爆炸致兔急性肺損傷時細胞凋亡作用機制的研究

齊曉林,吳　升,馬宏昊,黃奕江,葉長青,郝　建,賀慧博,李樹雯,李成恩,黃　鑫

?

·基礎醫(yī)學·

爆炸致兔急性肺損傷時細胞凋亡作用機制的研究

齊曉林1,吳升2,馬宏昊3,黃奕江1,葉長青1,郝建2,賀慧博2,李樹雯2,李成恩2,黃鑫2

[摘要]目的：探討細胞凋亡在爆炸致兔急性肺損傷(ALI)中的作用機制。方法：選取兔40只，隨機分為空白對照組10只；實驗組30只，空氣爆炸損傷胸部，制作ALI模型，分別于爆炸損傷4、12、24 h后采樣(每時間點各10只)，測定肺干/濕重比、動脈血氧分壓，原位末端標記檢測肺組織細胞凋亡情況，免疫組織化學法檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2含量。選取肺組織，顯微鏡觀察光鏡下肺組織病理形態(tài)。結果：光鏡下，實驗組4 h起可見肺間質、肺泡明顯水腫，肺泡腔大量紅細胞、炎性細胞及漿液性滲出，肺間質增厚。與對照組比較，各實驗組肺干/濕重比均明顯升高(P<0.01)，動脈血氧分壓均明顯降低(P<0.01)。凋亡指數(shù)均明顯升高(P<0.01)，Caspase-3與Bax/Bcl-2比值均較對照組升高(P<0.05～P<0.01)。結論：細胞凋亡在兔ALI的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，參與了肺組織損傷，促進ALI病情進展。

[關鍵詞]肺損傷；細胞凋亡；爆炸傷；血氣分析；兔

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)指機體遭受直接、間接損傷導致肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞受損，進而引起呼吸功能障礙的復雜病理過程。ALI治療不理想時，可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，國內每年ALI/ARDS病例20余萬例，其中爆炸傷致ALI/ARDS病例占據(jù)一定的比例。ALI發(fā)病機制比較復雜，死亡率高，對其作用機制的研究，可為臨床診治提供依據(jù)。研究[1]顯示凋亡機制參與了ALI的發(fā)病過程，ALI患者肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞凋亡增加，細胞數(shù)量減少，促進病情進展。本研究旨在通過檢測ALI兔模型血漿Caspase-3、Bax、Bcl-2含量，探討細胞凋亡在ALI中的作用機制。

1材料與方法

1.1材料實驗動物：40只健康新西蘭兔,雌雄各半，體質量(2.23±0.28)kg，由安徽長臨河醫(yī)藥科技有限公司提供，許可證號scxk(皖)2006-002。試劑與儀器：原位末端標記(TUNEL)使用Roche公司試劑盒，貨號11684817910，批號10279600；DAB顯色劑使用北京中杉公司產(chǎn)品，貨號ZLI-9018，批號K136821F。免疫組織化學試劑盒使用 Santa Cruz公司產(chǎn)品，Bax試劑盒貨號sc-493，批號G7514；Bcl-2試劑盒貨號SC-492，批號H5860；Caspase-3試劑盒貨號SC-7148，批號G2545。血氣分析儀使用美國OPTI公司CCA-TS型血氣分析儀。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組將40只新西蘭兔隨機分為空白對照組(A組)(n=10)、實驗組(n=30)；實驗組再根據(jù)爆炸損傷后采樣時間隨機分為B組(4 h)、C組(12 h)和D組(24 h)，每時間點各10只。

1.2.2模型建立使用中國科學技術大學研制的爆炸裝置，并按照爆炸力學相關公式及肺組織病理觀察結果設定合理爆炸劑量、距離。將兔固定于實驗裝置平臺上，暴露前胸及側胸壁，其余部位由自行設計的保護裝置進行防護。觀察呼吸頻率、心率，測血氧分壓及肺干/濕重比(W/D)，觀察肺組織病理形態(tài)學，建立爆炸致兔ALI模型。模型建立標準：動脈血氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)≤300 mmHg，測定W/D，觀察肺組織病理形態(tài)學，判斷肺損傷、肺水腫程度。

1.2.3標本采集水合氯醛(0.35 g/kg)耳緣靜脈麻醉實驗兔，采集頸外動脈血行血氣分析，頸內靜脈血4 ℃離心備用，同時處死實驗兔。結扎右側肺門，0.9%氯化鈉注射液10 mL反復3次灌洗左肺，灌洗液離心備用。取右肺中葉，吸干表面雜質，測W/D。右肺下葉經(jīng)0.9%氯化鈉注射液沖洗，10%甲醛固定。其余右肺葉迅速置于液氮中保存。

1.3觀察指標(1)肺組織病理組織學觀察：取右肺下葉組織10%甲醛固定，石蠟包埋，切片4～5 μm厚，HE染色，光鏡下觀察。(2)W/D：取右肺中葉，吸干表面雜質，天平稱取肺濕重后，置于80 ℃烘箱烘72 h至烘干，稱取干重，計算W/D。(3)動脈血氣分析：消毒頸外動脈，采動脈血2 mL，即刻行血氣分析。(4)肺組織細胞凋亡檢測：采用TUNEL法檢測，按試劑盒操作流程操作；DAB顯色，細胞核呈棕黃色為陽性；光學顯微鏡計數(shù)、分析。(5)肺組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達檢測：采用常規(guī)SABC法，按試劑盒推薦方法進行操作；DAB顯色，胞質染色呈棕黃色為蛋白表達陽性；采用灰度值計數(shù)相對含量。

1.4統(tǒng)計學方法采用方差分析和q檢驗。

2結果

2.1肺組織病理組織學觀察肉眼可見雙側肺體積增大、實變，表面散在大小不等瘀斑，部分組織切面可見紅色實樣變，泡沫樣滲出。光鏡下可見肺泡間隔增大，肺泡腔相對狹窄，正常肺泡結構被破壞，肺泡腔、肺間質水腫、滲出,部分可見出血，并伴有炎癥細胞浸潤(見圖1)。

2.24組兔W/D、 PaO2和組織細胞凋亡指數(shù)比較B、C和D組W/D和細胞凋亡指數(shù)均較A組明顯增加(P<0.01)，而PaO2均顯著低于A組(P<0.01)； D組和C組細胞凋亡指數(shù)均明顯高于B組(P<0.01)，而D組細胞凋亡指數(shù)則低于C組(P<0.05)(見表1)。

2.34組肺組織Caspase-3、Bax、Bcl-2表達及Bax/Bcl-2比較B、C和D組Caspase-3、Bax、Bcl-2表達及Bax/Bcl-2比值均較A組增高(P<0.05～P<0.01)，C組、D組Bax、Caspase-3和Bax/Bcl-2比值均高于B組(P<0.05～P<0.01)，而Bcl-2均低于B組(P<0.01和P<0.05)；D組Bax、Caspase-3和Bax/Bcl-2均低于C組(P<0.05～P<0.01)，而Bcl-2高于C組(P<0.05)(見表2)。

3討論

本實驗采用特殊防護裝置保護動物氣道，爆炸瞬間產(chǎn)生高能沖擊波及大量氣體，實驗通過控制爆炸沖擊波作為主要影響動物肺的損傷。動物肺部受到爆炸沖擊波作用，肺內壓力驟升，壓迫肺組織，產(chǎn)生嚴重肺挫裂傷，致肺泡腔、肺間質出血、水腫、滲出，W/D增高，通氣/血流比值失調；同時肺組織炎性滲出增多，細胞凋亡增加。本實驗結果顯示，與A組比較，實驗組光鏡下肺組織病理損傷明顯，PaO2明顯下降(P<0.01),W/D明顯升高(P<0.01)，說明造模成功。在成功造模后，在傷后的不同時間點取材，檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，在傷后4 h時Caspase-3、Bax、Bcl-2已有明顯改變，12 h時改變最明顯，24 h后表達有所降低。

表1　4組兔肺組織W/D、PaO2值和細胞凋亡指數(shù)比較

q檢驗：與A組比較**P<0.01；與B組比較△△P<0.01；與C組比較#P<0.05

q檢驗：與A組比較*P<0.05,**P<0.01； 與B組比較△P<0.05,△△P<0.01； 與C組比較#P<0.05,##P<0.01

細胞凋亡是生物體為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的自主程序性死亡。研究[1]表明，細胞凋亡參與ALI的過程，機制可能是：肺泡上皮細胞凋亡，數(shù)量減少，彌散功能下降，肺泡有效交換面積減少，影響通氣/血流比值；肺毛細血管內皮細胞凋亡，血管壁通透性增加，炎性滲出增多，肺間質出血、水腫，壓迫肺泡，引起肺泡腔狹窄，進一步影響通氣/血流比值，導致低氧血癥發(fā)生；支氣管上皮細胞凋亡增加則可能加重呼吸困難[2]。本研究實驗組早期病理切片即可見肺間隔增寬，肺泡腔狹窄，正常肺泡結構破壞，肺泡腔、肺間質嚴重水腫、滲出，并伴有炎性細胞浸潤。TUNEL法染色顯示，實驗組早期即發(fā)生凋亡，故認為凋亡在早期即參與了ALI的發(fā)生、發(fā)展過程，這與國外學者[3]研究結果一致。

研究[4]顯示，肺組織凋亡受Caspase、Bcl-2、Fas/FasL等家族的影響。誘導細胞凋亡實際上都是通過Caspase蛋白的次序激活實現(xiàn)的，其中Caspase-3參與了大多數(shù)的凋亡過程，是細胞凋亡效應劑，也是最為關鍵的執(zhí)行因子，在凋亡級聯(lián)激活中處于核心地位[5-6]。本實驗結果提示，實驗組損傷后肺組織Caspase-3 即有大量表達，且與肺細胞凋亡程度基本一致，結果與相關文獻[7]報道一致。

研究[8]發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族是Caspase-3的上游調控機制。Bcl-2家族的表達、調控在細胞凋亡的信號轉導過程中發(fā)揮著重要角色。Bcl-2、Bax分別是Bcl-2家族中抑制凋亡、促凋亡最具代表性因子。目前研究[8]發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族在受到信號刺激后，家族中相關促凋亡蛋白可發(fā)生構象改變，通過影響抑制凋亡/促凋亡蛋白平衡，最終影響凋亡進程。Bcl-2是體內重要的抗凋亡蛋白，其抗凋亡的機制主要是：(1)抑制凋亡蛋白酶Caspase，包括Caspase-3的激活；(2)直接抗氧化作用；(3)抑制具有促凋亡作用物質的釋放；(4)抑制促凋亡蛋白Bax[9]。而Bax是Bcl-2家族最廣泛的促凋亡蛋白[10]。目前認為Bax促凋亡的機制主要是：(1)影響細胞氧化還原作用；(2)改變線粒體膜滲透性，影響氧化磷酸化及ATP的合成；(3)激活Caspase信號轉導途徑，促進凋亡發(fā)生；(4)拮抗抗凋亡蛋白Bcl-2。大量研究[4，8-9]表明，Bax/Bcl-2的比值對細胞是否發(fā)生凋亡有重要意義。本實驗研究結果表明，實驗組Bax及Bax/Bcl-2比值變化與肺組織細胞凋亡情況基本一致。故認為爆炸損傷后激活兔肺組織凋亡程序，凋亡活性增強，抗凋亡活性受到抑制，從而誘導凋亡發(fā)生。

本實驗結果還顯示，實驗組通過Caspase-3、Bax表達增加，Bcl-2表達減少，從而影響B(tài)ax/Bcl-2比值。因此，推斷機體可能通過激活Caspase-3、Bax，抑制Bcl-2，從而促進凋亡發(fā)生。但本實驗結果提示，實驗D組凋亡細胞值較C組有所下降，伴隨Caspase-3、Bax部分降低及Bcl-2部分升高。其機制可能是：(1)ALI晚期病變程度較重，中性粒細胞(尤其是多型核中性粒細胞，其存活時間長短可影響損傷程度)凋亡減少，可加重炎癥損傷[11-12]；(2)在ALI疾病過程中，肺泡Ⅱ型細胞以凋亡的形式參與修復，而在ALI晚期，可見明顯Bcl-2上調，肺泡Ⅱ型細胞凋亡減少，修復作用減弱，加重損傷[13]；(3)在ALI晚期，機體的自身調控作用導致抗凋亡作用表達有所增加。本實驗結果顯示，細胞凋亡在ALI時表現(xiàn)為先增加后減低的趨勢，此前國內研究[14]也有相關報道。

鑒于本實驗血漿Caspase-3、Bax、Bcl-2在ALI早期即有明顯改變，且與損傷凋亡情況基本一致，因此，對于ALI，檢測以上指標對早期診斷、干預具有很好的指導意義，可以有效協(xié)助臨床進行肺損傷嚴重程度的評估。但ALI的病理機制十分復雜，影響因素較多，目前認識有限，因此凋亡致ALI的作用機制還需進一步研究。

[參考文獻]

[1]MATUTE-BELLO G,MARTIN TR.Science review:apoptosis in acute lung injury[J].Critical Care,2003,7(5):355.

[2]PERL M,LOMASNEIRA J,VENET F,etal.Pathogenesis of indirect (secondary) acute lung injury[J].Expert Rev Respir Med,2011,5(1):115.

[3]KUN-YOUNG K,JAE-HWI J,SUN-YOUNG K,etal.Cadmium induced acute lung injury and TUNEL expression of apoptosis in respiratory cells.[J].J Korean Med Sci,2003,18(5):655.

[4]余歡明,馮文明,王耀.δ阿片受體激動劑對膿毒癥大鼠肺組織細胞凋亡及肺組織Bcl-2、Caspase-3表達的影響[J].中國中西醫(yī)結合外科雜志,2010,16(5):561.

[5]MCILWAIN DR,BERGER T,MAK TW.Caspase functions in cell death and disease[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2013,5(4):a008656.

[6]DAMARLA M,PARNIANI AR,JOHNSTON L,etal.Mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2 mediates apoptosis during lung vascular permeability by regulating movement of cleaved caspase 3 [J].Am J Respir Cell Mol Biol,2013,50(5):932.

[7]CROSS LJ,MATTHAY MA.Biomarkers in acute lung injury:insights into the pathogenesis of acute lung injury[J].Crit Care Clin,2011,27(2):355.

[8]HARDWICK JM,SOANE L.Multiple functions of BCL-2 family proteins[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2013,5(2):a008722.

[9]LETAI A.Pharmacological manipulation of Bcl-2 family members to control cell death[J].J Clin Inves,2005,115(10):2648.

[10]FU H,WANG QS,LUO Q,etal.Simvastatin inhibits apoptosis of endothelial cells induced by sepsis through upregulating the expression of Bcl-2 and downregulating Bax[J].World J Emerg Med,2014,5(4):291.

[11]MA HJ，HUANG XL，LIU Y,etal.Sulfur dioxide attenuates LPS-induced acute lung injury via enhancing polymorphonuclear neutrophil apoptosis[J].Acta Pharmacol Sin,2012,33(8):983.

[12]肖敏,范紅,文富強,等.巨噬細胞炎癥蛋白-2和細胞凋亡在內毒素誘導急性肺損傷發(fā)病中的作用探討[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2007,17(11):1304.

[13]管弦,王導新.肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡在急性肺損傷中研究進展[J].臨床肺科雜志,2012,17(6):1101.

[14]王穎,張淑文,王寶恩.細胞凋亡在大鼠急性肺損傷發(fā)生機制中的意義[J].中國危重病急救醫(yī)學,2001,13(2):90.

(本文編輯姚仁斌)

The mechanism of cell apoptosis in rabbit with acute lung injury induced by blast

QI Xiao-lin1,WU Sheng2,MA Hong-hao3,HUANG Yi-jiang1,YE Chang-qing1,HAO Jian2,HE Hui-bo2,LI Shu-wen2,LI Cheng-en2,HUANG Xin2

(1.DepartmentofInternalMedicine,The123thHospitalofPLA,BengbuAnhui233010;2.HangzhouSanatoriumofPLA,HangzhouClinicalSchoolofAnhuiMedicalUniversityofPLA,DepartmentofCardiopulmonaryRehabilitationCenter,The128thHangzhouHospital,HangzhouZhejiang310007;3.DepartmentofModernMechanics,UniversityofScienceandTechnologyofChina,HefeiAnhui230026,China)

[Abstract]Objective:To investigate the mechanism of cells apoptosis in rabbit with acute lung injury(ALI) induced by blast.Methods:Forty rabbits were randomly divided into the control group(n=10) and experimental group(n=30).The ALI model of rabbit was established by air blast.After 4,12 and 24 hours of lung injury,the cells apoptosis of injury tissue were detected using the wet/dry weight ratio(W/D) of lung,PaO2 and TUNEL,the levels of caspase-3,Bax and Bcl-2 were detected using immunohistochemistry and the pathological morphology were observed under microscopy in 10 rabbits each time-point.Results:The pulmonary interstitial and alveolar edema，a large number of red blood cells,inflammatory cells and serous effusion in alveolar space,and pulmonary interstitial thickening were found in experimental group under light microscope.Compared with the control group,the W/D and PaO2 in experimental group increased and decreased significantly,respectively(P<0.01),The apoptosis index,caspase-3 and Bax/Bcl-2 in experimental group were significantly higher than those in control group(P<0.05 to P<0.01).Conclusions:Apoptosis plays an important role in the occurrence and development of ALI,which is involved in lung tissue injury and promoting the development of ALI.

[Key words]lung injury;apoptosis;burst injury;blood gas analysis;rabbit

[中圖法分類號]R 563.9

[文獻標志碼]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.02.005

[作者簡介]齊曉林(1971-)，男，碩士研究生，主任醫(yī)師.[通信作者] 郝建，博士研究生導師,主任醫(yī)師，教授.E-mail:jianhao105@163.com

[基金項目]南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生重點課題(14ZD41)

[收稿日期]2016-01-21

[文章編號]1000-2200(2016)02-0155-04

[作者單位] 1.解放軍第一二三醫(yī)院 內科，安徽 蚌埠 233010；2.南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院,安徽醫(yī)科大學解放軍杭州臨床學院,杭州一二八醫(yī)院 心肺康復醫(yī)學中心，浙江 杭州 310007；3.中國科學技術大學 近代力學系,安徽 合肥 230026