桂芍通絡(luò)對兔動脈粥樣硬化早期外膜滋養(yǎng)血管新生及氧化應(yīng)激水平的干預(yù)作用

尹玉潔，馬柳一，位 庚，李紅蓉，賈振華

［1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊 050017；2.河北以嶺醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室（心腦血管絡(luò)?。?，河北石家莊 050035；3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院，河北石家莊 050091］

桂芍通絡(luò)對兔動脈粥樣硬化早期外膜滋養(yǎng)血管新生及氧化應(yīng)激水平的干預(yù)作用

尹玉潔1，2，3，馬柳一1，2，3，位 庚1，2，3，李紅蓉1，2，3，賈振華1，2，3

［1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊 050017；2.河北以嶺醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室（心腦血管絡(luò)病），河北石家莊 050035；3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院，河北石家莊 050091］

目的 觀察桂芍通絡(luò)對兔動脈粥樣硬化早期外膜滋養(yǎng)血管新生及氧化應(yīng)激的影響。方法 84只家兔隨機(jī)分為正常組、高脂組、外膜損傷組、桂芍通絡(luò)高劑量（GH）組、桂芍通絡(luò)中劑量（GM）組、阿托伐他?。ˋTO）組、通心絡(luò)（TXL）組，每組各12只。正常組給予普通飼料，高脂組給予高脂飼料喂養(yǎng)建立早期高脂血癥模型，外膜損傷組及各用藥組實(shí)施高脂飲食復(fù)合右側(cè)頸動脈硅膠管包裹術(shù)。GH組給予4.16 g（生藥）·kg－1·d－1灌胃，GM組給予2.08 g（生藥）·kg－1·d－1灌胃，ATO組給予阿托伐他汀2.5 mg·kg－1·d－1灌胃，TXL組給予通心絡(luò)超微粉0.6 g·kg－1·d－1灌胃，連續(xù)給藥4周后取材，生化法檢測各組血脂4項(xiàng)水平變化；HE染色觀察內(nèi)中外膜病理形態(tài)學(xué)變化；檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）表達(dá)水平；熒光原位雜交檢測NADPH氧化酶亞單位p22phox和gp91phoxmRNA的定位與表達(dá)；Western blot檢測頸動脈組織VEGF、VEGFR蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與正常組相比，高脂組血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白（LDL-C）水平明顯升高（P＜0.01）；外膜損傷組外膜新生滋養(yǎng)血管及VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.01），與外膜損傷組比較，GH組、GM組、ATO組及TXL組術(shù)側(cè)頸動脈損傷及滋養(yǎng)血管新生程度、頸動脈外膜NADPH氧化酶亞單位p22phox和gp91phoxmRNA均有不同程度減輕；SOD、T-AOC活力升高，MDA含量、頸動脈外膜VEGF、VEGFR蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 桂芍通絡(luò)具有抑制兔動脈粥樣硬化早期血管外膜滋養(yǎng)血管新生的作用，其機(jī)制可能與提高血管本身及外膜的抗氧化能力有關(guān)。

動脈粥樣硬化；血管外膜損傷；外膜滋養(yǎng)血管新生；血管內(nèi)皮生長因子；氧化應(yīng)激；熒光原位雜交

近年關(guān)于動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的研究，已經(jīng)由聚焦于血管內(nèi)膜的“由內(nèi)向外”（inside-out）炎癥反應(yīng)機(jī)制逐步轉(zhuǎn)變?yōu)椤坝赏庀騼?nèi)”（outside-in），血管外膜在AS發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到重視，大中動脈管壁外膜及中膜外1/3上存在微血管，滋養(yǎng)中膜外1/2至2/3的區(qū)域［1］，保障管壁自身的物質(zhì)代謝及能量代謝。G?ssl等［2］利用Micro-CT檢測方法發(fā)現(xiàn)，高脂組的血管滋養(yǎng)管密度和內(nèi)中膜層厚度較正常組均明顯增多；而新生滋養(yǎng)血管的破裂使得巨噬細(xì)胞積累、脂質(zhì)/壞死核心擴(kuò)大，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，已經(jīng)被確定為斑塊進(jìn)展和斑塊破裂并發(fā)癥的啟動因子，管壁微血管的分布密度與AS病變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。此外研究顯示在AS早期外膜微血管滋生過程中，外膜局部氧化及抗氧化酶活性發(fā)生改變［3］要早于整體氧化還原系統(tǒng)。桂芍通絡(luò)是以營衛(wèi)學(xué)說與血脈理論指導(dǎo)制定的營衛(wèi)通絡(luò)方，我們試圖圍繞氧化應(yīng)激作用，探討AS早期外膜滋養(yǎng)血管新生機(jī)制及桂芍通絡(luò)的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級日本大耳白兔84只，♀♂各半，體質(zhì)量（2.0±0.3）kg，購自北京富豪實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（京）2010-0010。單籠飼養(yǎng)于河北絡(luò)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。每天12 h間隔照明，溫度20～25℃，濕度40％～70％，每日通風(fēng)，定時(shí)消毒。

1.2 藥品、試劑與儀器 阿托伐他汀片（輝瑞制藥有限公司，批號：L14578）；通心絡(luò)超微粉（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號：S-130901）；桂芍通絡(luò)超微粉（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，將桂芍通絡(luò)按臨床所用劑量比例稱取，采用水提、醇提、提油等制備工藝，濃縮干燥制成膠囊原粉）；VEGF鼠抗兔單克隆抗體（英國Abcam公司，批號：ab1316）；VEGFR-2山羊多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：sc-48161）；檸檬酸鈉（阿拉丁，生產(chǎn)批號：6132-04-3）；50×Denhardts（北京索萊寶，生產(chǎn)批號：D1080）；蛋白酶K（Beyotime，生產(chǎn)批號：ST532）；7080全自動生化分析儀（日本日立公司）；3K15型高速冷凍離心機(jī)（Sigma）；MDF-U50V型－80℃冰箱（SANYO）；

1.3 方法

1.3.1 動物分組及造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將84只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為正常組、高脂組、外膜損傷組、桂芍通絡(luò)高劑量（GH）組、桂芍通絡(luò)中劑量（GM）組、阿托伐他?。ˋTO）組、通心絡(luò)（TXL）組，每組12只。正常組給予普通飼料，高脂組給予高脂飼料［4］（膽固醇1％、豬油5％、膽固醇7.5％及基礎(chǔ)飼料86.5％）喂養(yǎng)建立早期高脂血癥模型，外膜損傷組及各用藥組實(shí)施高脂飲食復(fù)合右側(cè)頸動脈硅膠管包裹術(shù)。3％戊巴比妥鈉（1 mL·kg－1）耳緣靜脈注射麻醉后，將實(shí)驗(yàn)兔仰臥固定于手術(shù)臺，備皮后消毒，沿頸部正中剪開皮膚，鈍性分離，暴露氣管右側(cè)搏動的頸總動脈鞘，用眼科鑷配合玻璃分針仔細(xì)游離出右頸動脈（RCA）2.5 cm，將消毒后的硅膠管（內(nèi)徑1.7 mm，外徑3.2 mm，長2 cm）縱向剖開后，包裹于右側(cè)頸動脈，避免損傷鞘膜內(nèi)的迷走神經(jīng)、交感神經(jīng)，局部滴加鏈霉素，逐層縫合傷口，術(shù)后連續(xù)3 d行2次/日局部消毒。實(shí)驗(yàn)室每日按時(shí)通風(fēng)消毒。

1.3.2 標(biāo)本采集 術(shù)后4周時(shí)取材，標(biāo)本采集前禁水禁食12 h，3％戊巴比妥鈉（1 mL·kg－1）耳緣靜脈注射麻醉，腹主動脈取血。備皮消毒后，行頸部正中切口，迅速分離取下術(shù)側(cè)頸動脈，生理鹽水洗凈，一部分置入4％多聚甲醛溶液固定，用于熒光原位雜交檢測及蘇木精－伊紅（HE）染色。另一部分液氮凍存以備Western blot檢測。

1.3.3 血脂測定 取全血，4℃、3 500 r·min－1離心10 min，取上清液分裝入EP管，采用日立7080全自動生化分析儀測定TC、TG和LDL-C水平。

1.3.4 HE染色觀察血管內(nèi)中外膜病理形態(tài)變化將已固定的標(biāo)本脫水浸蠟包埋，切片脫蠟，PBS沖洗，蘇木精液浸染2 min，流水沖洗，0.3％鹽酸乙醇分化，自來水返藍(lán)，伊紅染液4 min，封片，光鏡下觀察。

1.3.5 血清SOD、MDA、T-AOC表達(dá)水平 采用黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶（SOD），TBA法檢測丙二醛（MDA），化學(xué)比色法檢測總抗氧化能力（T-AOC）。詳細(xì)的檢測步驟按照試劑盒說明書操作。

1.3.6 熒光原位雜交檢測p22phox和gp91phoxmR-NA的定位與表達(dá) 探針由上海諾辰生物技術(shù)有限公司合成，序列信息如下：gp91phox，5′FITC＋AC-CATTTTATGAAAAGTGAGATTTCTG；p22phox，5′FITC ＋CCAGGAGCTTCAGCACGGCGGTCAGGTAGCG。將已固定的標(biāo)本脫水浸蠟包埋，切片脫蠟后浸入蛋白酶K液，置入37℃水浴鍋中孵育20 min，室溫漂洗后，梯度酒精脫水；將切片置于盛有變性液的染色缸內(nèi)75℃孵育8 min，同時(shí)將含有RNA探針的雜交液于75℃孵育8 min，梯度酒精脫水；干燥后在玻片的標(biāo)本區(qū)加入50 μL已變性的探針，放入濕盒，42℃烘箱雜交過夜（12～16 h）；雜交后洗脫、酒精梯度脫水風(fēng)干，熒光鏡下觀察。

1.3.7 Western blot檢測VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá) 取出液氮凍存標(biāo)本，于預(yù)冷的PBS液中剔除周圍組織，縱向剖開血管，剝離外膜干燥后稱重；取100 mg標(biāo)本，1 mL細(xì)胞裂解液充分裂解后，進(jìn)行蛋白定量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠半干轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上；5％脫脂奶粉封閉后，與VEGF/VEGFR-2抗體4℃孵育過夜；室溫洗膜后，與相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，洗膜后，抗體結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測。以GAPDH為內(nèi)參，以目的基因吸光度值/GAPDH吸光度值的比值表示所檢測標(biāo)本目的蛋白的相對含量，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用±s表示，組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性兩兩比較采用最小顯著差法（LSD），方差不齊用Dunnett’s T3法。

2 結(jié)果

2.1 各組血脂水平比較 Tab 1示，高脂組和外膜損傷組的血清TC、TG及LDL-C水平較正常組明顯升高（P＜0.01）；與外膜損傷組相較，各藥物組均降低血脂水平，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；藥物組之間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組兔頸動脈HE染色病理結(jié)果 如Fig 1所示，正常組頸動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞完整連續(xù)，中膜以平滑肌細(xì)胞為主；高脂組內(nèi)膜增生，中膜間隙增寬，外膜微血管表達(dá)數(shù)量增多；外膜損傷組內(nèi)膜彌漫性增生，內(nèi)皮細(xì)胞脫落，可見少量泡沫狀巨噬細(xì)胞形成，中膜間隙增寬，內(nèi)彈力板彎曲嚴(yán)重，平滑肌細(xì)胞和彈力纖維排列紊亂，外膜滋養(yǎng)血管豐富；與外膜損傷組比較，各用藥組內(nèi)膜層部分增厚，中膜走形較清晰，外膜滋養(yǎng)血管數(shù)量減少。

2.3 各組血清SOD、MDA、T-AOC表達(dá)水平Tab 2示，與正常組相比，高脂組和外膜損傷組血清SOD、T-AOC活性明顯下降，MDA含量明顯升高（P ＜0.01）；與外膜損傷組相比，GH組、GM組、ATO組及TXL組SOD、T-AOC活性明顯升高，MDA含量降低；各藥物組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組p22phox和gp91phoxmRNA的定位與表達(dá) 正常組gp91phox和p22phox基因雜交信號表達(dá)極少，高脂組和外膜損傷組的gp91phox和p22phox表達(dá)呈強(qiáng)陽性，主要分布在新生內(nèi)膜和外膜微血管附近，在血管外膜gp91phox基因雜交信號分布較p22phox更為密集。GH組、GM組、ATO組及TXL 組gp91phox和p22phox基因雜交信號在外膜的表達(dá)均減弱（Fig 2、3）。

Tab 1 Changes of blood lipids of rabbit in various groups（±s，n＝6）

Tab 1 Changes of blood lipids of rabbit in various groups（±s，n＝6）

＃＃P＜0.01 vs normal；**P＜0.01 vs model

Group TC/mmol·L－1 TG/mmol·L－1 LDL-C/mmol·L －1 Normal 2.70±0.32 0.78±0.29 1.00±0.23 High-fat 36.36±3.52＃＃ 4.61±0.77＃＃ 16.78±3.11＃＃Adventitial injury 42.72±10.99＃＃ 6.01±1.40＃＃ 21.21±6.46＃＃GH 22.77±5.40** 2.65±0.50** 5.97±0.99**GM 26.68±5.46** 2.93±0.43** 7.29±2.94**ATO 16.66±2.29** 2.16±0.35** 5.79±1.19**TXL 21.98±5.39** 2.27±0.74** 5.98±2.37**

Tab 2 Comparision of serum SOD，MDA and T-AOC levels in various groups（±s，n＝8）

Tab 2 Comparision of serum SOD，MDA and T-AOC levels in various groups（±s，n＝8）

＃＃P＜0.01 vs normal；**P＜0.01 vs model

Group SOD/kU·L－1 MDA/μmol·L－1 T-AOC/kU·L －1 Normal 282.97±42.98 4.25±0.97 11.36±2.31 High-fat 188.24±33.92＃＃ 18.45±2.46＃＃ 4.55±1.37＃＃Adventitial injury 153.92±34.88＃＃ 24.37±4.13＃＃ 2.94±0.88＃＃GH 243.81±51.91** 10.52±2.66** 7.82±1.92**GM 219.04±58.69** 15.45±2.94** 5.80±0.58**ATO 263.67±32.87** 7.39±1.28** 8.76±1.49**TXL 254.06±59.98** 9.09±1.53** 8.43±1.57**

Fig 1 Appearance of carotid artery morphology in all groups（HE staining×400）

Fig 2 Localization and expression of gp91phoxmRNA in rabbit carotid arteries by in situ hybridization（×200）

Fig 3 Localization and expression of p22phox mRNA in rabbit carotid arteries by in situ hybridization（×200）

2.5 各組頸動脈外膜VEGF、VEGFR-2蛋白水平與正常組相比，高脂組VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)明顯增高（P＜0.01，P＜0.05）；與高脂組相比，外膜損傷組VEGF、VEGFR-2蛋白水平明顯上調(diào)（P＜0.01）；與外膜損傷組相比，GH組、GM組、ATO組及TXL組VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.01），各藥物組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig 4，Tab 3）。

3 討論

小鼠和人類的正常心肌內(nèi)血管并不存在滋養(yǎng)血管，滋養(yǎng)血管主要存在于超過29層的動脈壁或管腔直徑＞0.05 mm的血管外膜及外膜內(nèi)側(cè)層。Hyuck Moon Kwon等運(yùn)用Micro-CT技術(shù)重建器官內(nèi)血管空間分布，證實(shí)高膽固醇飲食喂養(yǎng)豬在冠狀動脈病變形成之前存在外膜滋養(yǎng)血管異常增生，一級與二級滋養(yǎng)血管數(shù)量比值發(fā)生逆轉(zhuǎn)，形成密度增加、紊亂而不規(guī)則的微血管網(wǎng)絡(luò)，其密度增加使得中、內(nèi)膜層增厚，表明新生滋養(yǎng)血管與AS病變發(fā)展密切相關(guān)。我們采用高脂飲食喂養(yǎng)建立高脂血癥模型，利用高脂飲食復(fù)合右側(cè)頸總動脈硅膠管包裹術(shù)［5］在短時(shí)間內(nèi)建立AS早期血管外膜損傷模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂組和外膜損傷組血清TC、TG、LDL-C水平明顯升高（P＜0.01），HE染色內(nèi)膜增厚，外膜微血管數(shù)量增多，VEGF、VEGFR-2蛋白升高（P＜0.05，P ＜0.01），表明高脂血癥模型及外膜損傷模型建立成功。既往研究已證實(shí)他汀類藥物、通心絡(luò)具有降脂作用，且能夠通過保護(hù)微血管內(nèi)皮而抑制微血管異常增生，采用阿托伐他汀和通心絡(luò)作為陽性對照，以進(jìn)一步驗(yàn)證“營衛(wèi)通絡(luò)方”桂芍通絡(luò)對AS早期外膜滋養(yǎng)血管及氧化應(yīng)激機(jī)制的干預(yù)作用。

Fig 4 Expression of VEGF and VEGFR-2 protein in adventitia of common carotid artery in various groups

Tab 3 Expression of VEGF and VEGFR-2 protein in adventitia of common carotid artery in various groups（±s，n＝3）

Tab 3 Expression of VEGF and VEGFR-2 protein in adventitia of common carotid artery in various groups（±s，n＝3）

＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs normal；△△P＜0.01 vs high-fat；**P＜0.01 vs model

Group VEGF VEGFR-2 Normal 0.10±0.01 0.13±0.03 High-fat 0.24±0.03＃＃ 0.26±0.06＃Adventitial injury 0.41±0.07△△ 0.45±0.10△△GH 0.16±0.02** 0.19±0.02**GM 0.23±0.04** 0.22±0.04**ATO 0.13±0.03** 0.14±0.03**TXL 0.17±0.04** 0.17±0.04**

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最主要的促進(jìn)血管生成的生長因子，在正常組織中低表達(dá)，在胚胎和有血管生成的組織中高表達(dá)。VEGF家族受體主要包括非酪氨酸激酶受體和酪氨酸激酶受體兩大類，后者主要包括VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3［6］。VEGF主要通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移來特異性促進(jìn)血管新生［7］。抑制血管新生藥物的使用明顯抑制了滋養(yǎng)血管新生及VEGF的表達(dá)，導(dǎo)致血管面積分?jǐn)?shù)、中、內(nèi)膜厚度明顯減少［8］。而氧化應(yīng)激通過激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、氨基末端激酶（JNK）和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，參與VEGF誘導(dǎo)動脈壁血管新生［9］。ROS是與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的自由基，其生成或清除可引起機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而起關(guān)鍵作用的ROS大多是NAD-PH氧化酶源性。NADPH氧化酶是多亞單位復(fù)合體酶，由gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、p40phox 和Rac 6種亞基組成［10］，膜結(jié)合亞基gp91phox和p22phox形成的異元二聚體是NADPH氧化酶的核心［11］。有研究證實(shí)，p22phox基因敲除誘發(fā)小鼠腫瘤血管新生障礙；在小鼠后肢缺血模型中，gp91phox基因敲除可以阻滯毛細(xì)血管密度的增加，可能與抑制gp91phox結(jié)合actin肌動蛋白有關(guān)［12］。SOD是清除自由基的主要防御酶，維持正常生物體內(nèi)氧化系統(tǒng)與還原系統(tǒng)的動態(tài)平衡［13］。細(xì)胞被自由基攻擊，細(xì)胞壁破裂、細(xì)胞膜磷脂降解形成最終裂解產(chǎn)物MDA，間接反映自由基的生成量和對組織的氧化程度。T-AOC能夠反映機(jī)體酶及非酶促體系總抗氧化能力水平。在AS早期外膜滋養(yǎng)血管新生階段，gp91phox和p22phox基因雜交信號陽性表達(dá)明顯升高，血清SOD、T-AOC活性明顯下降、MDA活性上調(diào)，表明NADPH氧化酶活性升高促進(jìn)的外膜氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)管壁微血管新生的重要機(jī)制。

桂芍通絡(luò)膠囊是擷取東漢張仲景調(diào)和營衛(wèi)及歷代醫(yī)家運(yùn)用通絡(luò)法治療血脈病變的用藥經(jīng)驗(yàn)調(diào)制的經(jīng)驗(yàn)方，以桂枝與白芍為基礎(chǔ)，一通衛(wèi)陽，一理營陰，合以薤白疏暢營衛(wèi)氣機(jī)運(yùn)行以防絡(luò)氣郁滯，以達(dá)營衛(wèi)暢達(dá)，氣血流行；輔以丹參、姜黃活血通絡(luò)，剔除絡(luò)中淤血。桂芍通絡(luò)能夠明顯減少VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)，有效下調(diào)gp91phox和p22phox基因雜交信號在外膜的表達(dá)，上調(diào)血清SOD、T-AOC活性，減少M(fèi)DA表達(dá)；與阿托伐他汀組和通心絡(luò)組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明“調(diào)和營衛(wèi)方”桂芍通絡(luò)一定程度上能夠通過抑制外膜氧化應(yīng)激水平，提高血管系統(tǒng)和外膜局部的抗氧化能力，而抑制管壁血管新生，延緩AS病變進(jìn)程。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)于河北省絡(luò)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理室王宏濤博士、張軍方博士、張會欣博士、劉克劍博士、劉煥、單星閣、崔雯雯、郭佳祿、劉文正等其他成員在實(shí)驗(yàn)過程中給予的熱情幫助。）

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Influence of Guishaotongluo on angiogenesis of adventitial vasa vasorum and oxidative stress in early stage of atherosclerosis

YIN Yu-jie1，2，3，MA Liu-yi1，2，3，WEI Geng1，2，3，LI Hong-rong1，2，3，JIA Zhen-hua1，2，3
［1.Graduate School，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Dept of Cardiology，Yiling Medical Institute of Hebei Province，Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine（Cardio-cerebral Vsacular Collateral Disease），Shijiazhuang 050035，China；3.Yiling Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，China］

Aim To observe the effect of Guishao-tongluo（GSTL）on the angiogenesis of vasa vasorum and oxidative stress in the early stage of atherosclero-sis.Methods The rabbits（n＝84）were randomly divided into 7 groups（n＝12）：control group，high-fat group，adventitial injury group，GSTL high（GH）and medium（GM）dose group，atorvastain group（ATO），and Tongxinluo group（TXL）.The normal group was fed with common foodstuffs，and high-fat foodstuffs for the high-fat group to establish an early model of hyper-lipidemia，and all the other groups were fed with high-fat diet combined with carotid artery cannula to build early atherosclerosis carotid artery injury rabbit mod-els.The GSTL high and medium dose was given Guishaotongluo ultrafine powder 4.16，2.08 g·kg－1· d－1respectively.The atorvastain group and Tongxinluo group were given suspension of atorvastain solution 2.5 mg·kg－1·d－1，Tongxinluo supermicro powder 0.6 g ·kg－1·d－1.All groups were treated with gastric per-fusion for 4 weeks.Biochemical method was applied to detect blood lipid change.HE staining was used to ob-serve the pathological morphology of intima-media.Aactivity of serum superoxide dismutase（SOD），malon-dialdehyde（MDA）content and the total antioxidant capacity（T-AOC）in artery serum were detected.NADPH subunits p22phox mRNA，gp91phoxmRNA in carotid arteries were located and semi-quantitated by fluorescence in situ hybridization.The expression of VEGF，VEGFR-2 in the carotid artery adventitia was detected by Western blot.Results Compared with normal group，the contents of TC，TG and LDL-C were significantly increased，and VEGF，VEGFR-2 protein levels were remarkly increased in high-fat and adventi-tial injury group.The carotid artery injuries，the degree of angiogenesis of vasa vasorum and NADPH subunits p22phox，gp91phoxmRNA in adventitia tissue of the GH，GM，ATO and TXL group were milder in varying degrees compared with those of the vasa injury group.Also the activity of SOD，T-AOC increased，while MDA content，VEGF，VEGFR-2 protein levels were remarkly decreased（P＜0.5 or P＜0.01）.Conclusions GSTL can inbibit adventitial neovascularization in the early stage of atherosclerosis，and its mechanism might be related to the increase of total antioxidant capacity of the vascular system and adventitia tissue.

atherosclerosis；adventitial injury；angio-genesis of vasa vasorum；VEGF；oxidative stress；fluo-rescence in situ hybridization

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.046.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.023

A

1001－1978（2016）03－0416－07

R-332；R322.12；R364.3；R543.502.2；R977.6

2015－11－13，

2015－12－01

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）資助項(xiàng)目（No 2012CB518606）；河北省杰出青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No H201506063）

尹玉潔（1989－），女，碩士，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病，E-mail：963895141＠qq.com；賈振華（1975－），男，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病，通訊作者，E-mail：jiatcm＠163.com