法舒地爾對壓力超負荷大鼠左心室肥厚的改善作用

蔡　輝，張蓓蓓，張　靜，趙智明，趙凌杰，郭郡浩

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·基礎醫(yī)學·

法舒地爾對壓力超負荷大鼠左心室肥厚的改善作用

蔡輝，張蓓蓓，張靜，趙智明，趙凌杰，郭郡浩

[摘要]目的：探討法舒地爾對壓力超負荷大鼠左心室肥厚的影響及可能的作用機制。方法：42只6周齡SD大鼠行腹主動脈縮窄術制備壓力超負荷模型作為手術組，另取8只大鼠作為假手術組(Sham組)。術后4周將存活的28只腹主動脈縮窄大鼠隨機分為模型組(Model組)、法舒地爾高劑量組(FH組)和法舒地爾低劑量組(FL組)。4周后，計算各組大鼠左心室質量指數(LVMI)，觀察心肌病理改變，檢測心肌細胞直徑(MD)，堿水法測定心肌羥脯氨酸(HYP)含量，酶聯免疫吸附試驗測定血漿和心肌血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)濃度，免疫組織化學法半定量分析心肌磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶蛋白亞基1(p-MYPT1)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)和組織金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP1)的表達水平。結果：與Sham組比較，Model組心肌細胞肥大，間質大量膠原沉積，LVMI、MD、HYP含量和AngⅡ濃度均明顯升高，p-MYPT1、MMP9和TIMP1的表達顯著上調，MMP9/TIMP1比值明顯下降(P<0.01)；與Model組比較，FH組和FL組心肌細胞肥大和膠原沉積有所改善，LVMI、MD、HYP和AngⅡ含量均下降(P<0.05～P<0.01)，p-MYPT1、MMP9和TIMP1的表達均明顯下調(P<0.01)。結論：法舒地爾改善壓力超負荷大鼠左心室肥厚的作用可能與調節(jié)心肌MMP9和TIMP1表達有關。

[關鍵詞]左心室肥厚；法舒地爾；壓力超負荷；大鼠

左心室肥厚是高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心臟病等心血管疾病的常見病理改變，是心臟對急/慢性血流動力學超負荷和以腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)為代表的神經內分泌因素的一種適應性反應，也是充血性心力衰竭和復雜室性心律失常等發(fā)生的獨立危險因素。Rho激酶是小G蛋白Rho的主要下游因子，能調控細胞增殖、遷移、收縮、黏附、分裂和基因表達等行為。Rho激酶活性在許多心血管疾病中均有所增加，而抑制Rho/Rho激酶信號途徑有益于改善患者心臟功能[1-2]。目前關于Rho激酶特異性抑制劑法舒地爾對左心室肥厚作用的報道較少，本實驗旨在探究法舒地爾對壓力超負荷模型大鼠左心室肥厚的作用及可能的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物清潔級6周齡雄性SD大鼠50只，體質量(180±20)g[許可證號：SYXK(蘇)2003-0032]，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動物實驗中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25 ℃，相對濕度40%～60%，周期光照時間為8:00～20:00，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水。

1.2藥品與主要試劑鹽酸法舒地爾注射液(規(guī)格：2 mL，30 mg)由天津紅日藥業(yè)股份有限公司惠贈，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自上海雅吉生物公司，磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶蛋白亞基1(p-MYPT1)一抗購自北京博奧森生物公司，基質金屬蛋白酶9(MMP9)、組織金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)、辣根過氧化酶標記的IgG二抗、DAB 顯色劑、EliVision plus免疫組織化學試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1左心室肥厚模型制備大鼠適應性喂養(yǎng)5 d后，術前禁食12 h，自由飲水。編號后按照隨機數字表法抽取8只作為假手術組(Sham組)，另42只作為手術組。所有大鼠用10 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)行腹腔注射麻醉。常規(guī)備皮消毒后，于劍突下沿腹正中線逐層開腹，在腎動脈上方分離腹主動脈。手術組在腎動脈上方0.5 cm處用直徑0.7 mm銀夾夾閉，使腹主動脈縮窄60%～70%，而Sham組不夾閉腹主動脈。確認無出血，將臟器復位后逐層關閉腹腔。術后禁食6 h，并給予青霉素10萬U·kg-1·d-1肌內注射3 d預防感染。

1.3.2分組及藥物干預手術4周后，42只手術組大鼠死亡14只，8只Sham組大鼠無死亡。將手術組大鼠存活的28只按照隨機數字表法分為Model組(n=10)、FH組(n=9)和FL組(n=9)。Model組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2 mL·kg-1·d-1；FH組腹腔注射鹽酸法舒地爾注射液30 mg·kg-1·d-1；FL組腹腔注射鹽酸法舒地爾注射液10 mg·kg-1·d-1；Sham組腹腔注射0.9 %氯化鈉注射液 2 mL·kg-1·d-1。

1.3.3標本采集及左心室質量指數(LVMI)檢測藥物干預4周后，Model組大鼠死亡3只，FH組和FL組大鼠各死亡1只，死亡原因均為嚴重心力衰竭，而Sham組無死亡。將最終存活的31只大鼠稱質量(BM)后，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉完全后打開胸腔，暴露心臟。心臟穿刺收集血液5～10 mL。剪取心臟，洗凈后除去心房及大血管，稱取心臟質量(HM)，再剪去右心室游離壁保留左心室及室間隔，稱取左心室質量(LVM)。計算心臟質量指數(HMI=HM/BM)和左心室質量指數(LVMI=LVM/BM)。透壁剪取左心室心尖部分組織投入液氮中，其余標本放于4 ℃的4%多聚甲醛溶液中固定。血液以3 000 r/min離心10 min，取上清液存放于-80 ℃冰箱待用。

1.3.4左心室肌病理學分析心肌標本于甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋，沿左心室長軸線每隔1 mm橫斷面切取數張4 μm切片，作HE和Masson染色。400倍光鏡下觀察組織形態(tài)，每個HE標本隨機取5個視野，每個視野選10個心肌細胞，采用專業(yè)圖片分析軟件Image-Pro Plus 6.0計算心肌細胞直徑(MD)。

1.3.5心肌羥脯氨酸(HYP)含量測定HYP幾乎只存在于膠原蛋白，其含量能反應心肌膠原的水平。準確稱取60 mg液氮中心肌組織放入試管中，按照HYP試劑盒說明書以堿水解法提取蛋白，比色法檢測樣本吸光度 ，計算 HYP 含量。

1.3.6酶聯免疫吸附試驗測定心臟和血漿AngⅡ的含量取凍存的心肌組織50～100 mg，研磨成勻漿后離心，以3 000 r/min離心10 min。取上清液，測定總蛋白濃度。按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書，分別測定心肌組織和血漿樣品中AngⅡ的濃度。結果以測定蛋白濃度/總蛋白濃度的比值來表示。

1.3.7免疫組織化學法檢測心肌p-MYPT1、MMP9及TIMP1的表達切片烘烤后，常規(guī)二甲苯脫蠟及乙醇梯度脫水，枸櫞酸鹽抗原修復緩沖液中進行抗原修復。滅活過氧化物酶，加入一抗孵育過夜，加入HRP標記二抗，DAB顯色，蘇木精復染，脫水并封片。光鏡下觀察組織細胞中蛋白的表達情況，細胞質中黃色為陽性，每張切片隨機取5個視野拍照。 用Image-Pro Plus 6.0測量區(qū)域的平均吸光度(MOD)，即陽性累積吸光度/照片總面積。

1.4統(tǒng)計學方法采用方差分析和q檢驗。

2結果

2.14組大鼠病理學檢查結果與Sham組比較，Model組心肌細胞明顯肥大增寬，心肌纖維排列紊亂，間質和血管周圍大量藍色膠原沉積，肌束間隙呈不同程度增大，FH組心肌細胞增粗、紊亂明顯改善，接近Sham組，FL組心肌細胞增粗、紊亂，間質和血管周圍膠原沉積，但較Model組減輕(見圖1)。

2.24組大鼠左心室肥厚程度比較與Sham組比較，Model組大鼠HMI、LVMI、MD和HYP含量均顯著升高(P<0.01)。與Model組比較，FH組和FL組大鼠HMI、LVMI、MD及HYP含量均有不同程度降低(P<0.05～P<0.01)(見表1)。

表1　4組大鼠HMI、LVMI和MD水平比較

q檢驗：與Sham組比較 **P<0.01；與Model組比較 #P<0.05，##P<0.01

2.34組大鼠心肌組織和血漿AngⅡ含量比較與Sham組比較，Model組大鼠心肌組織和血漿AngⅡ含量均明顯升高(P<0.01)。與Model組比較，FH組和FL組大鼠心肌組織和血漿AngⅡ含量均明顯降低(P<0.01)(見表2)。

2.4各組大鼠心肌組織p-MYTP1、MMP9和TIMP1水平比較與Sham組比較，Model組大鼠心肌p-MYPT1、MMP9和TIMP1的表達均明顯升高(P<0.01)，MMP9/TIMP1比值顯著下降(P<0.01)；與Model組比較，FH組p-MYPT1、MMP9和TIMP1及FL組p-MYPT1與TIMP1的表達均明顯下降(P<0.01)，而FL組MMP9和FH組及FL組MMP9/TIMP1比值與Model組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3)。

表2　4組大鼠心肌和血漿AngⅡ含量比較±s)

q檢驗：與Sham組比較 **P<0.01；與Model組比較 ##P<0.01

表3　4組大鼠心肌免疫組織化學染色半定量結果比較±s)

q檢驗：與Sham組比較 **P<0.01；與Model組比較 ##P<0.01

3討論

心肌細胞肥大和心肌間質纖維化是心室肥厚重要的病理學基礎，可影響心肌細胞的舒縮功能和電傳導性，導致心力衰竭、心律失常及心臟性猝死。Rho/Rho激酶信號通路參與心室肥厚的形成。Rho激酶單體2在肺動脈縮窄小鼠肥厚右心室和腹主動脈縮窄肥厚左心室的表達均顯著升高[3]。伴有左心室肥厚的高血壓患者血漿中p-MYPT1的水平(即Rho激酶活性)較無左心室肥厚的高血壓患者增加了2倍，而在離心性左心室肥厚時更高[4]。Rho激酶單體1基因敲除對病理性代償性肥厚的心肌細胞凋亡和心力衰竭有明顯改善作用[5]。

本實驗采用腹主動脈縮窄法制備壓力超負荷模型，除了通過升高血壓，增加左心室射血阻力外，還通過減少腎臟血流，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，引起手術組大鼠左心室肥厚。AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)最重要的效應因子，能直接活化心肌細胞和心臟成纖維細胞(CFB)引起心室肥厚。手術8周后，大鼠LVMI和MD顯著增加，心肌間質大量膠原沉積，心肌和血漿AngⅡ水平明顯升高，說明左心室肥厚模型已經建立。并且，模型大鼠心肌組織Rho激酶活性較Sham組明顯升高，法舒地爾能改善腹主動脈縮窄大鼠心肌細胞肥大和間質纖維化，與文獻[6]報道一致。

心臟受到壓力超負荷、氧化應激和缺血缺氧等刺激時，過度激活神經內分泌及細胞因子，心肌細胞發(fā)生自噬、凋亡或壞死而丟失。細胞外基質正常的網狀結構在MMPs的作用下遭到破壞，CFB活化和遷移，并通過分化為肌成纖維細胞(MFB)加強合成膠原纖維的能力，以修復組織損傷。MFB持續(xù)存在使心肌間質膠原容積/成分改變，且排列紊亂。同時，殘余心肌細胞肥大以暫時維持心臟功能。在此過程中，Rho激酶介導的細胞骨架重組既是CFB遷移和MFB分化的主要動力[7]，也是促進心肌細胞肥大的關鍵。Rho激酶可能通過激活ERK1/2和p38 絲裂原活化蛋白激酶信號通路，誘導心肌細胞肥大[3,8]。

另外，本實驗發(fā)現法舒地爾在降低AngⅡ水平的同時，還能降低心肌MMP9和TIMP1的表達。MMP9在心肌肥厚中具有重要作用[9-10]。TIMP1一方面可與MMP9酶原結合延緩后者的活化，另一方面，可與活性MMP9以1∶1比例共價結合形成不可逆復合物，阻斷MMP9與底物結合，從而減少膠原的降解。MMP9/TIMP1比值降低是間質膠原過度沉積的重要因素。FRANZ等[11]研究發(fā)現，高血壓左心室肥厚患者血清MMP9、TIMP1較正常人明顯升高，且離心性肥厚組MMP9水平較向心性肥厚組患者低，但2組TIMP1水平并無顯著差別。從無心血管疾病臨床依據的志愿者獲得的幾組數據顯示，隨年齡增長，血漿MMP9水平呈下降趨勢，而TIMP1水平呈上升趨勢，MMPs和TIMP1的改變與左心室向心性肥厚和左心室舒張功能障礙相關[12]，這或許能部分解釋MMP9、TIMP1水平在不同研究中相悖的原因。

綜上所述，Rho激酶活性在壓力超負荷左心室肥厚模型大鼠心肌明顯升高，法舒地爾改善腹主動脈縮窄大鼠左心室肥厚的作用與降低心肌MMP9和TIMP1表達有關。

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(本文編輯馬啟)

Protective effect of fasudil against left ventricular hypertrophy in rats with pressure overload

CAI Hui，ZHANG Bei-bei,ZHANG Jing,ZHAO Zhi-ming,ZHAO Ling-jie,GUO Jun-hao

(DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA，NanjingJiangsu210002,China)

[Abstract]Objective:To investigate the effects of fasudil on left ventricular hypertrophy in rats with pressure overload,and its possible mechanism.Methods:Pressure overload model in 42 male 6-week-old SD rats were established by abdominal aorta constriction,and divided into the operation group.Eight healthy rats were set as sham group.Twenty-eight survival abdominal aorta constriction rats after 4 weeks of operation were randomly divided into the model group,high dose fasudil group(FH group) and low dose fasudil group(FL group).After four weeks of drug intervention,the left ventricular mass indexes(LVMI) of all groups were calculated.The myocardial pathological changes were observed.The myocyte diameters(MD) were detected.Myocardial hydroxyproline(HYP) contents were determinated by alkali hydrolysis.Plasma and myocardial AngⅡ concentrations were detected by enzyme linked immunosorbent assay.Myocardial expression levels of phosphorylated myosin phosphatase targeting protein subunit 1(p-MYPT1),matrix metalloproteinase 9(MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP1) were analyzed by immunohistochemical staining.Results:Compared with the sham group,myocardial cells hypertrophy and collagen deposition in myocardial interstitium were found,the levels of LVMI,MD,HYP,AngⅡ,p-MYPT1,MMP9 and TIMP1 increased significantly,and the ratio of MMP9/TIMP1 decreased significantly in model group(P<0.01).Compared with the model group,myocardial cells hypertrophy and collagen deposition were improved,and the levels of LVMI,MD,HYP,Ang Ⅱ,p-MYPT1,MMP9,TIMP1 decreased significantly in FH group and FL group(P<0.05 to P<0.01).Conclusions:Fasudil improving left ventricular hypertrophy in pressure overload rats maybe related to the regulating myocardial MMP9 and TIMP1 expression levels

[Key words]left ventricular hypertrophy;fasudil;pressure overload;rat

[中圖法分類號]R 541

[文獻標志碼]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.02.003

[作者簡介]蔡輝(1959-)，男，博士研究生導師，主任醫(yī)師，教授.

[基金項目]南京軍區(qū)南京總醫(yī)院科研項目(2014016)

[收稿日期]2015-01-07

[文章編號]1000-2200(2016)02-0148-04

[作者單位] 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 中西醫(yī)結合科，江蘇 南京 210002