Bacillus subtilis脂肽Bacillomycin D抗黃曲霉毒素研究進展

馬芳芬+殷海成

摘 要：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtills）被認為是一種有效抑制黃曲霉并降解其毒素的菌種。己從不同的枯草芽孢桿菌菌株中分離得到具有抑制黃曲霉毒素的脂肽抗生素Bacillomycin D。Bacillomycin D屬于Iturin家族，是枯草芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素最強抗生素，也是目前唯一從枯草芽孢桿菌菌株中得到并且已經鑒定的具有抗黃曲霉活性的物質。該文對枯草芽孢桿菌及其抗菌脂肽Bacillomycin D的結構、性質、抑制黃曲霉機制進行了綜述，為其進一步應用提供參考。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；抗菌脂肽；Bacillomycin D；黃曲霉；毒素

中圖分類號 5816.7 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）06-22-03

Research Progress on the Inhibition Effect of Antimicrobial Lipopeptide Bacillomycin D from Bacillus subtilis on Aspergillus flavus

Ma Fangfen et al.

（College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

Abstract：Bacillus subtilis is considered to be a probiotics，which can suppress the growth of Aspergillus flavus and degrade aflatoxin of the strain. So far，the lipopeptide complex like Bacillomycin D produced by the strain has been found have antifungal activities. Bacillomycin D belongs to the iturin family，which is the most powerful antibiotic for B.subtilis，and is currently the only material that has been identified from the strain.In this paper，the research advances in chemical structure，physicochemical characters and antifungal properties of B. subtilis and/or bacillomycin D were reviewed to provide technical reference for the further research and application.

Key words：Bacillus subtilis；Antimicrobial lipopeptides；Bacillomycin D；Aspergillus flavus；Aflatoxin

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一類由黃曲霉（Aspergillus flavus）、特曲霉（Aspergillus nomius）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等霉菌分泌的含有一個雙呋喃環(huán)和一個香豆素的次級代謝物，分為B族和G族2類，共20余種，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中毒性最強、危害最大的霉菌毒素[1]；它具有強烈的致癌、致畸、致突變性等；廣泛存在于糧食及食品中，如花生、玉米和奶制品、飼料等[2]。據聯(lián)合國糧農組織（FAO）估計，每年由黃曲霉毒素污染造成的損失多達數(shù)千億美元[3]，已成為國內外食品安全組織和科研院所等有關部門高度關注的問題。因此，采取有效措施抑制黃曲霉或去除黃曲霉毒素污染十分必要。

目前預防AFT主要采取阻止黃曲霉污染和對已經造成污染的食品或飼料原料進行脫毒以及降低人和動物對AFT的吸收等[4]。脫毒最常采用的方法有物理法、化學法和生物法。而生物方法反應條件溫和，去毒效率高成為目前研究熱點。大量研究也證實：很多霉菌、細菌、放線菌、酵母以及藻類等都可以用來降解黃曲霉毒素。其中芽孢桿菌由于分布廣泛，容易培養(yǎng)，且培養(yǎng)物中含有多種抗菌脂肽，是一類比較理想的生防微生物，以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtills）抗黃曲霉效果好而備受青睞?？莶菅挎邨U菌合成、分泌的抗菌物質是具有表面活性一類抗菌脂肽[5，6]（antimierobial peptides，AMPs），此類脂肽目前已知有3大類：包括Surfactin家族、Iturin家族和Fengycin家族[7]。這些抗真菌膚有許多共同的特征：分子量較小，約l 000D左右，含有D-構型氨基酸和β-脂肪酸等一些特殊結構，由于氨基酸呈環(huán)狀排列，因此稱為環(huán)脂抗菌肽。Bacillomycin D屬于Iturin家族中的一種，是抑制黃曲霉最強且唯一的一種抗生素，并與其它脂肽類抗生素無交叉耐藥性，毒性小，抗菌譜廣等特點[8-9]備受關注。本文主要概述了枯草芽孢桿菌及其抗菌脂肽Bacillomycin D的結構、性質及拮抗黃曲霉毒素的作用機制。

1 Bacillomycin D結構及性質

Bacillomycin D抗菌脂肽首次由Landy等[10]于1948年從枯草芽孢桿菌中分離得到。隨后研究發(fā)現(xiàn)很多枯草芽孢桿菌均可產生。Moyne和Thomas[11]證實Bacillomycin D的合成是由枯草芽孢桿菌胞內的多酶復合體經非核糖體途徑合成；Moyne等[12]進一步研究該多酶復合體由4個開放閱讀框共同編碼并組成Bacillomycin D的操縱子。Bacillomycin D屬于Iturin家族的一個成員，也是由親水性環(huán)狀短肽與疏水性長鏈脂肪酸組成的具有表面活性的雙親性化合物。后經Maget-Dana、Peypoux[13]進一步分離、純化發(fā)現(xiàn)有4種同系物，C原子分別為C14-C17（表1）。其中7個氨基酸手性順序為L-Asn-D-Tyr-D-Asn-L-Pro-L-Glu-D-Ser-L-Thr即L-D-D-L-L-D-L，見圖1。

表1 Bacillomycin D結構

[種類＼&Bacillomycin

D1＼&Bacillomycin

D2＼&Bacillomycin

D3＼&Bacillomycin

D4＼&分子量＼&1030＼&1044＼&1058＼&1072＼&脂肪酸鏈＼&C14＼&C15＼&C16＼&C17＼&]

<＼＼Pc10＼工作盤 （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼2016-6農學通報內文＼s96-1.eps>

圖1 Bacilloznycin D的結構（n=0、1、2、3）

Bacillomycin D所具有的親水基和疏水基賦予其既易溶于水，又能溶于部分有機溶劑，因此是一種生物表面活性劑，但其活性弱于Surfactin脂肽。因此，對于Bacillomycin D提取常采用物理吸附和化學化合方法，提取率近100%。Bacillomycin D的理化性質穩(wěn)定，有較好的熱穩(wěn)定性，121℃、30min保持95%抗菌活性，pH=7.6活性最強，對有機溶劑有較強的耐受性（乙睛TFA，甲醇等），對蛋白酶類不敏感；25w紫外燈下，距離約5cm，照射8h不影響活性，這與Iturins家族理化特性一致[14]。然而，戴曉燕和關桂蘭[15]認為枯草芽孢桿菌多種抗菌蛋白偏酸性，對高溫穩(wěn)定，在酸性和中性條件下相對穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定，這可能是歸于枯草芽孢桿菌來源不同或純化狀態(tài)有關。

2 枯草芽孢桿菌及其Bacillomycin D抗黃曲霉毒素機制

20世紀40年代至今，從不同枯草芽孢桿菌株分離、純化的抗菌物質有很多種，但對黃曲霉有抑制作用只有Bacillomycin D，也是目前唯一從枯草芽孢桿菌菌株中得到并且已經鑒定的具有抗黃曲霉活性的活性物質[12]。Bottone和Peluso[16]的研究表明：Bacillus subtilis可分泌一種顯著抑制黃曲霉孢子萌發(fā)和菌絲延長的活性物質，分子量500～3 000Da，但沒有進一步純化、鑒定；Moyne[12]在此基礎上進一步研究，從中分離得到抗黃曲霉活性物質為Bacillomycin D，該物質對黃曲霉最低抑制量為3μg/g；中國農業(yè)科學院的張盼[17]等從可食用的納豆中篩選出一株枯草芽抱桿菌Natto 3，能夠高效降解黃曲霉毒素B，降解率達到91.4%。

Bacillomycin D與iturin家族其他脂肽的結構類似，但氨基酸組成的差異（圖1）導致其生物活性的不同。Iturin對真菌、酵母的抑制作用強但對部分細菌抑制作用較弱，對黃曲霉幾乎沒有作用，兼有表面活性作用和溶血作用；而Bacillomycin D不僅對真菌有抑制作用，而且對黃曲霉菌也有很強的抑制作用[12]。目前，對其對于iturin家族抗真菌機制研究主要集中在細胞膜上，例如，Aranda等[18]認為：Iturins與真菌細胞膜的磷脂雙分子層相互作用，可形成Iturins聚合物或形成脂肽-磷脂、脂肽-磷脂-甾醇聚合物，使細胞膜離子通道通透性增加，導致細胞內容物的釋放，從而引起真菌細胞的生長抑制或者死亡；侯紅漫[19]等認為：Iturins通過小囊泡的形成和內膜顆粒聚集來干擾真菌細胞質膜功能，促進釋放電解質，大分子物質以及降解磷脂，導致細胞死亡，作用機制基本一致。對于Bacillomycin D是否能抑制黃曲霉某種蛋白活性，引起黃曲霉生長抑制或毒素分泌減少研究很少。Broaden[20]認為，抗菌脂肽能與病原菌染色體DNA發(fā)生相互作用，抑制DNA的復制、轉錄、表達功能，使菌體蛋白質的合成受阻，進而抑致其生長和繁殖；抗菌脂肽還能抑制點青霉菌絲細胞內琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶活性，并且隨著脂肽濃度的增加對這2種酶的抑制作用增強[21]。龔慶偉[22]在對Bacillomycin D抑制黃曲霉作用機制研究后認為，該抗菌脂肽除了破壞細胞膜，它還能夠使黃曲霉生長過程中產生的前體物Norsolorinin acid（NA）減少以及菌絲的細胞壁溶解，使之發(fā)生嚴重變形甚至破裂，加速黃曲霉死亡?？傊莶菅挎邨U菌拮抗黃曲霉機理目前尚無明確定論，還有待進一步深入研究。

3 枯草芽孢桿菌抑制黃曲霉及其毒素效果

枯草芽孢桿菌是在自然界中廣泛存在一類嗜溫、好氧且產芽飽的革蘭氏陽性桿狀細菌。該菌對人畜無毒、無害而且不污染環(huán)境，具有廣譜拮抗病菌的活性以及抗逆能力，已廣泛運用于農作物及其產品的真菌污染防治。美國已有4株枯草芽孢桿菌生防菌被國家環(huán)保局（EPA）商品化或有限商品化生產許可。Johnson[23]1945年首次報道枯草芽抱桿菌抗菌物質。隨后針對黃曲霉抑制作用開展大量研究。Landy等[10]通過枯草芽孢桿菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中含有抑制黃曲霉的活性物質；Kirnura[24]、Moyne[11]等采用同樣方法篩選到的枯草芽孢桿菌（NK330和AU 195）能很好的抑制黃曲霉的生長及產毒。Moyne等研究的最低抑制濃度為3μg/g，抑制效果達85%；Reddy[25]將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，按照200mg/kg比例添加到大米中，可抑制93%的黃曲霉生長和83.7%黃曲霉毒素B1的產生；Farzaneh[26]使用該菌對污染黃曲霉開心果進行實驗也發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素降解率達95%；不同的是，Ono[27]在對枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中iturin A能抑制黃曲霉毒素，并申請了專利，但隨后被證實對黃曲霉毒素無效[28]。國內朱新貴[29]等對幾種食品微生物去除黃曲霉毒素研究也發(fā)現(xiàn)，其中以枯草芽孢桿菌的抑制效果最好，為88%，若向培養(yǎng)基中添加鈣或鎂離子可以促進枯草桿菌對黃曲霉毒素的降解；張盼[17]等從可食用的納豆中篩選出一株枯草芽孢桿菌Natto3，能夠高效降解黃曲霉毒素B1，在濃度為43μg/kg時，降解率達到91.4%。此外，關于枯草芽孢桿菌降解黃曲霉毒素還有產品上市，如雷元培[30]等從動物腸道分離的枯草芽抱桿菌能降解黃曲霉毒素，降解率為81%，并命名為霉立解060。除此之外，有關枯草芽孢桿菌抑制黃曲霉的生物農藥未見登記。

利用枯草芽孢桿菌防治黃曲霉取得一定成就，也從該菌發(fā)酵底物中篩選到多種抗黃曲霉的脂肽復合物，但是真正能夠運用到實踐中的卻很少。其原因可能是抗菌脂肽分離、純化比較困難，難以產業(yè)化生產；其次是抗菌脂肽的作用機制還尚未完全掌握。因此，對抗菌脂肽類抗生素還需要進行更深入、更廣泛的研究。

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（責編：徐煥斗）