紅花水煎液對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的硬皮病小鼠肺組織膠原含量的影響

胡謀波 呂軍影

【摘 要】目的：觀察紅花水煎液對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的硬皮病小鼠肺組織的HE和MASSON染色病理變化及MASSON染色膠原含量分布變化，探討紅花對(duì)硬皮病肺纖維化的影響。方法：將32只BALB/C小鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組、紅花組，每組8只。除空白對(duì)照組外，各組建立硬皮病小鼠模型。醋酸潑尼松組予醋酸潑尼松混懸液0.2 mL灌胃，紅花組予紅花水煎液0.2 mL灌胃，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組予同體積生理鹽水灌胃。采用HE和MASSON染色觀察各組小鼠肺的病理改變，使用IPP 6.0圖像分析軟件測(cè)定MASSON染色膠原含量分布變化，SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肺組織膠原含量顯著升高（P < 0.05）；與模型對(duì)照組比較，醋酸潑尼松組和紅花組小鼠肺組織膠原含量明顯降低（P < 0.05）；醋酸潑尼松組與紅花組膠原含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：紅花能夠有效降低博萊霉素誘導(dǎo)的硬皮病小鼠肺組織膠原含量，具有抗硬皮病肺纖維化的作用。

【關(guān)鍵詞】 硬皮??；肺纖維化；紅花水煎液；膠原含量；博萊霉素；小鼠

【ABSTRACT】Objective：To probe the effects of safflower decoction on pulmonary fibrosis by observing the staining pathological changes of HE and MASSON and the distribution of MASSON staining collagen content in bleomycin-induced mice with scleroderma.Methods：Thirty-two BALB/C mice were randomly divided into 4 groups：a blank control group，a model control group，a prednisone group and a safflower group，8 rats in each.Except for the blank control group，mouse models with scleroderma were established in other groups.Rice in the Prednisone group were given intragastric administration with 0.2 mL prednisone suspension，while those in the safflower group were given safflower decoction in the same way.Mice in the blank control group and the model control group were also given intragastric administration with saline of he same volume.HE and MASSON stainings were used to observe the pathological changes of lung in each group.IPP6.0 image analysis software was used to determine the distribution of MASSON staining collagen content，and SPSS17.0 software was used for statistical analysis.Results：Compared with the blank control group，the collagen content in lung tissue of mice in the model control group significantly increased（P < 0.05）.Compared with the model control group，the collagen content in lung tissue of mice in the prednisone group and the safflower group significantly decreased （P < 0.05）.The difference of collagen content between the prednisone group and the safflower group was not statistically significant（P > 0.05）.Conclusion：Safflower can effectively reduce the lung collagen content in bleomycin-induced mice with scleroderma，with a function of against pulmonary fibrosis.

【Keywords】 scleroderma；pulmonary fibrosis；safflower decoction；lung；collagen content；bleomycin；mice

硬皮?。╯cleroderma）是一種原因不明，臨床上以局限性或彌漫性皮膚增厚和纖維化為特征，也可累及內(nèi)臟（肺、心、消化道等器官）的結(jié)締組織疾病。其發(fā)病機(jī)制核心為成纖維細(xì)胞合成過多的膠原，導(dǎo)致皮膚和內(nèi)臟的纖維化。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，博萊霉素誘導(dǎo)的硬皮病小鼠模型與臨床硬皮病患者組織病理改變和免疫組化變化極為相似，適用于對(duì)硬皮病皮膚和肺纖維化及血管病變的研究[1-3]。本實(shí)驗(yàn)在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠硬皮病模型下用紅花水煎液干預(yù)治療，探討紅花治療硬皮病肺纖維化的

作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/C小鼠32只，雌性，6～8周，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，來自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（桂）2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（桂）2014-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑與儀器 注射用鹽酸博萊霉素（日本化藥株式會(huì)社，生產(chǎn)批號(hào)440392）；醋酸潑尼松片（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)150301）；紅花（南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)140901）。以上藥品均來自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。HE染色試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)20160106，產(chǎn)品序號(hào)D006）；Masson染色試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)20160106，產(chǎn)品序號(hào)D026）；OLYMPUS正置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS，規(guī)格型號(hào)BX53）。

1.3 給藥劑量 根據(jù)人體與動(dòng)物藥物等效劑量換算方法，醋酸潑尼松用量為0.09 mg·d-1，紅花用量為30 mg·d-1。

1.4 藥品制備 博萊霉素溶于高壓滅菌后的pH = 7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）中，制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200 μg·mL-1的博來霉素磷酸鹽緩沖液保存?zhèn)溆?。醋酸潑尼松片用蒸餾水溶解配成0.45 mg·mL-1混懸液備用。紅花采用常規(guī)方法煎煮成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15 g·mL-1的紅花水煎液保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組和處理 將32只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組、紅花組，每組8只。按照參考文獻(xiàn)[1-3]方法剃除小鼠背部被毛約1.5 cm×1.5 cm，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后開始實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組用PBS 0.1 mL皮下注射，模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組和紅花組予博萊霉素磷酸鹽緩沖液0.1 mL背部皮下注射，4組均為每日1次，連續(xù)注射28 d。造模同時(shí)即行藥物干預(yù)，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組予生理鹽水0.2 mL灌胃，醋酸潑尼松組予醋酸潑尼松混懸液0.2 mL（含醋酸潑尼松0.09 mg）灌胃，紅花組予紅花水煎液0.2 mL（含紅花30 mg）灌胃，各組小鼠均每日灌胃1次，共28 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食12 h，水合氯醛腹腔注射處死小鼠，取左肺置于甲醛中固定，制成石蠟切片。

2.2 病理學(xué)檢查 小鼠肺組織石蠟切片經(jīng)HE和MASSON染色后進(jìn)行病理檢查，分析各組之間肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。

2.3 肺纖維化評(píng)分 根據(jù)HE染色病理形態(tài)學(xué)變化，參照Szapiel等[4]的方法，將肺纖維化分級(jí)及評(píng)分如下：（-），評(píng)0分，無明顯炎癥改變，極少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，極少成纖維細(xì)胞生成；無膠原纖維生成。（+），評(píng)1分，輕度炎癥改變，較少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，較少成纖維細(xì)胞增生；較少膠原纖維生成，病變范圍小于組織的20%。（++），評(píng)2分，中度炎癥改變，較多成纖維細(xì)胞增生；較多膠原纖維生成，受累面積占組織的20%～50%。（+++），評(píng)3分，重度炎癥，大量成纖維細(xì)胞增生；大量膠原纖維生成，面積 > 50%。

2.4 MASSON染色肺組織膠原定量 每張切片選取6個(gè)不重復(fù)的陽性視野（×200倍），MASSON染色以藍(lán)色膠原沉積為陽性信號(hào)。用IPP 6.0圖像分析軟件分析，進(jìn)行灰度變換，使藍(lán)色陽性面與背景分開，進(jìn)行膠原定量分析，計(jì)算肺組織膠原沉積面積與視野內(nèi)肺組織總面積的比值，并取平均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK（方差齊）或Games-Howell（方差不齊）檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組小鼠一般情況比較 實(shí)驗(yàn)過程中各組均無死亡?？瞻讓?duì)照組小鼠精神狀態(tài)佳，進(jìn)食、進(jìn)水正常，活動(dòng)靈敏度強(qiáng)，攻擊性強(qiáng)，體質(zhì)量未見明顯減輕，背部毛發(fā)光澤發(fā)亮，再生較快，背部皮膚柔軟，易被提起。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠精神較差，進(jìn)食、進(jìn)水減少，活動(dòng)靈敏度降低，攻擊性降低，體質(zhì)量略減輕，背部毛發(fā)極少或完全不生，背部皮膚增厚，堅(jiān)實(shí)發(fā)緊，不易捏起；醋酸潑尼松組和紅花組小鼠精神一般，體質(zhì)量稍減輕，行為靈敏度下降，攻擊性降低，背部毛發(fā)有不同程度再生，再生速度慢，皮膚有緊繃感，未感明顯增厚，不易被提起。醋酸潑尼松組和紅花組小鼠一般情況差異不明顯，但2組小鼠身體狀況明顯好于模型對(duì)照組。

3.2 各組小鼠肺組織HE和MASSON染色病理變化比較 肉眼觀察空白對(duì)照組小鼠肺呈粉紅色，形態(tài)正常，彈性好，HE和MASSON染色后鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積。肉眼觀察模型對(duì)照組小鼠肺為灰白色或蒼白色，體積縮小，硬度增加，彈性較差，鏡下可見肺泡間隔增寬，肺泡破壞、融合明顯，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，MASSON染色可見藍(lán)色的膠原纖維數(shù)量明顯增多。肉眼下醋酸潑尼松組和紅花組小鼠肺顏色暗淡，肺腫脹，體積增大，彈性一般，鏡下可見部分肺泡間隔增寬，部分肺泡破壞、融合，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，藍(lán)色膠原纖維較多；但與模型對(duì)照組比較，2組小鼠肺組織纖維化程度明顯減輕。見圖1、圖2。

3.3 各組小鼠肺纖維化程度評(píng)分比較 空白對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔無明顯增寬，未見炎癥和纖維化表現(xiàn)。模型對(duì)照組肺泡壁厚度明顯增加，肺泡結(jié)構(gòu)破壞甚至消失，肺泡間隔纖維化顯著。醋酸潑尼松組和紅花組雖然也有纖維化表現(xiàn)，但較模型對(duì)照組明顯減輕。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組纖維化評(píng)分明顯增高（P < 0.05）。醋酸潑尼松組和紅花組纖維化評(píng)分明顯高于空白對(duì)照組（P < 0.05），但顯著低于模型對(duì)照組（P < 0.05）。醋酸潑尼松組和紅花組纖維化評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

3.4 各組小鼠肺組織膠原含量比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組及紅花組膠原含量明顯增加（P < 0.05）；與模型對(duì)照組比較，醋酸潑尼松組和紅花組膠原含量顯著降低（P < 0.05）。

醋酸潑尼松組和紅花組膠原含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

4 討 論

硬皮病是一種以皮膚和內(nèi)臟器官進(jìn)行性纖維化的全身性疾病，涉及皮膚、關(guān)節(jié)、肌肉、肺、心臟等多個(gè)部位的損害。硬皮病中肺纖維化的發(fā)生率僅次于皮膚、外周血管及食管，肺纖維化早期多沒有癥狀，直到硬皮病晚期，肺的損害可以成為患者死亡原因。糖皮質(zhì)激素是目前臨床上治療硬皮病最具性價(jià)比的藥物，對(duì)硬皮病所致關(guān)節(jié)炎、肌炎、心包炎、心肌損害、肺間質(zhì)病變的炎癥期有一定療效[5]，但其副作用亦明顯。由于肺纖維化治療難度大，預(yù)后差，因此加強(qiáng)對(duì)硬皮病肺纖維化的研究，緩解和控制其進(jìn)行性發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實(shí)和社會(huì)意義。

肺纖維化的病理特點(diǎn)是肺泡上皮的損傷，膠原纖維的合成增加，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積。細(xì)胞因子[如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素等]、氧化應(yīng)激（OS）、熱休克蛋白47（HSP47）等可引起肺組織炎癥和膠原過度表達(dá)，ECM沉積，最終形成肺纖維化，影響肺功能[6]。

紅花是一種經(jīng)典的活血化瘀中藥，具有抗血栓、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[7-8]。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型中，紅花黃色素（SY）顯著降低肺組織中羥脯氨酸含量，降低TGF-β1和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，最后達(dá)到抗肺纖維化的效果。張亞丹等[10]以TGF-β1誘導(dǎo)NIH/3T3細(xì)胞為模型，發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A（HSYA）可抑制TGF-β1誘導(dǎo)NIH/3T3細(xì)胞與肺纖維化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而緩解肺纖維化。臨床研究表明，紅花亦對(duì)肺纖維化具有一定的防治作用。趙青文等[11]運(yùn)用紅花治療特發(fā)性肺纖維化患者19例，所有患者經(jīng)紅花治療后臨床自覺癥狀、肺功能及動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果均有不同程度改善，9例可以進(jìn)行正常的生活工作，6例可以進(jìn)行一般日常活動(dòng)，4例能進(jìn)行少量室內(nèi)活動(dòng)。宋遠(yuǎn)瑛等[12]將48例特發(fā)性肺纖維化患者分為治療組和對(duì)照組，每組24例，對(duì)照組使用醋酸潑尼松治療，治療組與對(duì)照組的基礎(chǔ)上加用紅花治療，結(jié)果顯示，2組患者經(jīng)治療后呼吸疾病問卷（圣喬治評(píng)分）、動(dòng)脈血?dú)夥治黾胺喂δ芫兴纳?，治療組效果較對(duì)照組更顯著（P < 0.05）。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過光鏡下肺組織病理觀察可看到，模型對(duì)照組肺組織炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增寬，肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，膠原纖維增生明顯，提示小鼠硬皮病模型復(fù)制成功。醋酸潑尼松組與紅花組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，肺泡結(jié)構(gòu)部分破壞，可見纖維化程度較輕，2組纖維化程度差異不明顯。通過膠原含量分析可得出，模型對(duì)照組小鼠膠原含量顯著高于空白對(duì)照組（P < 0.05）；而醋酸潑尼松組、紅花組與空白對(duì)照組比較，膠原含量雖有升高，但較模型對(duì)照組低，說明2組肺部纖維化程度輕。但2組作用效果比較差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），說明紅花水煎液能有效對(duì)抗硬皮病小鼠肺纖維化。以上表明紅花無論在臨床研究或是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)肺纖維化的形成均有一定的拮抗作用，但是其抗硬皮病肺纖維化的機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。

5 參考文獻(xiàn)

[1] Yamamoto T.The bleomycin-induced scleroderma model：what have we learned for scleroderma pathogenesis？[J].Arch Dermatol Res，2006，297（8）：333-344.

[2] Yamamoto T.Animal model of systemic sclerosis[J].J Dermatol，2010，37（1）：26-41.

[3] 毛越蘋，易娟娟，齊慶，等.博來霉素誘導(dǎo)硬皮病動(dòng)物模型的建立及免疫學(xué)特征檢測(cè)[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2013，27（7）：673-676.

[4] Szapiel SV，Elson NA，F(xiàn)ulmer JD，et al.Bleomycin-in

duced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis，1979，120（4）：893-899.

[5] 曾抗，賴寬，陳平姣，等.硬皮病的治療及進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2013，10（1）：21-26.

[6] 潘有祿，黃文海，沈正榮，等.肺纖維化發(fā)生機(jī)制及治療研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2012，47（23）：1873-1874.

[7] 陳夢(mèng)，趙丕文，孫艷玲，等.紅花及其主要成分的藥理作用研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2012，5（7）：556-560.

[8] 梁娟，呂軍影，胡謀波，等.紅花水煎液內(nèi)服對(duì)硬皮病小鼠皮膚RORγt表達(dá)的影響[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5（4）：5-9.

[9] Wang L，Jin M，Zang BX，et al.Inhibitory effect of safflor yellow on pulmonary fibrosis[J].Biol Pharm Bull，2011，34（4）：511-516.

[10] 張亞丹，潘瑞艷，臧寶霞，等.羥基紅花黃色素A抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的與肺纖維化相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制研究[J].心肺血管病雜志，2016，35（2）：145-149.

[11] 趙青文，秦北寧.紅花治療特發(fā)性肺纖維化19例[J].中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2004，7（7）：651.

[12] 宋遠(yuǎn)瑛，李樹崗.紅花黃色素對(duì)于特發(fā)性肺纖維化患者生活質(zhì)量改善的臨床研究[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2013，8（7）：72-73.

收稿日期：2016-04-18；修回日期：2016-05-30