血府逐瘀湯調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)損傷血管內(nèi)皮的研究

張 偉，劉曉丹，李 菲，曹 浪，鄧常清

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院，湖南岳陽 414000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410208）

血府逐瘀湯調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)損傷血管內(nèi)皮的研究

張 偉1，劉曉丹2，李 菲2，曹 浪2，鄧常清2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院，湖南岳陽 414000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410208）

目的 在中醫(yī)活血化瘀理論指導(dǎo)下，將中醫(yī)治療和細(xì)胞療法相結(jié)合，探討血府逐瘀湯調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）修復(fù)大鼠損傷血管內(nèi)皮的作用，并闡釋其機(jī)制。方法 以內(nèi)皮損傷大鼠為受試對象，灌胃血府逐瘀湯并靜脈輸注EPC，探討該方聯(lián)合EPC輸注后，對大鼠內(nèi)皮損傷模型血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)作用，并從細(xì)胞分子環(huán)節(jié)闡釋其機(jī)制。結(jié)果 與單用EPC組和單用藥物組比較，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組內(nèi)膜厚度明顯減少（P＜0.05），降低甘油三酯、總膽固醇和升高高密度脂蛋白水平的作用更為明顯（P＜0.05），血鈣下降更為明顯（P＜0.05），血管eNOS蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05），血管SDF-1表達(dá)明顯增高。結(jié)論 血府逐瘀湯可促進(jìn)EPC修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮，其作用機(jī)制可能與該方能改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)EPC的歸巢有關(guān)。

血府逐瘀湯；內(nèi)皮組細(xì)胞；血管內(nèi)皮；eNOS；SDF-1/CXCR-4；PI3K/磷酸化Akt

內(nèi)皮功能障礙（endothelial dysfunction，ED）與冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病密切相關(guān)，其本質(zhì)是內(nèi)皮損傷和修復(fù)之間動態(tài)平衡被破壞。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）是修復(fù)內(nèi)皮損傷的重要細(xì)胞，可作為種子細(xì)胞用于血管內(nèi)皮受損的修復(fù)治療。但由于局部微環(huán)境的改變和EPC數(shù)量和功能的異常而影響EPC對受損血管內(nèi)皮的修復(fù)效率［1－2］，因而增加EPC的數(shù)量和改善局部微環(huán)境成為促進(jìn)受損血管內(nèi)皮修復(fù)的重要措施。目前能促進(jìn)EPC修復(fù)受損血管內(nèi)皮的措施還很少。現(xiàn)代研究表明，中醫(yī)活血化瘀法對血管內(nèi)皮功能具有保護(hù)作用，能修復(fù)內(nèi)皮損傷。血府逐瘀湯是中醫(yī)行氣活血法的代表方劑，研究表明血府逐瘀湯能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮活性因子，改善血管內(nèi)皮病變程度，保護(hù)血管內(nèi)皮［3］，對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者有很好療效［4］。但有關(guān)該方能否促進(jìn)EPC對血管內(nèi)皮受損的修復(fù)作用還不清楚。因此，為進(jìn)一步了解血府逐瘀湯對EPC修復(fù)受損血管內(nèi)皮的調(diào)控作用，深入探討該方治療心腦血管疾病的機(jī)制，本文研究了該方對體外輸注EPC修復(fù)受損血管內(nèi)皮的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年♂SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：scxk（湘）2011-0003。

1.1.2 主要試劑和儀器 Percoll淋巴細(xì)胞分離液（ρ＝1.083）（TBD，天津），內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（Endo-thelial Basal Medium-2，EBM-2），內(nèi)皮細(xì)胞生長因子套裝（EGM-2-MV-SingleQuots）（LONZA Inc.Switzer-land），纖聯(lián)蛋白（fibronectin，F(xiàn)N），F(xiàn)ITC標(biāo)記的荊豆凝集素-1（FITC-UAE-1），四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽（1，1′-dioctadecy1-3，3，3′，3′-tetramethylindocar-bocyanine perchlorate，Dil）標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-ac-LDL）（Biomedical Technologies，USA）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylin-dole，DAPI）（Vector Laboratories，USA）；β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）染色試劑盒（Beyotime，中國）；小鼠抗大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶抗體（eNOS）（Boster，中國）；兔抗鼠β-actin單克隆抗體（Bioworld，中國）；兔抗鼠多克隆基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived fac-tor-1，SDF-1）抗體（R＆D Systems，Inc.，USA）；兔抗鼠單克隆趨化因子受體-4（CXC chemokine receptor 4，CXCR-4）抗體（abcam，USA）；超敏化學(xué)放光顯色試劑盒、封閉蛋白干粉、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗、蛋白印跡膜再生液，以上試劑均來自博士德公司（Boster，中國）。血脂和血鈣檢測試劑盒均來自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EPC的培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記 參考文獻(xiàn)方法［5］，大鼠頸椎脫臼處死，采用改良密度梯度離心法獲取骨髓單個核細(xì)胞后培養(yǎng)，72 h后半量換液，14 d左右見細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后可進(jìn)行鑒定或傳代。（1）功能學(xué)鑒定：按照文獻(xiàn)方法［6］，取培養(yǎng)細(xì)胞，PBS漂洗5min 3次。加入Dil-ac-LDL（終濃度10 mg· L－1）37℃孵育4 h。PBS漂洗后以4％多聚甲醛固定。PBS漂洗后加入FITC-UAE-1（終濃度80 mg· L－1）37℃孵育1 h。PBS漂洗晾干后熒光顯微鏡觀察。細(xì)胞吸收Dil-ac-LDL后熒光顯微鏡下可見紅色，結(jié)合FITC-UAE-1后可見綠色，采用圖像分析系統(tǒng)將同視野的吸收Dil-ac-LDL和結(jié)合FITC-UAE-1的照片重合后出現(xiàn)橙色即為EPC。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞計數(shù)雙陽性細(xì)胞達(dá)（91.5±4.3）％（n＝5）。（2）細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定：按照文獻(xiàn)方法［7］，收集細(xì)胞，4％多聚甲醛固定，PBS洗滌、離心，5％羊血清4℃封閉，離心后以PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行CD34/CD133細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定。本研究細(xì)胞培養(yǎng)7、14、21 d細(xì)胞CD34/CD133的雙陽性表達(dá)分別為16.9％、22.6％、19.71％，CD34/CD133雙陽性表達(dá)細(xì)胞即為具有干細(xì)胞表型且能分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的EPC。（3）EPC標(biāo)記：參考文獻(xiàn)［8］，取培養(yǎng)14 d的EPC，將熒光染色劑DAPI（終濃度50 g·L－1）加入EPC中，在37℃CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，標(biāo)記后的EPC用無菌PBS沖洗6次，除去未結(jié)合的DAPI，熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記的EPC。

1.2.2 血管內(nèi)皮衰老模型建立 根據(jù)文獻(xiàn)建立大鼠血管內(nèi)皮衰老模型［9］：大鼠以配方為2％膽固醇、0.5％膽酸鈉、3％豬油、0.2％丙基硫氧嘧啶和94.3％基礎(chǔ)飼料的高脂飼料喂養(yǎng)，輔以VitD腹腔注射，7×105U·kg－1，分2次注射，高脂喂養(yǎng)14 d后第1次注射，28 d后第2次注射，持續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)12周。隨機(jī)取5只大鼠，采用形態(tài)學(xué)方法觀察內(nèi)膜形態(tài)，檢測內(nèi)膜厚度，SA-β-Gal法檢測內(nèi)皮衰老情況，可見大鼠主動脈內(nèi)膜增厚，出現(xiàn)動脈粥樣硬化樣改變，內(nèi)皮衰老檢測呈陽性，據(jù)此確認(rèn)造模成功。

1.2.3 血府逐瘀湯的制備 按原方劑量取藥材6倍量，置于5 000 mL燒瓶中加8倍量蒸餾水進(jìn)行回流加熱提取兩次，提取時間分別為60 min。濾過，合并兩次濾液，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮約440 mL。將上述兩份濃縮液加95％乙醇調(diào)至含醇濃度85％，得水醇液，放置沉淀（出現(xiàn)大量黃褐色粘性沉淀），24 h后抽濾，醇液減壓回收乙醇并蒸干水至無醇味。反復(fù)處理、沉淀3次，最后一次調(diào)乙醇濃度達(dá)90％，放置至無沉淀物再生成，抽濾，濾液回收乙醇，并蒸干至無醇味后，置于重量已知的蒸發(fā)皿中90℃水浴蒸至近干，放置于真空干燥箱中，真空干燥至全干，稱重備用。

1.2.4 分組、給藥及處理 模型成功后將大鼠隨機(jī)分為模型組（M組）、單純EPC輸注組（E組）、單用血府逐瘀湯組（X組）、血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組（Y組），并設(shè)立空白對照組（C組），共5組。X組、Y組灌胃血府逐瘀湯（生藥7.5 g·kg－1）具體給藥劑量參考文獻(xiàn)［10］及動物給藥的體表面積折算法確定；E組、M組及C組灌胃蒸餾水，灌胃藥物及水均每天1次，連用30 d，每周稱體重調(diào)整灌胃藥量。在灌胃給藥的d 8，給予E組、Y組尾靜脈一次性輸注以1 mL PBS混懸，數(shù)量約為2×106的DAPI標(biāo)記的EPC、X組、M組、C組輸注1 mL PBS予以對照。藥物干預(yù)30 d后處死動物取材進(jìn)行檢測。

1.2.5 血管內(nèi)膜增生的測定 取胸主動脈，按以往研究方法［11］檢測血管內(nèi)膜厚度以反映內(nèi)皮損傷和修復(fù)。masson染色法觀察血管內(nèi)膜形態(tài)，采用圖像分析法計量內(nèi)膜增生情況，按組織學(xué)劃分，內(nèi)彈力膜以內(nèi)為內(nèi)膜。內(nèi)膜厚度＝［（內(nèi)彈力膜周徑－管腔周徑）/2π］，以MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測量內(nèi)膜厚度。取血管壁內(nèi)膜最厚處測量，以3個不同橫截面的平均值表示該血管內(nèi)膜的厚度。

1.2.6 內(nèi)皮衰老測定 根據(jù)試劑盒方法測定血管SA-β-gal活性以評價內(nèi)皮衰老狀況：大鼠胸主動脈標(biāo)本石蠟切片，常規(guī)方法脫蠟和水化處理后加入適量的β-半乳糖苷酶染色固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定不少于15 min。用PBS浸泡洗滌組織3次，每次不少于5 min。吸除PBS，加入適量染色工作液。將切片充分浸泡在染色工作液中37℃孵育過夜，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性表達(dá)可見血管內(nèi)膜呈顆粒狀藍(lán)色。

1.2.7 EPC歸巢的測定 參考文獻(xiàn)［12］取培養(yǎng)14 d 的EPC用熒光染色劑DAPI標(biāo)記后尾靜脈輸注大鼠體內(nèi)。4周后取胸主動脈冰凍切片標(biāo)本熒光顯微鏡下觀察EPC在受損血管內(nèi)皮的歸巢情況。

1.2.8 血脂血鈣測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后眼眶靜脈叢取血，分離血清按試劑盒說明書測定血脂、血鈣。

1.2.9 Western blot檢測血管內(nèi)皮eNOS、SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá) 各組大鼠于給藥30 d后即末次給藥后次日，麻醉后處死，取出胸腹主動脈，按試劑盒說明提取蛋白，Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。將樣品蛋白煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5％蛋白封閉液封閉。加入3mL用TBST稀釋的一抗（eNOS1∶500、SDF-1 1∶200、CXCR4 1∶1 000、β-actin 1∶2 000），4℃緩慢搖動過夜后加入羊抗鼠、羊抗兔第二抗體3 mL（1∶4 000），37℃孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，用凝膠成像系統(tǒng)將曝光后膠片進(jìn)行掃描，用圖像分析軟件IPP6.0對圖像進(jìn)行光密度分析。以目的蛋白與β-actin光密度值的比值作為該目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計分析方法 運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)軟件spss17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD法，方差不齊者先將數(shù)據(jù)進(jìn)行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后再作單因素方差分析和兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 各組血管內(nèi)皮形態(tài)及內(nèi)膜厚度比較 血管形態(tài)觀察顯示，模型組可見血管內(nèi)膜增厚，部分增厚部位出現(xiàn)泡沫細(xì)胞等動脈粥樣硬化樣改變，中膜萎縮，血管環(huán)狀肌層結(jié)構(gòu)破壞，表明造模方法可造成血管內(nèi)膜損傷。與模型組比較，各藥物組血管內(nèi)膜增生、中膜變薄明顯改善。其中EPC輸注組及血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組改善明顯（Fig 1）。

Tab 1 Comparison of intima thickness in each group（±s）

Tab 1 Comparison of intima thickness in each group（±s）

C：Control group，M：Model group，E：EPC alone infusion group，X：XFZYD alone group，Y：XFZYD joint EPC group.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs model group；●P＜0.05 vs EPC group；＃＃P＜0.01 vs group X

Group n Intima Thickness/μm C 8.2±1.4 M 7 6 106.5±18.9**E 8 12.8±1.7△△X 35.2±8.9△△●Y 8 8.9±1.1△△●＃＃8

與空白組比較，模型組內(nèi)膜增厚（P＜0.01），提示造模后血管內(nèi)皮損傷，內(nèi)膜增生。與模型組比較，EPC組、血府逐瘀湯組以及血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組內(nèi)膜厚度均明顯減?。≒＜0.01）；與單用EPC組比較，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組內(nèi)膜厚度減?。≒＜0.05）；與單用藥物組比較，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組內(nèi)膜厚度明顯下降（P＜0.01）。結(jié)果提示血府逐瘀湯聯(lián)用EPC后修復(fù)損傷血管內(nèi)皮的效果優(yōu)于單用EPC組和單用藥物組。

為進(jìn)一步了解該方在抑制內(nèi)膜增生方面是否與EPC有交互作用，本研究進(jìn)行了交互作用分析，方法如下：以模型組的均數(shù)為基礎(chǔ)值，模型組均數(shù)與EPC組均數(shù)的差值為單用EPC的效應(yīng)，模型組均數(shù)與單用中藥組均數(shù)的差值為單用中藥的效應(yīng)，二者相加為其聯(lián)合應(yīng)用的理論效應(yīng)值。模型組均數(shù)與聯(lián)合組的均數(shù)差值為聯(lián)合應(yīng)用的實(shí)際效應(yīng)值。如果實(shí)際效應(yīng)值＜理論效應(yīng)值為拮抗作用，實(shí)際效應(yīng)值≈理論效應(yīng)值（誤差≤10％）為相加，實(shí)際效應(yīng)值理論效應(yīng)值為協(xié)同作用。交互作用分析結(jié)果顯示：血府逐瘀湯與EPC聯(lián)用后在拮抗內(nèi)膜增生方面具有相加作用。

2.2 各組血管內(nèi)皮衰老的比較 結(jié)果顯示，M組血管內(nèi)膜增生，增生內(nèi)膜中可見泡沫細(xì)胞，部分血管可見動脈粥樣硬化病變，細(xì)胞內(nèi)膜和內(nèi)膜細(xì)胞可見衰老陽性表達(dá)顆粒呈藍(lán)色。而空白組表達(dá)呈陰性，且無增生。藥物干預(yù)4周后，與模型組比較，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞衰老情況改善明顯，可見血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組、EPC組血管各層細(xì)胞排列較整齊，內(nèi)膜層稍有折疊，血管各層細(xì)胞均未見陽性表達(dá)；血府逐瘀湯組與模型組相比內(nèi)膜損傷亦明顯改善，未見明顯粥樣硬化樣病變，但血管纖維排列較紊亂，內(nèi)膜、中膜層陽性顆粒偶見（Fig 2）。

Fig 1 Vascular morphology of each group（masson stanining，×100）

Fig 2 Endothelial cell senescence markers in each group（SA-β-gal stanining，×400）

Tab 2 Comparison of serum lipids and serum calcium in each group（mmol·L－1，±s）

Tab 2 Comparison of serum lipids and serum calcium in each group（mmol·L－1，±s）

Note see Tab 1.*P＜0.01，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；●P＜0.05 vs EPC group；＃P＜0.05 vs Group X.

Group n Total cholesterol Triglyceride High density lipoprotein Low density lipoprotein Serum ca lcium C 6 1.92±0.46 1.2±0.31 0.65±0.06 0.51±0.05 2.45±0.51 M 7 2.29±0.38* 1.55±0.54* 0.59±0.12* 0.53±0.19 4.02±0.83**E 8 2.17±0.22 1.2±0.13 0.57±0.04 0.46±0.02 3.40±0.76△X 8 1.64±0.23△● 0.83±0.12△△● 0.68±0.11△ 0.49±0.08 2.98±0.65△Y 8 1.78±0.26△● 0.63±0.19△△●＃ 0.84±0.13△●＃ 0.5±0.11 2.74±0.57△△●

2.3 EPC的歸巢 熒光顯微鏡下血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組、單用EPC輸注組血管管壁可見藍(lán)色熒光，尤其是在內(nèi)膜部位及損傷嚴(yán)重部位的熒光表達(dá)更強(qiáng)；結(jié)合血管形態(tài)學(xué)及管壁計量檢測結(jié)果可見輸注EPC的各組損傷修復(fù)較好，由此可知，輸注的EPC歸巢到損傷血管分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與了損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)（Fig 3）。

Fig 3 EPC homing to vascular intima（Fluorescence method，×100）

2.4 血脂、血鈣的比較 由Tab 2可知，與空白組比較，模型組血脂明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），提示高脂喂養(yǎng)加注射維生素D導(dǎo)致血脂升高。與模型組比較，藥物組及藥物聯(lián)合EPC組均有下調(diào)總膽固醇及甘油三酯的作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而單獨(dú)輸注EPC組在下調(diào)上述兩個指標(biāo)上差異無顯著性，提示活血方可能是降低血脂的主要有效物質(zhì)。藥物組及藥物聯(lián)合EPC組均能上調(diào)高密度脂蛋白（HDL-ch）的水平，而單獨(dú)EPC 組HDL-ch無明顯變化。由此可見，血府逐瘀湯還具有上調(diào)高密度脂蛋白的作用。

與E組比較，藥物聯(lián)合EPC組在降低總膽固醇及甘油三酯的水平方面差異有顯著性（P＜0.05）。與單用藥物組比較，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組降低甘油三酯的水平，升高高密度脂蛋白水平的作用更為明顯（P＜0.05），從而提示中藥復(fù)方聯(lián)合EPC后調(diào)節(jié)血脂作用增強(qiáng)。血鈣結(jié)果分析表明，與空白組比較，模型組的血鈣濃度明顯增加（P＜0.01）；藥物組與模型組比較血鈣濃度明顯降低（P＜0.05）；單純EPC組與藥物EPC聯(lián)合組相比，后者血鈣下降更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示血府逐瘀湯能下調(diào)血管內(nèi)皮損傷模型的血鈣水平。

交互作用分析結(jié)果顯示：在調(diào)節(jié)高密度脂蛋白和甘油三酯方面，血府逐瘀湯與輸注EPC具有協(xié)同作用；在調(diào)節(jié)血鈣方面未見交互作用。

由上可知，在調(diào)節(jié)血脂血鈣方面，其作用可能來自于活血方，而血府逐瘀湯聯(lián)合EPC后，在修復(fù)血管內(nèi)皮損傷方面具有交互作用，可能與該方能調(diào)節(jié)血脂，改善內(nèi)環(huán)境，從而為EPC歸巢分化提供有利條件有關(guān)。

2.5 各組血管eNOS表達(dá)的比較 與空白對照組比較，模型組eNOS蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，各治療組eNOS表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。與E組比較，活血方聯(lián)用EPC組的eNOS蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。與單用藥物組比較，活血方聯(lián)用EPC組eNOS蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)果表明，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC后可提高eNOS蛋白表達(dá)水平，各藥物組治療后eNOS蛋白表達(dá)水平明顯提高，從而提示損傷血管內(nèi)皮得到修復(fù)，內(nèi)皮功能得到恢復(fù)（Fig 4，Tab 3）。

Fig 4 eNOS expression profile of each group

Tab 3 The expression comparison of eNOS in each group（±s）

Tab 3 The expression comparison of eNOS in each group（±s）

Note see Tab 1.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group，●P＜0.05 vs EPC group；＃＃P＜0.01 vs Group X.

Group n eNOS/β-actin（IOD）C 0.47±0.09 M 7 0.53±0.06●6 E 0.73±0.12△△X 8 0.71±0.06△●8 Y 81.13±0.10△△●＃＃

交互作用分析結(jié)果如下：血府逐瘀湯在上調(diào)eNOS表達(dá)方面與EPC具有相加作用。

2.6 各組SDF-1、CXCR-4表達(dá)的比較 與空白對照組比較，SDF-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，血府逐瘀湯組和血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組SDF-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01或P＜0.05），而單用EPC組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與單用EPC組比較，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組SDF-1表達(dá)明顯增高。與單用藥物組比較，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組與血府逐瘀湯之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，F(xiàn)ig 5）。

Fig 5 SDF-1 and CXCR-4 protein expression profiles in each group

Tab 4 Expression of SDF-1 and CXCR-4 in each groups

在CXCR-4蛋白表達(dá)方面，與空白組比較，模型組CXCR-4表達(dá)明顯降低（P＜0.05），其它各組CX-CR-4表達(dá)也明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，各治療組CXCR-4變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

為進(jìn)一步了解兩類活血方在調(diào)節(jié)SDF-1、CX-CR-4的表達(dá)方面是否與EPC有交互作用，本研究進(jìn)行了交互作用分析，結(jié)果如下：在上調(diào)血管SDF-1的表達(dá)方面，血府逐瘀湯與輸注EPC具有相加作用；在調(diào)節(jié)血管CXCR-4的表達(dá)方面，中藥復(fù)方與輸注EPC無交互作用。

2.7 各組PI3K、磷酸化Akt表達(dá)的比較 Tab 5結(jié)果表明：與空白對照組比較，模型組PI3K蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC組PI3K蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05），而單用EPC組和單用血府逐瘀湯組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與單獨(dú)藥物組比較，藥物聯(lián)合EPC組PI3K蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.01 或P＜0.05）。與單純EPC組比較，活血方聯(lián)用EPC組PI3K蛋白表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.05）。與空白對照組比較，模型組p-Akt表達(dá)差異無顯著性（P＞0.05），與模型組比較，各治療組p-Akt表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）。與單純EPC組比較，活血方聯(lián)合EPC組p-Akt表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；與單用兩類活血方組比較，兩類活血方聯(lián)合EPC組p-Akt表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。交互作用分析結(jié)果如下：血府逐瘀湯聯(lián)合輸注EPC在上調(diào)PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)方面均有協(xié)同作用（Fig 6）。

Fig 6 PI3K and p-AKT protein expression profiles in each group Note see Fig 1.

Tab 5 Expression of PI3K and p-AKT in each groups（±s）

Tab 5 Expression of PI3K and p-AKT in each groups（±s）

Note see Tab 1.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；●P＜0.05 vs EPC group；＃＃P＜0.01 vs Group X.

Group n PI3K/β-actin（IOD） p-Akt/β-actin（IOD）C 6 0.81±0.09 1.12±0.09 M 7 0.80±0.07 1.01±0.11 E 8 0.86±0.09 1.50±0.12△X 8 0.74±0.07 1.23±0.11△Y 8 1.12±0.06△●＃＃ 1.75±0.09△△●＃＃

3 討論

中醫(yī)藥防治血管內(nèi)皮損傷，“本在氣血，標(biāo)為瘀”。故本研究選用活血化瘀的代表方：行氣化瘀之血府逐瘀湯，研究其防治內(nèi)皮損傷性疾病的作用。血府逐瘀湯亦載于清代王清任《醫(yī)林改錯》，重在行氣活血化瘀。方中當(dāng)歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花活血化瘀；牛膝祛瘀、通血脈，并引瘀血下行；柴胡疏肝解郁、升達(dá)清陽；桔梗、枳殼開胸引氣，氣行則血行；生地黃涼血清熱，配當(dāng)歸養(yǎng)血潤燥，使瘀祛而不傷陰；甘草緩急，通百脈以調(diào)和諸藥。紅花、桃仁、赤芍、川芎4味藥為活血化瘀法的核心，而以桔梗主升、枳殼暢中、牛膝主下，貫通上、中、下氣血，再用當(dāng)歸、生地黃養(yǎng)血補(bǔ)血活血，加甘草和中防止傷胃氣。本方不僅行血分之瘀滯，又解氣分之郁結(jié)，活血而不耗血，祛瘀而又能生新，合而用之，使氣行瘀祛，諸證可愈。該方在調(diào)節(jié)血脂方面具有良好的作用，能聯(lián)合西藥可有效提高高脂血癥的臨床療效，能改善血脂和血流流變學(xué)指標(biāo)，增加頸動脈血流量［13］。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從血管形態(tài)學(xué)評價和血管內(nèi)膜厚度比較可知，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC使受損內(nèi)膜增生明顯下降、損傷減輕，并促進(jìn)EPC在受損血管的歸巢。提示中藥復(fù)方聯(lián)合EPC后可促進(jìn)EPC對血管內(nèi)皮的修復(fù)，中藥聯(lián)合EPC具有一定的相加作用。血管內(nèi)皮eNOS蛋白表達(dá)分析也表明，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC可進(jìn)一步上調(diào)血管內(nèi)皮eNOS表達(dá)，交互作用分析表明，中藥復(fù)方聯(lián)合EPC均具有相加作用。在調(diào)節(jié)血脂、血鈣方面該方聯(lián)合EPC的作用優(yōu)于單純EPC組，但與單用兩類活血方組差異無顯著性。綜上所述，從血管形態(tài)學(xué)、血脂血鈣、血管內(nèi)皮功能檢測結(jié)果并結(jié)合交互作用分析可知，血府逐瘀湯聯(lián)合EPC可以增加修復(fù)損傷血管內(nèi)皮的作用，其機(jī)制可能與該方通過改善局部微環(huán)境，促進(jìn)了EPC的歸巢與分化從而促進(jìn)了EPC對損傷內(nèi)皮的修復(fù)有關(guān)。

在分析其機(jī)制方面，已有研究表明，SDF-1/CX-CR-4軸在內(nèi)皮祖細(xì)胞的歸巢、動員和分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［14］。血府逐瘀湯聯(lián)合EPC輸注組的SDF-1表達(dá)高于單獨(dú)輸注EPC組，亦高于單獨(dú)藥物組。提示藥物聯(lián)合EPC可能通過上調(diào)SDF-1的表達(dá)而促進(jìn)EPC遷移、歸巢，促進(jìn)了損傷內(nèi)皮的修復(fù)。在內(nèi)皮損傷后血管內(nèi)膜的CXCR-4表達(dá)上調(diào)，這可能是血管本身適應(yīng)性改變，目的是為EPC修復(fù)內(nèi)皮創(chuàng)造條件。各藥物及EPC輸注并不能影響CXCR-4的表達(dá)，推測一是可能與CXCR-4僅在內(nèi)皮祖細(xì)胞表面的表達(dá)而本研究的標(biāo)本來自于內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢分化后修復(fù)的損傷血管，二是可能與檢測的時間點(diǎn)有關(guān)，如選擇輸注后細(xì)胞分裂期可能會檢測到對CXCR-4表達(dá)的影響，這也是本研究進(jìn)一步深入研究的內(nèi)容和方向。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidyli-nositol 3′-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路是調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生長、代謝、分化的重要信號通路［15－16］。血府逐瘀湯聯(lián)合EPC后，PI3K表達(dá)增強(qiáng)，磷酸化Akt水平增加，提示該方聯(lián)合EPC后可進(jìn)一步激活PI3K/Akt，促進(jìn)EPC的增殖、分化，增強(qiáng)了EPC對受損內(nèi)皮的修復(fù)作用。PI3K/Akt信號通路可能是該方聯(lián)合EPC促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)的主要機(jī)制。

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Influence of Xuefuzhuyu decoction on EPC repairing injured vascular endothelium

ZHANG Wei1，LIU Xiao-dan2，LI Fei2，CAO Lang2，DENG Chang-qing2
（1.Affiliated Yueyang Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Yueyang Hunan 414000，China；2.Medical College of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Aim To investigate the role of Xuefuzhuyu decoction（XFZYD）combined with EPC in repairing damaged vascular endothelium using traditional Chi-nese medicine way of blood circulation combined with cell therapy.Methods The repaired situation of inju-ried endothelium was observed and the effect of XFZYD on EPC was analysed after the endothelial in-juried rats were gavaged XFZYD and vena caudalis in-jected EPC.Results Compared with EPC group and XFZYD group，the XFZYD joint EPC group’s endo-thelial thickness was reduced significantly（P＜0.05）.And there appeared more significant role in lowering triglycerides，total cholesterol and increasing HDL lev-els（P＜0.05），the calcium was decreased more sig-nificantly（P＜0.05）；vascular eNOS protein expres-sion increased significantly（P＜0.05）；vascular SDF-1 expression was significantly increased.Conclusion XFZYD can promote EPC repairing damaged endotheli-um，and the mechanism may be relevant to improving the environment and promoting the EPC homing.

Xuefuzhuyu decoction；EPC；blood vessel endothelium；eNOS；SDF-1/CXCR-4；PI3K/p-Akt

時間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.050.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.025

A

1001－1978（2016）03－0427－07

R-332；R289.5；R322.12；R329.24

2015－11－05，

2015－12－20

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（No 81000494）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金（No 10B076）

張 偉（1979－），男，博士，副教授，研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管疾病，E-mail：zeen6463＠sina.com；鄧常清（1963－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥防治心腦血管疾病，通訊作者，E-mail：dchangq＠sohu.com

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇