60Coγ射線照射對血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)作用的影響

胡舜英，高雅晶，趙曉騰，陳韻岱*，周平坤

(1解放軍總醫(yī)院心血管內(nèi)科，100853 北京；2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射研究所北京市放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，100850 北京)

放射性心臟病與心臟臨近部位腫瘤如淋巴瘤、乳腺癌、食管癌、胸腺瘤及肺癌等的放射治療有關(guān)，是腫瘤患者遠(yuǎn)期預(yù)后的重要影響因素，目前尚無有效防治措施[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋于血管內(nèi)膜的單層細(xì)胞，若其出現(xiàn)物化損傷或功能紊亂可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[2,3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在輻射導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞是放射性心臟病重要的射線損傷靶細(xì)胞[4]，因此了解血管內(nèi)皮細(xì)胞的放射損傷及修復(fù)機(jī)制對于防治放射性心臟病的發(fā)生發(fā)展有著重要的臨床意義。DNA是生物細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)，維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期起著至關(guān)重要的作用，然而它也是生物細(xì)胞中易受輻射損傷的敏感分子，放射可造成細(xì)胞或組織遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)損傷，細(xì)胞若不能及時正確修復(fù)這些損傷，就可造成基因組序列的缺失和基因突變，甚至出現(xiàn)細(xì)胞死亡、惡變等生物學(xué)后果。本研究利用60Coγ射線對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)進(jìn)行照射，建立HUVEC輻射損傷模型，觀察γ射線照射對HUVEC增值及細(xì)胞周期的影響，著重研究HUVEC受照射后 DNA分子的損傷及修復(fù)機(jī)制，明確了DNA修復(fù)相關(guān)蛋白γH2AX 和 DNA蛋白激酶(catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase，DNA-PKcs)在HUVEC受照射后的表達(dá)變化，為進(jìn)一步明確60Coγ射線照射導(dǎo)致HUVEC DNA損傷及修復(fù)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，從而為放射性心臟病發(fā)病機(jī)制研究及防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVEC購自美國模式菌種收藏中心(American type culture collection，ATCC)，高糖達(dá)爾伯克氏必需基本培養(yǎng)基(dulbeccos minimum essential medium，DMEM;Sigma公司，美國)、新生胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Hyclone公司，美國)，胰蛋白酶(Amresco公司，美國)。其他試劑均為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC在含10%FBS的高糖DMEM中、37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 生長曲線與克隆形成實(shí)驗(yàn) 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液進(jìn)行60Coγ射線照射，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所60Coγ射線放射源進(jìn)行照射，照射劑量分別為0，1，2，4，6 Gy。照射后立即以3×103個/ml濃度接種于24孔板進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每個照射劑量3個平行孔，接種后第2天起取各劑量孔計數(shù)，連續(xù)6 d，繪制細(xì)胞生長曲線圖。另外，照射后的細(xì)胞以遞增密度梯度接種于60 mm培養(yǎng)皿中連續(xù)培養(yǎng)12 d，期間更換培養(yǎng)基1或2次。之后以預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞30 min，Gemsia染料染色 30 min，顯微鏡下計數(shù)每個培養(yǎng)皿>50個細(xì)胞的克隆數(shù)。計算克隆形成率：各皿克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 對數(shù)期細(xì)胞給予4 Gy照射后，于1,2,4,8,12,24 h后收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)洗兩遍后75%預(yù)冷乙醇-20℃固定>24 h，棄去固定液后用0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，加入終濃度50 mg/L的核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)37℃溫浴30 min，加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.4 中性單細(xì)胞凝膠電泳(彗星電泳) γ射線照射細(xì)胞后，分別于照射后15 min，1，2，4 h收集細(xì)胞，以PBS重懸細(xì)胞至濃度為5×105個/ml。取80 μl 1%正常熔點(diǎn)的已融瓊脂糖膠(PBS配制)滴在磨砂玻片上，蓋上蓋玻片4℃、15 min凝固后取下蓋玻片滴加含10 μl細(xì)胞懸液的60 μl、0.65%低熔點(diǎn)瓊脂糖膠(PBS配制)，蓋上蓋玻片4℃、15 min凝固后再滴加80 μl、0.65%低熔點(diǎn)瓊脂糖膠凝固后，放入預(yù)冷的中性細(xì)胞裂解液[氯化鈉(NaCl) 2 mol/L,乙二胺四乙酸二鈉(edetate disodium，Na2EDTA)30 mmol/L,三羥甲基氨基甲烷(trihydroxymethyl aminomethane，Tris)10 mmol/L，十二烷基肌氨酸鈉1%，聚乙二醇辛基苯基醚(octyl phenoxy poly ethoxy，Triton-X100)1%，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)10%，pH 8.2～8.5]4℃，2 h裂解細(xì)胞，用0.5%Tris-硼酸電泳緩沖液(tris-boric acid-EDTA，TBE)，pH 8.2～8.5，4℃，浸沒洗滌2～3次，每次1 h，以20 V、20 mA電流進(jìn)行8 min電泳，PI(2 mg/L)染色15 min，熒光顯微鏡觀察拍照，casp軟件分析細(xì)胞拖尾變化。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 照射后收集不同時間點(diǎn)細(xì)胞，蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)測定蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，1∶1000稀釋度一抗孵育2～3 h(室溫)或過夜(4℃)，TBST(tris buffer solution Tween)緩沖液洗滌后，1∶2000～1∶4000稀釋度的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育45 min后暗室壓片顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 60Coγ射線照射對HUVEC增殖的影響

HUVEC經(jīng)0，1，2，4，6 Gy劑量照射后，連續(xù)觀察6 d，結(jié)果表明隨著照射劑量增加，細(xì)胞生長速度銳減(圖1A)。相比未照射細(xì)胞，照射后細(xì)胞克隆形成數(shù)量和集落大小均隨照射劑量增加而明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01；圖1B)。

圖1 γ射線照射對細(xì)胞增殖的影響

2.2 60Coγ射線導(dǎo)致HUVEC細(xì)胞周期阻滯

采用 4 Gy γ射線照射HUVEC細(xì)胞，分別在照射后4，8，12，24 h觀察不同細(xì)胞周期的細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，相比未照射細(xì)胞，照射后24 h內(nèi)， G2/M期細(xì)胞比例逐漸升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01;圖2)。

圖2 γ射線照射對細(xì)胞周期的影響

2.3 60Coγ射線致細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷與修復(fù)情況

中性單細(xì)胞凝膠電泳(彗星電泳)結(jié)果顯示，60Coγ射線4 Gy照射后，彗星尾矩延長，在照射后15 min 達(dá)到峰值，表明血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)照射后出現(xiàn)明顯的DNA雙鏈斷裂損傷，隨著細(xì)胞開始修復(fù)，彗星尾部長度達(dá)到峰值后開始減小，DNA進(jìn)行修復(fù)(圖3)。4 Gy照射后，H2AX磷酸化在15 min處升高，1 h時達(dá)到峰值，隨后下降，在8 h再達(dá)到一個較小的峰值(圖4)。而DNA PKcs2056位點(diǎn)的磷酸化15 min明顯升高，4 h后緩慢的去磷酸化，呈先升高后降低的趨勢(圖5)。

3 討 論

乳腺癌、何杰金氏病以及其他胸部腫瘤的綜合治療方案中， 放射治療顯著改善了患者疾病相關(guān)的預(yù)后，然而，放射治療可導(dǎo)致心臟并發(fā)癥發(fā)生，包括冠狀動脈疾病、心力衰竭、瓣膜病、心包疾病、傳導(dǎo)異常以及心源性猝死。放射治療所致的心血管并發(fā)癥大多出現(xiàn)在放療后10年甚至更長時間，已成為患者非腫瘤本身死亡的主要原因[5]。放射性心臟病機(jī)制研究中,研究人員認(rèn)為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是射線損傷的靶細(xì)胞,心肌細(xì)胞的變性及心肌纖維化是繼發(fā)于內(nèi)皮細(xì)胞受損后的心臟微循環(huán)障礙所致[4,6]。DNA是生物細(xì)胞中易受輻射損傷的敏感分子,DNA復(fù)制在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，維持正常結(jié)構(gòu)和功能是細(xì)胞正常生長和代謝的基礎(chǔ)。

圖3 DNA雙鏈斷裂彗星電泳圖

圖4 γ射線照射對γH2AX表達(dá)的影響

圖5 γ射線照射對DNA PKcs 2056位點(diǎn)磷酸化的影響

本研究結(jié)果表明，60Coγ射線照射對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并且抑制率與放射劑量呈正相關(guān)。而早期研究報道，低劑量射線刺激下，細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體KDR表達(dá)明顯增加，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。張曉啟等[8]推測細(xì)胞來源不同，其對輻射的耐受性也會有所差異，并且不同周期時相的細(xì)胞對輻射的敏感性也不同，一般來說，M期細(xì)胞的耐受性最低,G2期細(xì)胞次之。放射引起DNA損傷后導(dǎo)致其在細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)機(jī)制的紡錘體檢查點(diǎn)和DNA結(jié)構(gòu)檢查點(diǎn)無法通過，從而滯留在M期[9]。研究結(jié)果顯示，細(xì)胞在G2/M期的阻滯隨著照射劑量增大而延長，表明細(xì)胞損傷修復(fù)的難易程度隨劑量增加而提高。而低劑量照射后，細(xì)胞越過阻滯后出現(xiàn)第二次較低峰值，可能是因?yàn)镚2/M期阻滯形成類似于同步化功能，大量細(xì)胞共同進(jìn)入同一時相所致。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與凋亡實(shí)驗(yàn)推斷，放射并不直接殺死所有細(xì)胞，而是造成DNA損傷后，大部分細(xì)胞經(jīng)過數(shù)次分裂增殖或長時間細(xì)胞周期阻滯而誘發(fā)凋亡。

DNA雙鏈斷裂損傷是放射作用于細(xì)胞基因組的嚴(yán)重?fù)p傷，雙鏈斷裂得不到修復(fù)會直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。中性單細(xì)胞凝膠電泳是一種能夠比較直觀檢測DNA雙鏈損傷的實(shí)驗(yàn)手段，通過對單細(xì)胞形成的彗星形態(tài)的DNA片段量化分析判斷其DNA損傷程度[10]，從而更直觀地驗(yàn)證DNA雙鏈的損傷。

H2AX是組蛋白的一種，存在于所有真核細(xì)胞，與其他組蛋白共同作用結(jié)合染色質(zhì)形成核小體。其羧基端的139位為絲氨酸殘基組成的絲氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸結(jié)構(gòu)域，該絲氨酸殘基在DNA雙鏈斷裂損傷發(fā)生時可迅速被磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinase，PI3K)、關(guān)卡基因蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM)、Rad-3相關(guān)蛋白(Rad-3 related protein,ATR)、DNA依賴的蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)復(fù)合體等多種DNA修復(fù)相關(guān)蛋白磷酸化成γH2AX，γH2AX在DNA雙鏈斷裂損傷位點(diǎn)形成焦點(diǎn)復(fù)合物，并進(jìn)一步募集下游相關(guān)修復(fù)蛋白進(jìn)行DNA修復(fù)[11]。DNA-PK復(fù)合物包括DNA PKcs和Ku70/Ku80亞基，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶[12]，是DNA雙鏈損傷的非同源鏈接修復(fù)的重要分子，在修復(fù)過程中募集其他修復(fù)蛋白共同參與[13,14]。并且DNA-PKcs在DNA損傷相關(guān)的H2AX磷酸化反應(yīng)中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[15]。本研究結(jié)果顯示，γH2AX在照射后迅速形成焦點(diǎn)，隨著損傷的修復(fù)逐漸降低，但在8 h前后再次出現(xiàn)一個較低的峰值，可能與大部分細(xì)胞修復(fù)完成后從G2/M期阻滯中解放出來后有關(guān)。

綜上，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是放射性心臟病的重要發(fā)病機(jī)制，本研究證實(shí)在γ射線照射的情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率降低，G2/M期阻滯明顯，DNA雙鏈損傷加重，同時DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白γH2AX 和DNA-PKcs表達(dá)增加。DNA損傷在機(jī)體放射損傷中起著至關(guān)重要的作用，該研究首次探討了DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白γH2AX 和 DNA-PKcs在血管內(nèi)皮細(xì)胞放射損傷中的表達(dá)變化，上述蛋白分子能否在放射性心臟病的防治中發(fā)揮作用，仍有待于進(jìn)一步研究。

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