榛蘑中多糖水提法工藝優(yōu)化

多糖是具有多種生物活性的大分子物質(zhì)。本實驗采用熱水浸提的方法從榛蘑中提取多糖，通過單因素試驗和正交試驗，研究了浸提溫度、時間以及料液比對多糖提取率的影響。從單因素試驗表分析可得溫度是影響多糖提取率的主要因素。通過正交試驗確定最佳提取工藝為料液比1：30、溫度100℃、浸提時間為4h，在最佳提取工藝時，榛蘑多糖提取率為3.28%。

多糖是由單糖基通過糖苷鍵連接而成的化合物，具有抗腫瘤、抗病毒，促進(jìn)免疫等多種生物活性。此外它還能影響細(xì)胞的分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和衰老。大多數(shù)真菌多糖易被生物降解，長期服用可達(dá)到防治腫瘤的目的，是一種很好的廣譜免疫增強劑。因此，多糖在生物醫(yī)藥、保健食品、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、化妝品等方面具有獨特的應(yīng)用價值。

榛蘑（Armillariella mellea）產(chǎn)于黑龍江三江平原地區(qū)，屬于真菌類物質(zhì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，榛蘑具有防癌抗癌、防治病毒性疾病穩(wěn)定血壓等功能，目前從榛蘑中提取粗多糖工藝的研究還很少。多糖的提取工藝方法有多種，但醇提、堿提、酸提等都能不同程度的破壞多糖，因此本實驗采用熱水浸提法。

1 材料及方法

1.1材料、試劑及儀器

材料：購于內(nèi)蒙古海拉爾地區(qū)。

試劑：無水乙醇，85%、95%乙醇，丙酮，無水乙醚，蒽酮，濃硫酸，葡萄糖，三氯甲烷，正丁醇。

儀器：電子天平，恒溫水浴鍋，電熱恒溫干燥箱，循環(huán)水式多用真空泵，離心機，分液漏斗，分光光度計。

1.2方法

1.2.1多糖的提取流程

將榛蘑原料水洗，60℃烘干后粉碎。稱取一定量的榛蘑粉末加入相應(yīng)體積的水，置于冰箱中，凍融處理后在一定溫度下進(jìn)行一定時間的提取。將提取后的溶液過濾，剩余殘渣重復(fù)提取2-3次，合并提取液加熱濃縮至1/3體積。用Sevag法除蛋白，再用3倍量95%的乙醇醇析得粗多糖沉淀。分別用85%、95%和無水乙醇、無水乙醚、丙酮洗滌，干燥后得粗多糖。

1.2.2多糖的初步鑒定及含量測定

本實驗采用蒽酮-硫酸法測定總的多糖含量。蒽酮-硫酸法是利用糖類在較高溫度下被濃硫酸脫水生成糖醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生有色物質(zhì)，反應(yīng)后溶液呈藍(lán)色，于620nm處有最大吸收。本實驗利用蒽酮-硫酸法制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線得出回歸方程，再測定待測樣品溶液的吸光度，代入回歸方程后計算出多糖含量。

1.2.3粗多糖蛋白質(zhì)除雜

本實驗采用Sevag法脫蛋白。Sevag法是利用蛋白質(zhì)遇有機溶劑變性而不溶于水的特點將其分離出去。將適當(dāng)濃縮的提取液加入到分液漏斗中按1/5的量加入sevag溶液（三氯甲烷：正丁醇=4：1）充分振蕩，靜止，分離直至無乳白色變性蛋白質(zhì)析出。但由于sevag液能破壞糖苷鍵，因此除蛋白次數(shù)不能過多。

2 結(jié)果與討論

2.1制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

將葡萄糖粉烘干，制成0.1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.00ml，0.15ml，0.3ml，0.45ml，0.60ml，0.75ml標(biāo)準(zhǔn)液于6只試管中，加蒸餾水至2ml，蒽酮試劑4ml，沸水浴10min.取出，在752N型紫外分光光度計上測定A620，回歸方程為Y=0.006X+0.0011，擬合系數(shù)R=0.9999。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

多糖提取率 = （X×125×W2/W3×1000×W 1）×100%

式中：X—從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得A620對應(yīng)之樣品的糖量（mg）

W1：稱取干樣品的質(zhì)量（g）

W2：由W1提取的粗多糖的質(zhì)量 （g）

W3：從W2中稱取的用于分析測定的粗多糖質(zhì)量 （g）

2.2 單因素對榛蘑可溶性多糖提取率的影響

2.2.1 料液比的影響

在溫度85℃和時間3小時不變的情況下采用料液比為1：15、1：20、1：25、1：30四個水平進(jìn)行實驗。其結(jié)果如圖2所示，多糖量隨料液比的增加而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1：25以后多糖的提取率基本不變。

2.2.2 溫度的影響

固定料液比1：25，提取時間3h，溫度采用85℃、90℃、95℃、100℃進(jìn)行試驗，溫度對多糖提取率的影響，如圖3所示，溫度對榛蘑多糖的提取率有顯著的影響，溫度的上升伴隨著多糖提取率的顯著上升，在100℃時提取率達(dá)到最大值。

2.2.3 時間的影響

在料液比為1：25、溫度100℃時，提取時間采用3h、4h、5h三個水平分別進(jìn)行實驗。改變時間對多糖的提取率的影響如圖4所示，隨著熱水浸提時間的增加榛蘑中多糖提取率也有所增加，但4h以后多糖提取率保持恒定不變。

2.3 熱水浸提榛蘑中可溶性多糖提取率的正交試驗

通過單因素實驗可知提取溫度是影響多糖提取率的最關(guān)鍵因素，其次是料液比，時間對多糖提取率的影響最小。在此基礎(chǔ)上選定三因素三水平進(jìn)行正交試驗。

2.3.1 正交試驗設(shè)計和結(jié)果的直觀分析

由上述正交表顯示：溫度是影響多糖提取率的最關(guān)鍵因素。榛蘑水提提取工藝最優(yōu)條件為A3B3C2，即料液比1：30，溫度100℃，浸提時間4h。在最佳提取工藝條件下，榛蘑多糖的提取率為3.28%。

2.4有關(guān)提取流程的其它討論

（1）樣品不能粉碎得太細(xì)，否則加熱攪拌后成胡狀很難過濾。

（2）一般的醇析方法是將乙醇倒入多糖溶液中攪拌靜止，而實驗采用的方法是將黃褐色的多糖濃縮液緩慢加入乙醇當(dāng)中，不攪拌靜止后多糖會緩慢上浮，容器底部留下深褐色的色素沉積物對脫色起到一定作用[9]。

（3）析出的粗多糖抽濾時在濾紙上墊一層細(xì)絲綢可減少多糖的損失。

3 結(jié)論

在熱水提取榛蘑可溶性多糖的過程中，溫度是影響多糖提取率的最關(guān)鍵因素。多糖提取的最佳工藝條件為料液比1：30，溫度100℃，浸提時間4小時，此時榛蘑多糖的提取率為3.28%。

通訊作者：黃學(xué)文

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金，項目編號2013MS0522.