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    血清磷酸化高分子量神經(jīng)微絲蛋白與大鼠脊髓損傷程度的相關(guān)性①

    2016-04-25 03:53:12何件根李建軍楊明亮楊德剛
    關(guān)鍵詞:脊髓損傷

    何件根,李建軍,楊明亮,武 亮,楊德剛

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    血清磷酸化高分子量神經(jīng)微絲蛋白與大鼠脊髓損傷程度的相關(guān)性①

    何件根1,李建軍2,3,楊明亮2,3,武亮2,3,楊德剛2,3

    [摘要]目的研究血清磷酸化高分子量神經(jīng)微絲蛋白(pNF-H)在脊髓損傷動(dòng)物模型中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及其與脊髓損傷程度的相關(guān)性。方法20只Sprague-Dawley大鼠等分為空白對(duì)照(A)組及脊髓損傷輕(B)、中(C)、重(D)度組,檢測(cè)大鼠血清pNF-H水平、BBB評(píng)分及殘存白質(zhì)面積百分比。結(jié)果B、C、D組大鼠血清pNF-H在術(shù)后12 h及3 d出現(xiàn)兩個(gè)高峰;3組間有顯著性差異(P<0.05);損傷后3 d血清pNF-H水平與14 d時(shí)BBB評(píng)分、殘存白質(zhì)面積百分比呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.987,r=-0.978)。結(jié)論脊髓損傷后大鼠血清pNF-H水平存在雙峰現(xiàn)象;脊髓損傷程度越重,大鼠pNF-H水平越高;pNF-H水平可以預(yù)測(cè)脊髓損傷嚴(yán)重程度。

    [關(guān)鍵詞]脊髓損傷;神經(jīng)微絲蛋白;分子生物學(xué)評(píng)估;大鼠

    [本文著錄格式]何件根,李建軍,楊明亮,等.血清磷酸化高分子量神經(jīng)微絲蛋白與大鼠脊髓損傷程度的相關(guān)性[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2016,22(3):274-277.

    CITED AS:He JG,Li JJ,Yang ML,et al.Correlation between serum phosphorylated high-molecular-weight neurofilament and severity of spinal cord injury in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(3):274-277.

    作者單位:1.北京小湯山醫(yī)院,北京市102211;2.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院,北京市100068;3.中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛(ài)醫(yī)院,北京市100068。作者簡(jiǎn)介:何件根(1985-),男,漢族,江西吉安市人,碩士研究生,主要研究方向:脊髓損傷康復(fù)。通訊作者:李建軍(1962-),男,漢族,山東威海市人,教授,博士生導(dǎo)師,主要研究方向:脊柱脊髓損傷臨床治療與康復(fù)、康復(fù)管理。E-mail:crrc100@163.com。

    脊髓損傷導(dǎo)致的感覺(jué)功能及運(yùn)動(dòng)功能缺失,不僅由原發(fā)性損傷引起,各種原因引起的繼發(fā)性損傷也會(huì)導(dǎo)致脊髓神經(jīng)功能進(jìn)一步缺失,包括炎癥反應(yīng)、缺氧及毒素等導(dǎo)致的遲發(fā)型神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、軸突退化等[1-2]。人們一致認(rèn)為應(yīng)該在脊髓損傷早期進(jìn)行治療干預(yù)[3-4]。但脊髓損傷早期的治療效果很難評(píng)價(jià)。脊髓損傷的基礎(chǔ)嚴(yán)重程度很難評(píng)估,主要是因?yàn)榧顾栊菘似诘拇嬖赱5-6]以及其他因素。分子標(biāo)記物作為微觀水平的標(biāo)記物,因樣本采集方便、可實(shí)時(shí)追蹤等優(yōu)勢(shì),在脊髓損傷的研究中逐漸受到重視,其中磷酸化高分子量神經(jīng)微絲蛋白(phosphorylated high-molecular-weight neurofilament,pNF-H)因其特異性及穩(wěn)定性相對(duì)較好,近年出現(xiàn)將其應(yīng)用于脊髓損傷方面的研究。Shaw等在大鼠T11打擊模型及脊髓橫斷模型上發(fā)現(xiàn),大鼠血清pNF-H存在雙峰現(xiàn)象[7];Ueno等行大鼠脊髓損傷后四環(huán)素注射實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示四環(huán)素組pNF-H水平較對(duì)照組低[8]。Hayakawa等將pNF-H水平與神經(jīng)功能ASIA分級(jí)進(jìn)行比較,指出血清pNF-H與脊髓損傷嚴(yán)重程度存在一定程度相似[9]。本研究探討脊髓損傷大鼠血清pNF-H與脊髓損傷嚴(yán)重程度的關(guān)系。

    1料材與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    清潔級(jí)成年雌性Sprague-Dawley大鼠20只,軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體質(zhì)量(220±10)g。分為A、B、C、D 4組,每組5只。

    1.2模型制作

    大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周,觀察無(wú)異常進(jìn)行造模。固定大鼠,10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉,以T10棘突為中心,切口大小(2.25±0.25)cm,逐層暴露棘突;行T10椎板全切,暴露硬脊膜。A組直接縫合切口。B、C、D組分別用NYU打擊器打擊脊髓,打擊桿質(zhì)量10 g,打擊桿高度依次為12.5 cm、25 cm、50 cm[10-11]。止血,縫合切口,消毒并鋪干凈紗布。將大鼠置于(23±2)℃室溫單籠飼養(yǎng),不限制飲水飲食,人工輔助排尿、排便,每天3次,直至大鼠能夠自行排尿便。

    1.3 pNF-H檢測(cè)

    分別于術(shù)后15 min、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d尾靜脈采血,LG15-W高速微量離心機(jī)室溫下12000 r/min離心5 min,上清液滴入0.5 ml清潔離心管,-80℃保存。酶聯(lián)接免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)測(cè)定pNFH水平。

    1.4行為學(xué)評(píng)分

    分別于術(shù)后2 d、7 d、14 d行BBB評(píng)分。在安靜、自然狀態(tài)下進(jìn)行,持續(xù)觀察大鼠運(yùn)動(dòng)情況5 min。評(píng)定者對(duì)大鼠分組情況不知情。

    1.5組織病理學(xué)觀察

    術(shù)后14 d固定大鼠,10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉,打開(kāi)胸腔,切口(2.00±0.25)cm,通過(guò)心尖依次行生理鹽水及福爾馬林全身灌注,待大鼠僵硬后行T10后路開(kāi)窗,方法同造模。以損傷點(diǎn)為中心獲取脊髓標(biāo)本,長(zhǎng)(2.50±0.25)cm。石蠟包埋,切片機(jī)厚4 μm連續(xù)切片。選取脊髓損傷中心3張切片行Luxol Fast Blue(LFB)染色;光鏡下觀察并攝片,采用Image Pro Plus(IPP)6.0軟件進(jìn)行圖像處理,計(jì)算殘存白質(zhì)面積百分比:

    1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間pNF-H濃度行重復(fù)測(cè)量方差分析,各組大鼠術(shù)后3 d血清pNF-H水平與術(shù)后14 d BBB評(píng)分、殘存白質(zhì)面積百分比行線性相關(guān)分析。顯著性水平α=0.05。

    2結(jié)果

    2.1 pNF-H

    A組pNF-H持續(xù)處于0水平,B、C、D組pNF-H均出現(xiàn)基本一致的雙峰現(xiàn)象,第1次峰值出現(xiàn)于術(shù)后12 h左右,第2次峰值出現(xiàn)于術(shù)后3 d左右,隨后持續(xù)降低。各組間血清pNF-H濃度有顯著性差異(F= 93.590,P<0.05)。

    圖1 各組大鼠血清pNF-H動(dòng)態(tài)變化曲線

    2.2 BBB評(píng)分

    組內(nèi)比較,不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)分存在顯著性差異(P= 0.04);組間比較,各組間術(shù)后2 d無(wú)顯著性差異(P= 0.072),術(shù)后7 d及14 d有顯著性差異(P=0.01、P= 0.03)。見(jiàn)圖2。

    圖2 各大鼠BBB評(píng)分動(dòng)態(tài)變化曲線

    2.3殘存白質(zhì)面積

    大體形態(tài)學(xué)觀察,A組脊髓形態(tài)正常,中央灰質(zhì)區(qū)完整,外周白質(zhì)區(qū)域染色均勻;B、C、D組中央灰質(zhì)均存在不同面積的空洞,外周白質(zhì)出現(xiàn)不同數(shù)量點(diǎn)狀空洞,D組白質(zhì)區(qū)出現(xiàn)大片空洞。A、B、C、D組殘存白質(zhì)面積百分比分別為100%、(26.68±4.05)%、(10.98±3.96)%、(2.66±2.02)%,有顯著性差異(P<0.05)。

    2.4相關(guān)性分析

    術(shù)后3 d血清pNF-H濃度與術(shù)后14 d BBB評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.987),與大鼠脊髓殘存白質(zhì)面積百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.978)。

    3討論

    pNF-H是一種在神經(jīng)軸突中含量高、穩(wěn)定性強(qiáng)、神經(jīng)組織特異性強(qiáng)的高分子蛋白質(zhì)[7,12],在腦卒中、腦外傷、脊髓側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化等中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突損傷性疾病的評(píng)價(jià)研究中取得很好的成果[13-16]。脊髓損傷為中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突損傷性疾病,目前僅有少數(shù)關(guān)于pNF-H與脊髓損傷關(guān)系的報(bào)道[17-18]。

    本研究顯示,大鼠脊髓損傷后,血清pNF-H濃度隨時(shí)間的變化曲線存在雙峰現(xiàn)象,此雙峰現(xiàn)象在不同程度脊髓損傷組間一致,兩次峰值分別出現(xiàn)在脊髓損傷后12 h及3 d。Shaw等報(bào)道大鼠脊髓損傷后血清pNF-H峰值分別出現(xiàn)在術(shù)后16 d和3 d[7]。首個(gè)峰值出現(xiàn)時(shí)間不一致考慮為采血點(diǎn)不同,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)在脊髓損傷后24 h內(nèi)采血點(diǎn)均較少,需要增加采血時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步研究。

    對(duì)于雙峰現(xiàn)象可能的解釋如下。

    研究證實(shí),創(chuàng)傷性脊髓損傷的病理生理機(jī)制包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[1-2],本研究中NYU打擊器所致的鈍挫傷即為原發(fā)性損傷;繼發(fā)性損傷是指外力所造成的脊髓水腫、椎管內(nèi)小血管出血形成血腫,壓縮性骨折以及破碎的椎間盤(pán)組織等形成脊髓壓迫所造成的脊髓的進(jìn)一步損害,損傷機(jī)制主要有微循環(huán)障礙、脊髓低灌注、內(nèi)源性有害物質(zhì)的產(chǎn)生等[19];當(dāng)大鼠脊髓遭受打擊后并出現(xiàn)軸索損傷時(shí),因?yàn)檠顾杵琳系拇嬖赱20],pNF-H并不能立即大量釋放入血,只能在血脊髓屏障逐漸被破壞后入血,即pNF-H第1個(gè)峰值。當(dāng)原發(fā)性損傷所致的pNF-H大量釋放入血清而繼發(fā)性損傷尚不嚴(yán)重時(shí),血清pNF-H逐漸被降解,即出現(xiàn)所測(cè)血清pNF-H濃度輕微下降。有研究表明,脊髓損傷后2~3 d時(shí)水腫最嚴(yán)重[21],這種繼發(fā)性損傷導(dǎo)致軸突大量被破壞,血清pNF-H達(dá)到第2次高峰,之后pNF-H被降解。

    另有研究表明,脊髓灰質(zhì)的破壞在脊髓損傷后24 h內(nèi)達(dá)高峰,而白質(zhì)的破壞一直持續(xù)到脊髓損傷后1周[22],灰質(zhì)破壞時(shí)釋放的pNF-H較少,導(dǎo)致第1個(gè)高峰,2~3 d時(shí)軸突廣泛破壞,導(dǎo)致大量pNF-H釋放入血清,導(dǎo)致第2個(gè)高峰值。

    目前支持這兩種解釋的文獻(xiàn)均不少,也可以兩種原因同時(shí)導(dǎo)致此雙峰現(xiàn)象。

    NYU打擊器打擊是目前國(guó)際上通用的標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物脊髓損傷造模方法之一。可通過(guò)調(diào)節(jié)撞擊桿高度控制嚙齒類(lèi)動(dòng)物脊髓損傷程度。本研究顯示,血清pNF-H濃度在所有時(shí)間點(diǎn)均為重度損傷>中度損傷>輕度損傷。BBB評(píng)分及殘存白質(zhì)面積百分比等得到證實(shí),評(píng)估脊髓損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)。

    本研究中,術(shù)后24 h、2 d及2周時(shí)血清pNF-H濃度差異未達(dá)到差異性。脊髓損傷后2周,血清pNF-H濃度已經(jīng)接近基線水平,已經(jīng)接近檢測(cè)儀的可靠極限,參考價(jià)值較差;而在24 h、2 d時(shí)無(wú)顯著性差異的原因,有待進(jìn)一步研究。

    脊髓損傷的評(píng)價(jià)方法主要有神經(jīng)功能學(xué)評(píng)價(jià)、影像學(xué)評(píng)價(jià)、神經(jīng)電生理檢查、組織形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)等[17-18]。神經(jīng)功能學(xué)評(píng)價(jià)方法,在臨床中應(yīng)用最廣泛的為ASIA評(píng)價(jià)方法[23],在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的主要為BBB評(píng)分,但它們?cè)诩顾栊菘似诓⒉荒苷鎸?shí)反映脊髓的神經(jīng)功能狀況[24-25]。MRI被認(rèn)為是脊髓損傷診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但在超急性期,MRI不能良好顯示脊髓的損傷狀況;早期患者不宜于大幅度移動(dòng)也限制了MRI在脊髓損傷方面的應(yīng)用;一些體內(nèi)存在磁性金屬物質(zhì)如槍傷的患者不適于行MRI檢查[26-27]。神經(jīng)電生理檢查主要包括體感誘發(fā)電位、動(dòng)作誘發(fā)電位、肌電圖等,操作較簡(jiǎn)單,但是干擾因素太多,且動(dòng)作誘發(fā)電位在脊髓損傷休克期也不能做出評(píng)估,且無(wú)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[18]。組織形態(tài)學(xué)[28]廣泛應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,但臨床無(wú)法應(yīng)用。

    目前研究的分子標(biāo)記物主要有小分子量的鈣結(jié)合蛋白S100、神經(jīng)元特異性烯醇酶(neuron-specific enolase,NSE)及神經(jīng)微絲蛋白(NF)。Anderson等研究顯示,S100及NSE不僅存在于神經(jīng)細(xì)胞中,在其他非神經(jīng)細(xì)胞中也能檢測(cè)到[13]。Marquardt等[29-30]、Cao等[31]發(fā)現(xiàn),血清中S100及NSE在脊髓損傷后6 h達(dá)高峰,24 h降至基線水平,這是因?yàn)镾100及NSE穩(wěn)定性較差,容易被蛋白酶水解。NF只存在于神經(jīng)細(xì)胞中,特異性強(qiáng),且有很強(qiáng)的抗酶解能力,特別是pNF抗酶解能力更強(qiáng)。NF存在3種亞結(jié)構(gòu),分別為低分子量的神經(jīng)微絲蛋白(NF-L)、中分子量的神經(jīng)微絲蛋白(NF-M)以及高分子量的神經(jīng)微絲蛋白(NF-H),在神經(jīng)細(xì)胞的分子標(biāo)記物中,NF-H含量最高,NF-L、NF-M及其他分子標(biāo)記物含量均較低,pNF-H是評(píng)價(jià)脊髓損傷很有前景的一項(xiàng)指標(biāo)。

    本研究首次對(duì)pNF-H與脊髓損傷程度關(guān)系進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。雖然本研究樣本量有其他實(shí)驗(yàn)參照,但更大樣本量可靠性更高;本研究觀察時(shí)間只有14 d,后肢功能尚不能完全反映最終的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況,所以設(shè)計(jì)了組織病理學(xué)研究加以彌補(bǔ)。pNF-H穩(wěn)定性較強(qiáng),其在體內(nèi)的降解時(shí)間尚無(wú)研究闡述,脊髓損傷高峰是否與血清pNF-H高峰一致尚待更多研究證實(shí)。

    血清pNF-H是一項(xiàng)有潛力的評(píng)估脊髓損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo),雖然目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)均開(kāi)展得較少,但血清pNF-H自身的優(yōu)勢(shì)必將吸引更多的研究。

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    Correlation between Serum Phosphorylated High-molecular-weight Neurofilament and Severity of Spinal Cord Injury in Rats

    HE Jian-gen1,LI Jian-jun2,3,YANG Ming-liang2,3,WU Liang2,3,YANG De-gang2,3
    1.Beijing Xiaotangshan Hospital,Beijing 102211,China;2.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China;3.Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Centre,Beijing 100068,China

    Correspondence to LI Jian-jun.E-mail:crrc100@163.com

    Abstract:Objective To investigate the level of phosphorylated high-molecular-weight neurofilament(pNF-H)after spinal cord injury(SCI),and explore the relationship between pNF-H and severity of SCI.Methods 20 Sprague-Dawley rats were equally divided into control group(group A),mild SCI group(group B),moderate SCI group(group C)and severe SCI group(group D).The level of pNF-H in serum,BBB score and remaining area of white matter were obtained at different time points.Results The level of serum pNF-H in groups B,C and D arrived at peaks 12 hours and 3 days after SCI,and there was significant difference among them(P<0.05).Both BBB score and remaining area of white matter 14 days after SCI negatively correlated with the level of pNF-H 3 days after SCI(r=-0.987 and r=-0.978,respectively).Conclusion The pNF-H increases twice after SCI in rats,and may be associated with the severe of SCI,which can be considered as a biomarker.

    Key words:spinal cord injury;neurofilament;molecular biological evaluation;rats

    (收稿日期:2015-10-19修回日期:2015-11-17)

    DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.03.007

    [中圖分類(lèi)號(hào)]R651.2

    [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

    [文章編號(hào)]1006-9771(2016)03-0274-04

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