TRPV1通道異源表達(dá)體系的建立和功能的初步研究

李文蘭，王德鳳，周海玉，詹紅丹，戴逸飛，周煒煒，戴 麗，隋 峰，霍海如

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江哈爾濱 150076；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100070）

TRPV1通道異源表達(dá)體系的建立和功能的初步研究

李文蘭1，王德鳳1，周海玉2，詹紅丹2，戴逸飛2，周煒煒2，戴 麗2，隋 峰2，霍海如2

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江哈爾濱 150076；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100070）

目的 構(gòu)建能夠表達(dá)TRPV1通道用于實(shí)驗(yàn)研究的HEK 293T細(xì)胞表達(dá)體系。方法 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式將TRPV1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人胚胎腎HEK 293T細(xì)胞，建立TRPV1型通道瞬時(shí)異源表達(dá)體系，并對(duì)轉(zhuǎn)染后的TRPV1表達(dá)體系進(jìn)行了鑒定，同時(shí)對(duì)該通道功能特性進(jìn)行了研究。結(jié)果 經(jīng)熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染率可達(dá)40％～50％；Western Blot研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的HEK 293T細(xì)胞在與TRPV1通道蛋白相應(yīng)的位置上具有明顯的條帶，提示TRPV1通道蛋白在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中有異源性表達(dá)；共聚焦顯微成像顯示，轉(zhuǎn)染后的HEK 293T細(xì)胞在受到TRPV1通道激動(dòng)劑刺激后，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯變強(qiáng)，提示TRPV1通道介導(dǎo)鈣離子功能正常。結(jié)論

研究結(jié)果表明，基于HEK 293T細(xì)胞的TRPV1通道瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的異源表達(dá)體系成功構(gòu)建。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；TRPV1通道；HEK 293T細(xì)胞；異源性表達(dá)；背根神經(jīng)節(jié)；基因轉(zhuǎn)染

TRPV1通道又被稱(chēng)為辣椒素受體，是瞬變感受器電位離子通道蛋白（transient receptor potential ion channel pro-tein，TRP）家族中的第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)和克隆的成員，由432個(gè)氨基酸組成，也是目前研究得最多的TRP家族成員之一［1－2］。TRPV1通道組織分布廣泛，表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的小型神經(jīng)元等外周感覺(jué)神經(jīng)元以及上皮、表皮以及角質(zhì)細(xì)胞等組織中。其功能復(fù)雜、配體多樣，可被辣椒素、樹(shù)膠脂毒素（RTX）、炎性介質(zhì)（如花生四烯酸代謝物）、組織損傷刺激物等激活［3］。另外，熱（＞43℃）、酸（pH＜5.3）、細(xì)胞外滲透壓的改變、細(xì)胞內(nèi)、胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)等均可敏化或激活該通道［4］。現(xiàn)已明確，TRPV1通道與炎癥、疼痛等多種病癥相關(guān)，近年已成為醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)［5］。但限于該通道的表達(dá)主要在外周感覺(jué)神經(jīng)元，原代取材繁瑣，操作精細(xì)，很難獲得一定量的高純度和活度的表達(dá)TRPV1受體的原位細(xì)胞。因此本研究以人胚胎腎細(xì)胞HEK 293T細(xì)胞為載體，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式構(gòu)建TRPV1通道的異源性表達(dá)載體，為進(jìn)一步探討TRPV1通道的功能及其分子機(jī)制，以及進(jìn)一步篩選出高選擇性激動(dòng)劑或抑制劑打下技術(shù)和方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與試劑 HEK 293T細(xì)胞，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。TRPV1質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipo-fectamin 2000，廣州復(fù)能基因公司；DMEM培養(yǎng)基和新生牛血清，美國(guó)Gibco公司；質(zhì)粒大提試劑盒，美國(guó)Omega公司；TRPV1多克隆抗體和羊抗兔IgG，武漢博士德公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器 TE 2000-U熒光顯微鏡，日本NIKON公司；HT-300電泳儀，北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；共聚焦顯微成像系統(tǒng)為日本奧林巴斯，OLYMPUS公司產(chǎn)品；HE-RA Cell 150i二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific公司；醫(yī)用凈化工作臺(tái)，北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠；BDS 260電熱三用水箱，北京醫(yī)療設(shè)備廠。

2 方法

2.1 質(zhì)粒的抽提與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)大腸桿菌中，接種到含100 mg·L－1氨芐青霉素（Amp）的LB平板上，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落于含100 mg·L－1Amp的LB液體培養(yǎng)基，180 r·min－1，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。使用試劑盒進(jìn)行DNA的抽提。轉(zhuǎn)染前24 h細(xì)胞接種于35 mm2平皿，細(xì)胞融合至約50％時(shí)使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每皿加質(zhì)粒2 μg與脂質(zhì)體4 μL。6 h后將含脂質(zhì)體的培養(yǎng)基換成含100 mL·L－1新生牛血清、無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基，24 h后倒置熒光顯微鏡觀察［6］。

2.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后24 h，用三去污裂解液提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定濃度并分裝，分別取總蛋白20 μg和40 μg與5×SDS上樣緩沖液混合，進(jìn)行80 g· L－1的SDS-PAGE電泳，隨后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含50 g· L－1脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1.5 h。用TRPV1多克隆一抗（1∶200）4℃孵育過(guò)夜。用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶1 500）室溫孵育1 h，隨后進(jìn)行顯影［7］。

2.4 共聚焦顯微成像 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，將細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5 g·L－1胰酶消化，接種于事先用多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的共聚焦專(zhuān)用皿上，將培養(yǎng)皿放在激光共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上，選定熒光顯色好的細(xì)胞視野，再用氬離子激光預(yù)掃描，再根據(jù)預(yù)掃描的結(jié)果選取最清晰的焦平面進(jìn)行掃描，然后隨機(jī)圈定細(xì)胞，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，同步記錄背景熒光值。記錄每個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化并隨機(jī)軟件自動(dòng)分析，細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i濃度變化以熒光強(qiáng)度值（intensity）表示，此數(shù)值與細(xì)胞［Ca2＋］i變化呈正相關(guān)。所有試劑在有效劑量范圍內(nèi)都經(jīng)證明不產(chǎn)生熒光干擾，染色條件和激光掃描參數(shù)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中不變［8－9］。

3 結(jié)果

3.1 熒光顯微鏡觀察 轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染的HEK 293T細(xì)胞中有熒光蛋白的表達(dá)，可以認(rèn)為該目的基因已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Fluorescence site indicates transfected HEK 293T cells（200×）

3.2 TRPV1通道異源表達(dá)體系的蛋白印跡鑒定 以DRG神經(jīng)組織為陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)染TRPV1通道的HEK 293T細(xì)胞為陰性對(duì)照（HEK 293T－），上樣量40 μg，進(jìn)行了蛋白印跡檢測(cè)分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的HEK 293T細(xì)胞（HEK 293T＋）在100 ku左右處有一清晰條帶，而空白對(duì)照組不具備此條帶，如Fig 2所示，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

Fig 2 SDS PAGE for TRPV1 channel protein

3.3 HEK 293T細(xì)胞異源性表達(dá)的TRPV1通道的功能TRPV1通道激動(dòng)劑辣椒素（2 μmol·L－1）給藥后，共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)，TRPV1通道轉(zhuǎn)染成功的HEK 293T細(xì)胞胞內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸變強(qiáng)，約20 s后到達(dá)到熒光強(qiáng)度的最高點(diǎn)，然后開(kāi)始下降，至給藥后的150 s左右熒光強(qiáng)度回到給藥前的狀態(tài)（Fig 3）。沒(méi)有轉(zhuǎn)染TRPV1基因的HEK 293T細(xì)胞在受到辣椒素刺激后，胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度未見(jiàn)明顯變化（Fig 4）。以上的研究結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染后的TRPV1通道介導(dǎo)鈣離子的功能正常，能夠通過(guò)胞內(nèi)鈣信號(hào)的變化執(zhí)行特定的生物學(xué)效應(yīng)。

Fig 3 Changing curves of intracellular fluorescence of HEK 293T＋cells post-stimulation by TRPV1 agonist

Fig 4 Changing curves of intracellular fluorescence of HEK 293T－cells post-stimulated by TRPV1 agonist

4 討論

TRPV1是目前研究最多、機(jī)制較為清楚的TRPV亞家族成員之一，主要存在于背根神經(jīng)節(jié)（DRG）和三叉神經(jīng)節(jié)的較小直徑細(xì)胞中［10］。近年研究表明，TRPV1通道在痛覺(jué)的產(chǎn)生及痛覺(jué)敏感性增強(qiáng)的病理發(fā)生過(guò)程中扮演著重要角色［11］。基于此，TRPV1通道業(yè)已成為止痛新藥研究的新的關(guān)注藥靶。有關(guān)TRPV1通道的研究，傳統(tǒng)的方式是通過(guò)分離大鼠的背根神經(jīng)節(jié)，純化后獲得一定純度表達(dá)有一定豐度TRPV1通道的DRG神經(jīng)元，我們由于實(shí)驗(yàn)需要，前期建立了表達(dá)TRPV1通道原代培養(yǎng)體系，但該方法操作繁雜、工作量大，且較難獲得高純度和高活度的神經(jīng)元，不適于藥物的廣泛篩選研究［12］。因此，本研究通過(guò)基因轉(zhuǎn)染的方式，建立了TRPV1通道的異源表達(dá)體系。研究結(jié)果顯示，在HEK 293T細(xì)胞上轉(zhuǎn)染TRPV1通道轉(zhuǎn)染率高、蛋白表達(dá)豐度高，且功能活性良好。利用該TRPV1的異源表達(dá)體系，系統(tǒng)地開(kāi)展TRPV1通道激動(dòng)劑或阻斷劑的篩選研究，或利用該體系，對(duì)其調(diào)控和功能做進(jìn)一步研究，將有助于更深入地了解TR-PV1通道的功能特性，為尋找特異性的TRPV1通道功能調(diào)節(jié)相關(guān)藥物奠定了基礎(chǔ)。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥理論與本草文獻(xiàn)研究中心實(shí)驗(yàn)室由李文蘭、王德鳳、周海玉、詹紅丹、戴逸飛、周煒煒、戴麗、隋峰和霍海如等共同參與完成。）

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Construction and preliminary functional study of heterologous expression system of TRPV1 channel

LI Wen-lan1，WANG De-feng1，ZHOU Hai-yu2，ZHAN Hong-dan2，DAI Yi-fei2，ZHOU Wei-wei2，DAI Li2，SUI Feng2，HUO Hai-ru2
（1.Research Center on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Aim The TRPV1 plasmid was transiently transfected into human embryonic kidney HEK 293T cells to establish the heterologous expression system of TRPV1-channel.Methods The transfection efficiency was confirmed under fluorescence mi-croscope and the TRPV1 protein expression was identified by u-sing Western blot，and the functional characteristics of the chan-nel were studied by using the method of confocal microscopy.Results The transfection rate could reach 40％～50％；the transfected cells were found to have a clear band at the corre-sponding position that TRPV1 should be，which indicated that TRPV1 channel protein was expressed in the transfected cells.The confocal microscopy imaging result showed that the trans-fected HEK 293T cells were activated by TRPV1 channel ago-nist.Conclusion Transient transfection of HEK 293T cells with TRPV1 channel is successfully constructed and the heterol-ogous TRPV1 channel is verified to have normal calcium-media-ting function.

transient transfection；TRPV1 channel；HEK 293T cells；heterologous expression；dorsal root ganglion；gene trans-fection

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.054.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.027

A

1001－1978（2016）03－0439－03

R322.61；R341；R392.11；R394.2；R977.6

2015－10－08，

2015－12－07

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No 81274112，81373986，81473372）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（No 81403125，81403322）；北京市自然科學(xué)基金（No 7152106）

李文蘭（1967－），女，博士，教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，E-mail：lwldzd＠163.com；隋 峰（1967－），男，博士，研究員，研究方向：中藥藥性和藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：suifeng2136＠126.com；霍海如（1960－），女，博士，研究員，研究方向：中藥藥理和藥性，E-mail：hairuh＠icmm.ac.com

◇研究簡(jiǎn)報(bào)◇