調(diào)控這些關(guān)鍵酶的表達(dá)，可以提高植物中相關(guān)次生代謝物的產(chǎn)量。由于同源多倍體植株中遺傳物質(zhì)的變化，調(diào)控各個(gè)化合物的生物合成途徑的代謝機(jī)制被擾亂，多倍體中次生代謝物也會(huì)有所變化。這些變化包含次生代謝化合物成分的有無(wú)、含量的高低，同源多倍體由于基因劑量的增加，影響到次生代謝物生物合成過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性的變化，進(jìn)而影響到產(chǎn)生次生代謝物的變化。如四倍體紫錐菊中PAL（苯丙氨酸解氨酶）、C4H（肉桂酸-4-羥基化酶）的活性均比二倍體高，進(jìn)一步證明四倍體紫錐菊具有更強(qiáng)合成能力，并且四倍體紫錐菊苣酸和烷基酰胺類含量比二倍體高。Lavania等在研究多種香茅屬植物時(shí)，發(fā)現(xiàn)同源四倍體植物的香茅精油含量要高于對(duì)照的二倍體：在對(duì)精油成分分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)精油成分種類沒(méi)有明顯變化，但是其中總醇類化合物所占比重增加，而總?cè)╊惢衔镎急认陆?。同源四倍體的次生代謝途徑中，合成這些單萜類物質(zhì)的生物酶發(fā)生了改變，從而可能改變了次生代謝通道，某些物質(zhì)的合成步驟要比二倍體短，才導(dǎo)致了總醇總?cè)╊愇镔|(zhì)比重的改變。

4.2多倍體對(duì)次生代謝基因表達(dá)的影響

雖然同源多倍體植物與二倍體植物含有相同的基因，但是表現(xiàn)性狀有所差異，這與不涉及DNA序列改變的多倍體表觀遺傳變異是有關(guān)系的。同源多倍體中基因冗余導(dǎo)致其細(xì)胞核增大，進(jìn)而加大了基因表達(dá)上的復(fù)雜程度，其相應(yīng)的遺傳改造會(huì)致使某些相應(yīng)基因的激活表達(dá)和某些相應(yīng)基因的抑制表達(dá)，在植物次生代謝途徑中調(diào)控基因的表達(dá)及相關(guān)蛋白酶的表達(dá)具有特異性。譬如，二倍體中有的化合物在相應(yīng)的多倍體中缺失，可能是已有結(jié)構(gòu)基因的功能性抑制；二倍體中沒(méi)有的化合物在相應(yīng)的多倍體中的表達(dá)，可以理解為先前沉默的結(jié)構(gòu)基因的功能性激活。豆峻嶺研究不同倍性西瓜果實(shí)番茄紅素發(fā)現(xiàn)整個(gè)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中番茄紅素含量表現(xiàn)為多倍體大于二倍體，對(duì)5個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量分析表明只有PSY的表達(dá)量是二倍體最大，PDS、ZDS、CRTISO、LCYb基因的表達(dá)量均為多倍體大于二倍體。

隨著染色體數(shù)目的增倍，植物多倍體不僅加強(qiáng)了基因的重組，而且擴(kuò)大了重組基因組的表達(dá)，如上面所提及的一些關(guān)鍵酶含量的提高、次生代謝產(chǎn)物含量的提高。這種多倍化代表了基因組“沖擊”的一種形式，所產(chǎn)生的影響就削弱了基因組抑制系統(tǒng)的相互作用，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)座因子的活性。而轉(zhuǎn)座因子的活動(dòng)會(huì)改變基因組中某些基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)式樣，同時(shí)有可能改變基因組中DNA甲基化的水平和外遺傳修飾，改變多倍體基因組中不同基因組成分間的相互關(guān)系，從而對(duì)整個(gè)基因組中基因的表達(dá)以及多倍體的表型產(chǎn)生影響。所形成的同源多倍體或異源多倍體的多倍化表現(xiàn)與全基因組的變化是密切相關(guān)的；相應(yīng)性狀的變化是受其多倍體表觀遺傳機(jī)制所控制的，如DNA甲基化、異染色質(zhì)組蛋白修飾等。植物正常生長(zhǎng)發(fā)育必須在體內(nèi)存在著數(shù)量和程度不等的甲基化的DNA，試驗(yàn)表明甲基化水平降低或不足的植株會(huì)表現(xiàn)明顯的表型異常，菊花莖尖組織經(jīng)一定濃度的5-azaC處理后可以使叢生芽的產(chǎn)生受抑制，并能進(jìn)一步影響植物根系的產(chǎn)生和生長(zhǎng)。大量研究表明，伴隨著染色體倍性的增加，多倍體植物的全基因組DNA甲基化水平是增強(qiáng)的。而植物DNA甲基化水平與其倍性是非線性相關(guān)的，并不是倍性越大，它的甲基化水平越高。Lavania等還發(fā)現(xiàn)所研究的多種香茅屬同源四倍體全基因組的DNA甲基化（5-mC）水平要高于對(duì)照的二倍體，可能與它所表現(xiàn)出來(lái)的精油含量提高、精油成分中總醇總?cè)╊愇镔|(zhì)比重的改變是有關(guān)聯(lián)的。

5.問(wèn)題與展望

過(guò)去的十幾年中，人們對(duì)植物多倍體育種的研究已取得了巨大進(jìn)展，然而在這一研究中還存在著一些亟待解決的問(wèn)題。①誘變劑問(wèn)題。雖然秋水仙素的誘導(dǎo)效率較高，但其價(jià)格較貴且有劇毒，植物幼苗經(jīng)秋水仙素處理后，爛苗、死苗現(xiàn)象嚴(yán)重，成活率很低：即使成活，也很容易出現(xiàn)嵌合體、育性低等問(wèn)題。②嵌合體現(xiàn)象。經(jīng)誘變處理后并不是所有細(xì)胞都可以加倍為多倍體，這就造成了嚴(yán)重的嵌合體現(xiàn)象，使得真正同一倍性水平的多倍體頻率過(guò)低。③遺傳穩(wěn)定性。多倍體植物常存在一些不良性狀，如結(jié)子率低，育性下降，嚴(yán)重影響了多倍體植物的遺傳。

在多倍體育種中，誘變劑的篩選已經(jīng)有了不少的研究。研究者發(fā)現(xiàn)氨磺靈（Oryzalin）可以作為新型化學(xué)誘變劑，Gallone等用氨磺靈和秋水仙素同時(shí)誘導(dǎo)車前草屬植物，使用濃度為289uzmol/L的氨磺靈誘變成四倍體的概率為45.7%，而用了1000umol/L秋水仙素的誘變率只有28.6%：其他的研究也表明氨磺靈比傳統(tǒng)誘變劑秋水仙素對(duì)植株生長(zhǎng)影響小，誘變效果好，且毒性小、劑量小。利用氨磺靈處理已成功誘導(dǎo)蘭花、紫荊、茅膏菜等植物的多倍體，因此氨磺靈可以替代秋水仙素作為一種新型高效的多倍體誘變劑。

隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的日臻成熟，多倍體育種與組培技術(shù)、遠(yuǎn)緣雜交、現(xiàn)代分子生物技術(shù)相結(jié)合，嵌合體現(xiàn)象及遺傳穩(wěn)定性問(wèn)題有望得到更好地解決。同源多倍體孕性低，有可能使多倍體材料丟失，利用組織培養(yǎng)技術(shù)建立無(wú)性繁殖系，使材料得以保存，也給育種工作者提供了充分選擇的機(jī)會(huì)。利用組織培養(yǎng)保存材料也可以使其生理反應(yīng)逐步協(xié)調(diào)，優(yōu)良性狀才能充分表現(xiàn)出來(lái)，才更利于在多倍體水平上的選擇，培育出優(yōu)良多倍體品種。另外也可以通過(guò)改變培養(yǎng)基的化學(xué)成分和物理狀態(tài)，使得更利于多倍體細(xì)胞的分化以及利用組織培養(yǎng)誘發(fā)不定芽消除嵌合體現(xiàn)象。通過(guò)種間雜交后經(jīng)染色體加倍，可以獲得異源多倍體，這不僅可以克服遠(yuǎn)緣雜種的育性障礙，也可以避免嵌合體分離這一環(huán)節(jié)直接獲得純合多倍體。

另一方面，不是任何植物品種都適合進(jìn)行多倍體育種。多倍體化在一定程度上可以提高某些次生代謝產(chǎn)物的合成，增強(qiáng)植物某些方面的品質(zhì)，但是每種植物都有自己最適的染色體倍性水平，人工誘導(dǎo)的多倍化應(yīng)該考慮到物種本身的適應(yīng)性，不能破壞物種的遺傳性能及自然規(guī)律。在自然界中，多倍化現(xiàn)象普遍存在，但對(duì)于多倍化發(fā)生的頻率以及不同植物發(fā)生多倍化的速度方面的了解及研究仍然需要進(jìn)一步加強(qiáng)。

近些年由于分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)研究方法的進(jìn)步，人們對(duì)植物多倍體研究不再局限于細(xì)胞學(xué)特征、形態(tài)特點(diǎn)、生活習(xí)性以及地理分布式樣方面，更是在基因組的起源、多倍體的性質(zhì)及多倍體化的分子后果、多倍體基因組的進(jìn)化動(dòng)態(tài)方面有了進(jìn)一步研究。目前針對(duì)自然形成的多倍體的基因組進(jìn)化動(dòng)態(tài)的研究較多，如四倍體、六倍體小麥的研究，蕓薹屬植物的研究；而對(duì)人工誘導(dǎo)加倍后的多倍體，對(duì)其基因和基因組的動(dòng)態(tài)變化與多倍體所獲得的新的進(jìn)化性狀關(guān)系的研究較少，具體到與某一特定的次生代謝物相關(guān)的基因及基因組動(dòng)態(tài)變化的研究報(bào)道就更少了。在多倍體分子層面，對(duì)功能基因的丟失、沉默和激活的研究有助于加深對(duì)多倍體化后基因水平上變化機(jī)制的理解，從而更大程度上在植物多倍體化后代中進(jìn)行相應(yīng)的性狀改良，提高相應(yīng)蛋白酶的表達(dá)量，增加次生代謝物的產(chǎn)量。

除了在多倍體育種方面存在問(wèn)題，在多倍體分子水平的研究還存在很多問(wèn)題，關(guān)于多倍體基因進(jìn)化機(jī)制上的研究工作仍需要我們不斷努力。

多倍體植物由于染色體倍性的提高，不僅使器官表現(xiàn)為巨大性，提高了植株的抗逆性，而且由于基因的重組，加大了基因表達(dá)上的復(fù)雜程度，改變了各種代謝途徑中各種酶的活性，從而提高了次級(jí)代謝產(chǎn)物含量。因此，植物多倍體育種是一種可以獲得較高次生代謝產(chǎn)物含量植物新品種的方式，是加大遺傳變異、改良作物品性的重要手段。相信隨著多倍體育種中難題的克服，育種技術(shù)和誘變方法的提高，現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的進(jìn)步，植物多倍體育種將在提高植物次級(jí)代謝產(chǎn)物方面展現(xiàn)其巨大的潛力。