雄激素受體、磷酸化蛋白激酶B在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及意義

鄒偉 朱淑玲 蔡方

[摘要] 目的 探討雄激素受體（AR）、磷酸化蛋白激酶B（P-PKB）在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及意義。 方法 收集2012年3月～2015年3月惠州市中心人民醫(yī)院收治的乳腺癌患者115例，其中三陰性乳腺癌54例，非三陰性乳腺癌61例。采用免疫組化S-P法檢測(cè)AR、P-PKB表達(dá)。比較三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌AR、P-PKB表達(dá)陽性率，分析三陰性乳腺癌組織中AR和P-PKB表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。 結(jié)果 三陰性乳腺癌AR陽性表達(dá)率明顯低于非三陰性乳腺癌（P < 0.05）；三陰性乳腺癌P-PKB陽性表達(dá)率明顯高于非三陰性乳腺癌（P < 0.05）；三陰性乳腺癌組織中AR的表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈顯著負(fù)相關(guān)（r = -0.295、-0.311，P < 0.05）；三陰性乳腺癌組織中P-PKB的表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈顯著正相關(guān)（r = 0.332、0.329，P < 0.05）。 結(jié)論 AR、P-PKB在三陰性乳腺癌的表達(dá)具有重要的意義，可以作為預(yù)后的重要指標(biāo)，并有望成為未來治療三陰性乳腺癌的新靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 雄激素受體；磷酸化蛋白激酶B；三陰性乳腺癌；表達(dá)

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）03（b）-0124-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of androgen receptor （AR） and phosphorylated protein kinase B （P-PKB） in triple negative breast cancer. Methods From March 2012 to March 2015， in Central People's Hospital of Huizhou City， 115 patients with breast cancer were selected， among them， 54 cases were triple negative breast cancer， 61 cases were non-triple negative breast cancer. The expression of AR and P-PKB was detected by immunohistochemistry S-P method. The expression of AR， P-PKB， and AR in triple negative breast cancer and triple negative breast cancer tissues were compared， and the relationship between the expression of P-PKB and the clinicopathological parameters were analyzed. Results AR positive expression rate of triple negative breast cancer was significantly lower than non-triple negative breast cancer （P < 0.05）； P-PKB positive expression rate of triple negative breast cancer was significantly higher than non triple negative breast cancer （P < 0.05）； AR expression of triple negative breast cancer tissues had a significantly negative correlation with clinical stage and lymph node metastasis（r = -0.295， -0.311， P < 0.05）； P-PKB expression of triple negative breast cancer tissues had a significantly positive correlation with clinical stage and lymph node metastasis（r = 0.332， 0.329， P < 0.05）. Conclusion AR， P-PKB expression have a great significance in triple negative breast cancer， can be used as an important indicator of prognosis， and they are expected to become new targets in treatment of triple negative breast cancer.

[Key words] Androgen receptor； Phosphorylated protein kinase B； Triple negative breast cancer； Expression

三陰性乳腺癌是指孕激素受體（PR）陰性、雌激素受體（ER）陰性以及人類表皮生長因子受體2（HER2）低表達(dá)的乳腺癌，是一種被認(rèn)為獨(dú)立的臨床病理類型，其占乳腺癌的15%～20%[1]。相比其他類型乳腺癌，三陰性乳腺癌預(yù)后性差，腫瘤分級(jí)高，且更容易復(fù)發(fā)[2-3]。靶向治療及內(nèi)分泌治療對(duì)三陰性乳腺癌的治療效果差，目前，放化療是其主要治療手段，但是治療效果仍然不太理想[4]，因此，三陰性乳腺癌臨床治療方案的制訂一直是臨床醫(yī)師的重大挑戰(zhàn)。雄激素是性激素的一種，雄激素受體（AR）及其配體雄激素在乳腺生物學(xué)上及致癌作用上扮演重要角色[5]。蛋白激酶B（PKB）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，磷酸化蛋白激酶B（P-PKB）即活化的PKB，其在促進(jìn)細(xì)胞異常繁殖分化、促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[6]?；谝陨戏治?，本研究通過分析三陰乳腺癌患者與非三陰乳腺癌患者及三陰乳腺癌不同分期患者間的AR、P-PKB的表達(dá)情況，以探討AR、P-PKB在三陰性乳腺癌的表達(dá)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年3月～2015年3月惠州市中心人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的三陰性乳腺癌患者54例，均經(jīng)病理學(xué)檢查以及免疫組化染色確認(rèn)，以ER、PR陰性及HER2低表達(dá)定義為三陰性乳腺癌。所有患者均為女性，年齡30～75歲，平均（52.34±8.93）歲；臨床分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期29例，Ⅲ期18例；腫瘤≥5 cm 8例，<5 cm 46例；淋巴結(jié)陽性29例，淋巴結(jié)陰性25例。同時(shí)選擇我院同期收治的非三陰性乳腺癌61例，年齡28～74歲，平均（51.49±9.42）歲；臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期31例，Ⅲ期15例；腫瘤≥5 cm 3例，腫瘤<5 cm 51例；淋巴結(jié)陽性24例，淋巴結(jié)陰性30例。兩組患者年齡、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①有完整的臨床資料，包括一般情況、治療方式、腫瘤大小、病理診斷等；②未行新輔助化療；③簽屬知情同意書者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院時(shí)生命體征不平穩(wěn)患者；②遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移者；③攜帶肝炎病毒患者，或嚴(yán)重肝、腎等臟器功能不全患者；④合并其他惡性腫瘤者；⑤手術(shù)禁忌或過敏體質(zhì)者。

1.3 主要儀器與試劑

石蠟切片機(jī)（Thermo Shandon Ltd.，F(xiàn)inesse E型號(hào)），顯微鏡（上海彼愛姆，XSP-BM-2CB型號(hào)），離心機(jī)（山東博科生產(chǎn)，BK-TDZ5型號(hào)），免疫組織修復(fù)盒（北京馳明瑞生物科技有限公司，18孔規(guī)格），蛋白激酶B多克隆抗體（上海鈺博公司，1 mg/mL），雄激素受體（AR）多克隆抗體（上海鈺博公司，1 mg/mL），自制PBS緩沖液，自制檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），自制0.3%過氧化氫溶液等。

1.4 檢測(cè)方法

采用免疫組化S-P法檢測(cè)AR、P-PKB表達(dá)，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。對(duì)115份包埋腫瘤石蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，每張切片厚度為4 μm，置于60℃烤箱中石蠟包埋切片脫蠟（烤箱內(nèi)放置120 min），切片脫蠟置水，采用檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，將其于過氧化氫溶液（濃度為0.3%）中浸入10 min，阻斷內(nèi)源化過氧化氫酶的活性，然后再采用10%正常血清封閉，放置于室溫孵育10 min，滴加雄激素受體（AR）多克隆抗體、蛋白激酶B多克隆抗體，放置于4℃下過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，再放置于37℃溫箱孵育20 min，再滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素的三抗，再放置于37℃溫箱孵育20 min，DAB染色。顯微鏡觀察。

1.5 結(jié)果觀察與判斷標(biāo)準(zhǔn)

AR的陽性表達(dá)主要依據(jù)是細(xì)胞核內(nèi)是否出現(xiàn)染色為棕褐色顆粒沉積。在400倍鏡視野下隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)選定視野中的腫瘤細(xì)胞總數(shù)和AR陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算AR陽性腫瘤細(xì)胞百分比，再求5個(gè)視野的平均值作為判斷的結(jié)果，根據(jù)文獻(xiàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[7]，將AR陽性腫瘤細(xì)胞百分比分為四個(gè)等級(jí)，<5%記為0分，5%～<25%記為1分，25%～≤50%記為2分，>50%記為3分。同時(shí)，計(jì)算染色強(qiáng)度計(jì)分，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下：無色記為0分，淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。最終評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以陽性腫瘤細(xì)胞百分比計(jì)分與染色強(qiáng)度計(jì)分相加結(jié)果為判斷依據(jù)，總分0分代表陰性表達(dá)，≥1分代表陽性表達(dá)（其中1～2分為弱陽性表達(dá)（記為1+），3～4分為中等陽性表達(dá)（記為2+），≥5分為強(qiáng)陽性表達(dá)（記為3+）。

P-PKB的陽性表達(dá)主要依據(jù)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)是否出現(xiàn)染色為棕黃色顆粒分布。在400倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)選定視野中的腫瘤細(xì)胞總數(shù)和P-PKB陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算P-PKB陽性腫瘤細(xì)胞百分比，再求5個(gè)視野的平均值作為判斷的結(jié)果，根據(jù)文獻(xiàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[8]，將P-PKB陽性腫瘤細(xì)胞百分比分為四個(gè)等級(jí)，<5%記為0分，5%～ <25%記為1分，25%～<50%記為2分，≥50%記為3分。同時(shí)，計(jì)算染色強(qiáng)度計(jì)分，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下：無色記為0分，淺黃色記為1分，染色強(qiáng)度為黃色記為2分，棕黃色記為3分。最終評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以陽性腫瘤細(xì)胞百分比計(jì)分與染色強(qiáng)度計(jì)分相加結(jié)果為判斷依據(jù)，總分0分代表陰性表達(dá)，≥1分代表陽性表達(dá)（其中1～2分為弱陽性表達(dá)（記為1+），3～4分為中等陽性表達(dá)（記為2+），≥5分為強(qiáng)陽性表達(dá)（記為3+）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與AR和P-PKB的相關(guān)性情況采用Spearman相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AR和P-PKB在乳腺癌組織中表達(dá)

三陰性乳腺癌的AR陽性表達(dá)率明顯低于非三陰性乳腺癌（P < 0.05）；三陰性乳腺癌的P-PKB陽性表達(dá)率明顯高于非三陰性乳腺癌（P < 0.05）。見表1。

2.2 三陰性乳腺癌組織中AR表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性

三陰性乳腺癌組織中AR的表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈顯著負(fù)相關(guān)（P < 0.05）。見表2。

2.3 三陰性乳腺癌組織中P-PKB表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性

三陰性乳腺癌組織中P-PKB的表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈顯著正相關(guān)（P < 0.05）。見表3。

3 討論

三陰性乳腺癌是基底細(xì)胞樣型中的一類乳腺癌，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，患者容易出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移及腦轉(zhuǎn)移[9-10]，因此，在所有類型的乳腺癌中，三陰性乳腺癌是預(yù)后性較差，腫瘤分級(jí)較高，最容易復(fù)發(fā)的一類乳腺癌[11-12]?，F(xiàn)階段，三陰性乳腺癌缺乏有效的治療手段，靶向治療及內(nèi)分泌治療幾乎無效，而放化療治療也難以取得十分滿意的效果[13-14]。為了尋找三陰性乳腺癌有效的治療手段，眾多學(xué)者開始從一些腫瘤細(xì)胞分子標(biāo)志物入手研究了一些新的治療手段，如表皮生長因子受體抑制劑、抗血管生成抑制等等[15-16]，但是這些新的治療手段的有效性尚未得到大量臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。為此，本研究想通過分析AR與P-PKB在三陰乳腺癌患者中的表達(dá)情況，來探討AR與P-PKB在三陰性乳腺癌患者病情發(fā)展中的作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)三陰乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

雄激素是一種性激素，AR是雄激素作用的中介物質(zhì)，屬于細(xì)胞核內(nèi)的X染色體上基因所編碼的核受體，根據(jù)相關(guān)研究顯示[17]，AR及其配體雄激素在乳腺癌形成與發(fā)展中扮有重要角色。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，54例三陰性乳腺癌患者中AR陽性表達(dá)率為48.14%，這也與相關(guān)報(bào)道一致。研究結(jié)果還顯示，三陰性乳腺癌患者的AR陽性表達(dá)率明顯低于非三陰性乳腺癌患者（P < 0.05），這說明在三陰性乳腺癌患者中AR陽性表達(dá)率較低，而在Qi等[18]的研究結(jié)果中，證實(shí)AR的陽性表達(dá)與ER和PR表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)性，這解釋了本研究中三陰性乳腺癌患者中AR陽性表達(dá)率較低的原因。目前，ER和PR已經(jīng)成為公認(rèn)的判斷乳腺癌惡化程度的權(quán)威指標(biāo)，而AR的陽性表達(dá)又與ER和PR有一定的關(guān)聯(lián)性，因此，AR的陽性表達(dá)也可能作為預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，三陰性乳腺癌組織中AR的表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈顯著負(fù)相關(guān)（P < 0.05），這說明AR陰性患者腫瘤組織臨床分期較高且易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而AR陽性患者腫瘤組織臨床分期較低且不易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這也正好證明了AR的陽性表達(dá)可以作為三陰乳腺癌患者的預(yù)后的重要指標(biāo)，究其原因，可能是因?yàn)锳R在抑制乳腺癌細(xì)胞增殖中起到了一定的作用，阻止了乳腺原位癌向浸潤性癌的轉(zhuǎn)變。另外，干擾AR信號(hào)通路可能對(duì)治療三陰性乳腺癌患者具有一定的積極意義，因此，AR也有可能成為未來治療三陰性乳腺癌的新靶點(diǎn)。

PKB屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，P-PKB即活化的PKB，其在促進(jìn)細(xì)胞異常繁殖分化、促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮有重要角色，已有研究顯示[19-20]，許多腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與P-PKB的表達(dá)密切相關(guān)，但是目前還未有關(guān)于三陰性乳腺癌患者P-PKB的表達(dá)情況的研究[21]。本文研究結(jié)果顯示，三陰性乳腺癌患者的P-PKB陽性表達(dá)率明顯高于于非三陰性乳腺癌患者（P < 0.05），說明三陰性乳腺癌具有P-PKB陽性高表達(dá)性，而P-PKB陽性高表達(dá)性又導(dǎo)致腫瘤組織細(xì)胞的繁殖分化，這也決定了三陰性乳腺癌預(yù)后性差、腫瘤分級(jí)高、易復(fù)發(fā)等特征。本文的研究結(jié)果也在一定程度上證實(shí)了以上推論，研究結(jié)果顯示，陰性乳腺癌組織中P-PKB的表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈顯著正相關(guān)（P < 0.05），說明P-PKB陽性高表達(dá)三陰性乳腺癌患者的腫瘤臨床分期較高且易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而P-PKB陰性及陽性低表達(dá)三陰性乳腺癌患者的腫瘤臨床分期較低且不易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。綜合以上分析，三陰性乳腺癌患者中P-PKB表達(dá)情況可以作為三陰性乳腺癌患者的一項(xiàng)重要預(yù)后指標(biāo)。另外，P-PKB陽性高表達(dá)是由于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/PKB信號(hào)通路異?；罨穑琍I3K/PKB信號(hào)通路的活化又與唯一的抑癌基因PTEN缺失密切相關(guān)，而以目前的醫(yī)療技術(shù)，還無法解決基因缺失引起的疾病，唯一能做到的就是降低PI3K/PKB信號(hào)通路的活化狀態(tài)，降低P-PKB的陽性表達(dá)，因此，P-PKB也有望成為治療三陰性乳腺癌的新靶點(diǎn)。

綜上所述，AR、P-PKB在三陰性乳腺癌的表達(dá)具有重要的意義，可以作為預(yù)后的重要指標(biāo)，并有望成為未來治療三陰性乳腺癌的新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2015-12-08 本文編輯：蘇 暢）