HSP70抑制劑PFTμ對干擾素γ誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)的研究

袁小媚，雷 寒，夏 勇

（1.四川省人民醫(yī)院心血管科，四川成都 621000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400016；3.美國俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Davis心肺研究所，美國 43210）

HSP70抑制劑PFTμ對干擾素γ誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)的研究

袁小媚1，2，3，雷 寒2，夏 勇3

（1.四川省人民醫(yī)院心血管科，四川成都 621000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400016；3.美國俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Davis心肺研究所，美國 43210）

目的 觀察熱休克蛋白70抑制劑PFTμ對干擾素γ （IFN-γ）誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞一氧化氮（NO）的生成及誘生型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)的作用。方法 采用IFN-γ誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞株建立細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，采用Griess試劑法測定細(xì)胞NO釋放量；采用Western blot法測定相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)；采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分析iNOS mRNA表達(dá)的變化。建立小鼠心臟缺血/再灌注（I/R）模型，分為對照組和給藥組，測定小鼠心肌梗死面積的變化。結(jié)果 PFTμ可抑制IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的生成、iNOS蛋白及mRNA表達(dá)。其作用機(jī)制可能是通過部分抑制RAW264.7細(xì)胞核內(nèi)的IRF-1蛋白表達(dá)。PFTμ可減少缺血/再灌注小鼠心臟梗死面積（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)FTμ可通過部分抑制細(xì)胞核內(nèi)IRF-1蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)的作用。

熱休克蛋白；干擾素γ；一氧化氮；誘生型一氧化氮合酶；PFTμ；缺血/再灌注損傷

巨噬細(xì)胞在外部細(xì)菌毒素如干擾素γ（IFN-γ）等刺激時，可促使炎癥介質(zhì)如一氧化氮（NO）等的分泌，這被廣泛應(yīng)用于研究炎癥反應(yīng)。Pifithrin-μ （PFTμ）是近期新報道的一種小分子，它是一種熱休克蛋白70（HSP70）抑制劑，能夠選擇性抑制HSP70的蛋白質(zhì)功能［1］。因此，本研究以IFN-γ誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞為反應(yīng)模型，擬探討HSP70抑制劑PFTμ在炎癥反應(yīng)中的作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 IFN-γ、TRIzol提取試劑盒等購于Sigma公司，PFTμ購于CalBiochem公司，iNOS購于BD公司。DMEM培養(yǎng)基、Griess Reagent試劑盒、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒等購于Invitrogen公司，胎牛血清購于Gibco公司。蛋白濃度測量試劑購于Bio-Rad公司。

1.1.2 細(xì)胞與實(shí)驗動物及其分組 RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞和♂C57BL/6小鼠（20～30 g）由美國俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗動物中心提供。細(xì)胞實(shí)驗分組：給藥組中加入PFTμ（終濃度20 μmol· L－1）預(yù)處理15 min后，再加入IFN-γ（終濃度2 mg ·L－1），對照組中加入等量DMSO預(yù)處理相同時間后，再加入同等IFN-γ。實(shí)驗重復(fù)至少3次。C57BL/6♂小鼠隨機(jī)分為2組：對照組10只，給藥組（PFTμ 40 mg·kg－1，溶于DMSO腹腔注射）10只。

1.2 方法

1.2.1 一氧化氮測定 根據(jù)Griess Reagent試劑盒說明書，將300 μL溶液［20 μL Griess試劑、150 μL細(xì)胞培養(yǎng)液（對照組和給藥組）、130 μL去離子水］混合于96孔板的孔中，20 μL Griess試劑加280 μL去離子水作為空白對照。室溫下放置30 min后，用分光光度儀測量每孔混合液的吸光度（波長548 nm），并校正曲線。

1.2.2 Western blot測定 用PBS液收集RAW 264.7細(xì)胞，3 000～3 500 r·min－1室溫下離心3～5 min，根據(jù)沉淀大小加入細(xì)胞裂解液（RIPA 89％，PIC 10％，EDTA 1％），置于冰上30 min，再12 000 r ·min－14℃離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)至新管后，取其中5 μL測定蛋白濃度，根據(jù)濃度計算配比等質(zhì)量的樣品，99℃5 min蛋白變性。150 V，1.5％膠電泳1 h，醋酸紙浸入轉(zhuǎn)膜液15 min。15 V、35 min（一塊膠）～45 min（兩塊膠）轉(zhuǎn)膜。5％脫脂牛奶室溫下孵育1 h，TBST洗3次，加入一抗4℃過夜。TBST再洗3次，加入二抗（1％脫脂牛奶稀釋1∶5 000），室溫下孵育1h，TBST洗3次，室溫下顯影液孵育5 min，暗室顯影。

1.2.3 RT-PCR 總RNA按照TRIzol抽提試劑說明書進(jìn)行。取8 μL做凝膠電泳，其余置－80℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系條件如下：預(yù)變性94℃30 s，變性94℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃1 min，25個循環(huán)，最后延伸72℃7min。結(jié)束后，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳（95V，30 min）鑒定，用凝膠成像儀進(jìn)行灰度掃描分析。

1.2.4 細(xì)胞核提取 用PBS液收集細(xì)胞后3 000 r ·min－1，5 min，4℃離心，加入250～500 μL低滲緩沖液，冰上放置20 min（10 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol·L－1NaCl，1.5 mmol·L－1MgCl2），均勻勻漿20次；3 000 r·min－1，5 min，4℃離心，吸走上清液；每管加入0.5 mL低滲緩沖液，輕輕混合沉淀，再離心，反復(fù)2次；每管再加入RIPA 50～80 μL冰上放置30 min，測細(xì)胞蛋白濃度配樣本。

1.2.5 小鼠I/R模型的建立及梗死面積的測定實(shí)驗分組見“1.1.2”，建立小鼠I/R模型。結(jié)扎心臟左冠狀動脈前降支1 h，再灌注24 h后，取小鼠心臟標(biāo)本PBS清洗，扎緊冠狀動脈左前降支，由主動脈推入1％Evan-Blue液2～3 mL，－20℃冰凍30 min后，將心臟從心尖到心基底部平行切成2 mm厚度的小片，置于1.5％氯化三苯基四氮唑（TTC）37℃孵育10～30 min，染色后，置于10％甲醛中固定，可見梗死區(qū)呈現(xiàn)白色，再灌注區(qū)呈現(xiàn)紅色，正常心肌組織區(qū)呈現(xiàn)藍(lán)色。照相并軟件分析計算出缺血危險區(qū)（AAR）和梗死區(qū)（IS）的面積，用每張切片重量計算百分比，心肌梗死程度以IS/AAR來表示。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行配對資料t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PFTμ不同時間對IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放一氧化氮的影響 結(jié)果顯示，0～4 h，PFTμ組、對照組中NO含量基本無變化；8 h起，IFN-γ組NO含量開始上升，與對照組比較差異有顯著性（P＜0.05）；隨著時間延長，IFN-γ組釋放的NO量繼續(xù)增加，在8～12 h間升高幅度最大。PFTμ組與IFN-γ組走勢相似，但NO含量要明顯低于IFN-γ組，兩組比較差異有顯著性（P＜0.05）。這表明在0～12 h之間，PFTμ呈現(xiàn)時間依賴性地降低IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放一氧化氮（Fig 1）。

2.2 PFTμ不同時間對IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，0～4 h，PFTμ組、對照組中iNOS蛋白表達(dá)基本無變化；在8 h時，IFN-γ開始誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞大量表達(dá)iN-OS蛋白，8～12 h之間iNOS蛋白表達(dá)逐漸增多。而PFTμ組8～12 h之間無iNOS蛋白表達(dá)，提示PFTμ（終濃度20 μmol·L－1）能明顯抑制IFN-γ誘導(dǎo)的iNOS蛋白表達(dá)。這表明在0～12 h之間，PFTμ呈現(xiàn)時間依賴性地抑制IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)（Fig 2）。

2.3 PFTμ不同時間對IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS mRNA的影響 結(jié)果顯示，0～4 h，PFTμ組、對照組中iNOS mRNA表達(dá)基本無變化；4 ～8 h時，IFN-γ開始誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞大量表達(dá)iNOS mRNA，而PFTμ組iNOS mRNA無表達(dá)，提示PFTμ（終濃度20 μmol·L－1）能明顯抑制IFN-γ誘導(dǎo)iNOS mRNA表達(dá)。這表明在0～8 h之間，PFTμ呈現(xiàn)時間依賴性地降低IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)（Fig 3）。

Fig 3 Effect of PFTμ on iNOS mRNA expression in RAW 264.7 cells induced by IFN-γ

2.4 PFTμ不同時間對IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞Stat1蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，在0～4 h之間，IFN-γ開始刺激RAW264.7細(xì)胞磷酸化Stat1 （Ser727Stat1和Tyr701Stat1）蛋白的表達(dá)，而PFTμ組磷酸化的Stat1表達(dá)無明顯變化，提示PFTμ對IFN- γ誘導(dǎo)的Stat1蛋白表達(dá)無明顯影響。這表明在0～4 h之間，PFTμ沒有通過抑制Stat1蛋白表達(dá)而發(fā)揮抑制iNOS表達(dá)的作用（Fig 4）。

Fig 4 Effect of PFTμ pretreatment on IFN-γ-induced phosphorylated-Stat1 activation in RAW264.7 cells

2.5 PFTμ對IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞核IRF-1蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，空白組細(xì)胞核有少量IRF-1蛋白表達(dá)，IFN-γ組細(xì)胞核IRF-1蛋白表達(dá)增加，而PFTμ組IRF-1蛋白表達(dá)明顯減少（P ＜0.05），提示PFTμ對IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞核內(nèi)IRF-1蛋白表達(dá)有抑制作用。這表明早期PFTμ通過部分抑制細(xì)胞核內(nèi)IRF-1蛋白表達(dá)而發(fā)揮抑制iNOS表達(dá)的作用（Fig 5）。

2.6 PFTμ對小鼠I/R心肌梗死面積的影響 結(jié)果顯示，對照組和給藥組比較發(fā)現(xiàn)，給藥組心肌梗死面積明顯小于對照組（P＜0.05）。結(jié)果提示PFTμ （40 mg·kg－1，腹腔注射）能明顯降低I/R小鼠心肌梗死面積（Fig 6）。

3 討論

熱休克蛋白70功能較多，與細(xì)胞耐熱性的產(chǎn)生有關(guān)，是主要伴侶蛋白之一，并可能是機(jī)體衰老或細(xì)胞老化的一個重要因素等等，因而成為熱休克蛋白中關(guān)注最廣、研究最深的一種。本實(shí)驗我們選擇以一氧化氮為靶點(diǎn)分子，研究熱休克蛋白70抑制劑PFTμ在炎癥作用中的作用及其分子機(jī)制，關(guān)于這一研究內(nèi)容國內(nèi)外文獻(xiàn)報道較少。NO的大量生成與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，它是一種具有生物活性的氣體分子，是細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，具有介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥毒性的功能。在活化的巨噬細(xì)胞中，iNOS水平對一氧化氮的產(chǎn)生起到關(guān)鍵的作用。調(diào)節(jié)一氧化氮生成或誘生型一氧化氮合酶表達(dá)可能是治療炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)［2］。

Fig 5 Western blot analysis of IRF-1 protein from nuclear extracts in RAW 264.7 cells

Fig 6 Mouse experiment

PFTμ是最近報道的一種小分子，在抑制癌癥反應(yīng)方面有著明顯的作用，能選擇性地與壓力誘導(dǎo)的熱休克蛋白70相互影響，并抑制其功能。iNOS在生理情況下表達(dá)量很少，但在一系列炎癥因子的刺激下，可發(fā)生iNOS的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)。合成的一氧化氮不僅直接導(dǎo)致細(xì)胞損傷，同時加重炎癥反應(yīng)［3］。熱休克蛋白70對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用引起了國內(nèi)外心血管界的高度重視［4］。有研究報道［5］發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理的保護(hù)作用不是熱休克蛋白產(chǎn)生，其主要作用是由一氧化氮產(chǎn)生。同時，大量研究表明［6－9］，缺血預(yù)處理的發(fā)生是由iNOS途徑介導(dǎo)的。我們研究報道首次發(fā)現(xiàn)，PFTμ對IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的釋放呈現(xiàn)時間依賴性的抑制作用，同時對IFN-γ誘導(dǎo)的iNOS蛋白及mR-NA的表達(dá)呈現(xiàn)時間依賴性的抑制作用，從而我們推測，PFTμ對RAW264.7細(xì)胞NO的影響與改變iNOS表達(dá)量的變化有關(guān)。

大量研究報道表明［10－13］，與IFN-γ密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有幾條，最主要的是JAK-Stat1信號通路，其主要的下游蛋白是磷酸化的Stat1，而PFTμ與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)聯(lián)［1］。本實(shí)驗首次研究發(fā)現(xiàn)，在0～4 h之間，PFTμ沒有通過抑制RAW264.7細(xì)胞中Stat1蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抑制iN-OS表達(dá)的作用，從而推測PFTμ抑制RAW264.7細(xì)胞中IFN-γ誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)的作用機(jī)制與JAK-Stat1通路無關(guān)，這在國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報道。IRF-1（interferon regulatory factor 1）在IFN-γ刺激的iN-OS轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要的作用。有報道顯示，IRF-1介導(dǎo)IFN-γ誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)，而IRF-1缺失小鼠不能誘導(dǎo)iNOS表達(dá)［14－16］。我們研究發(fā)現(xiàn)，PFTμ對IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞核內(nèi)IRF-1蛋白表達(dá)有抑制作用。這表明早期PFTμ通過部分抑制細(xì)胞核內(nèi)IRF-1蛋白表達(dá)而發(fā)揮抑制iNOS表達(dá)的作用。

缺血/再灌注損傷是最常見的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，PFTμ作為HSP70的選擇性抑制劑，明顯降低了I/R小鼠的心肌梗死面積，提示PFTμ對心臟具有一定的保護(hù)作用。有研究報道［5］，缺血預(yù)處理的保護(hù)作用不是由HSP產(chǎn)生的，其主要作用是由NO產(chǎn)生的。同時，大量研究表明，缺血預(yù)處理的發(fā)生是由iNOS途徑介導(dǎo)的，某些藥物也可明顯抑制IFN-γ誘導(dǎo)iNOS的表達(dá)［17］。我們推測，PFTμ可能通過抑制NO的生成和iNOS的表達(dá)而發(fā)揮作用。

綜上所述，我們研究報道發(fā)現(xiàn)，HSP70抑制劑PFTμ明顯抑制IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的生成、iNOS蛋白及mRNA的表達(dá)，其作用機(jī)制可能是通過早期部分抑制RAW264.7細(xì)胞核內(nèi)IRF-1蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。這部分研究內(nèi)容國內(nèi)外報道少。關(guān)于PFTμ更深入的分子生物學(xué)作用機(jī)制我們正在做大量的工作。

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Effects of HSP70 inhibitor on expression of iNOS induced by IFN-γ

YUAN Xiao-mei1，2，3，LEI Han2，XIA Yong3
（1.Sichuan Academy of Medical Sciences＆Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 621000，China；2.Dept of Cardiology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；3.Davis Heart and Lung Research Institute，Division of Cardiovascular Medicine，Dept of Internal Medicine，the Ohio State University，Columbus，OH 43210，USA）

Aim To research the effects of HSP70 in-hibitor（PFTμ）on the expressions of iNOS induced by IFN-γ in RAW 264.7 cells.Methods The NO con-centration was measured by Griess Kit.The expression of interest protein was measured by Western blot and iNOS mRNA was measured by RT-PCR.Mouse cardi-ac ischemia-reperfusion（I/R）model was established to set up the inflammatory response.These were divid-ed into control and treated groups.The infarct size was monitored on myocardial I/R mice.Results We found that PFTμ significantly blocked the production of NO and the expression of iNOS protein and mRNA in RAW 264.7 cells.The mechanism may be part of the inhibition of nuclear IRF-1 protein expression.We also found that PFTμ reduced the infarct size in myocardial I/R mice（P＜0.05）.Conclusion These results suggest that PFTμ down-regulates the IFN-γ-induced iNOS transcription through decreasing translocated IRF-1 protein.

HSP；IFN-γ；NO；iNOS；PFTμ；ische-mia-reperfusion injury

時間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.036.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.018

A

1001－1978（2016）03－0390－05

R-332；R341；R542.202.2；R977.3；R977.6

2015－10－15，

2015－11－16

袁小媚（1981－），女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：冠心病的發(fā)病機(jī)制，E-mail：yuanxiaomei0903＠126.com；雷 寒（1957－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：冠心病的發(fā)病機(jī)制，通訊作者，E-mail：hanleicq＠hotmail.com