不同形態(tài)中國(guó)對(duì)蝦貯藏過(guò)程中產(chǎn)生生物胺變化的分析

胡禮淵，孫高英，廖和菁（廣西東興出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西東興538100）

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不同形態(tài)中國(guó)對(duì)蝦貯藏過(guò)程中產(chǎn)生生物胺變化的分析

胡禮淵，孫高英，廖和菁
（廣西東興出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西東興538100）

摘要：為提高進(jìn)出口對(duì)蝦風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控水平，利用反相高效液相色譜法測(cè)定不同形態(tài)中國(guó)對(duì)蝦貯藏過(guò)程中產(chǎn)生生物胺的變化，結(jié)合感官檢驗(yàn)、pH和菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果，分析對(duì)蝦腐敗進(jìn)程及其原因。結(jié)果表明，在0℃和4℃下貯藏，腐胺和尸胺變化最顯著，貯藏第10天質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（206.48±14.19）mg/kg，（162.45±18.13）mg/kg和（397.48±14.19）mg/kg，（201.95±15.84）mg/kg；25℃下貯藏產(chǎn)生的主要生物胺是酪胺，貯藏10天質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)（675.66±20.25）mg/kg，其次是腐胺和尸胺。確定不同形態(tài)的對(duì)蝦在0、4、25℃下貯藏，整蝦的可接受期為5、4、1 d，蝦仁可接受期為7、5、1 d，細(xì)菌是造成蝦體內(nèi)生物胺累積的主要原因。

關(guān)鍵詞：中國(guó)對(duì)蝦；生物胺；腐敗；細(xì)菌；貯藏

生物胺是具有生物活性的一類低分子量有機(jī)含氮化合物，廣泛存在于各類食品，尤其是高蛋白食品中。生物胺在機(jī)體內(nèi)的主要形成途徑是游離態(tài)氨基酸的脫羧反應(yīng)，也有部分生物胺是醛和酮氨化或轉(zhuǎn)氨作用而形成的，按其組成成分可分為單胺（組胺、酪胺、苯乙胺、章魚(yú)胺）、二胺（腐胺、尸胺）和多胺（精胺、亞精胺）[1]。對(duì)人體健康危害最大的組胺和酪胺；腐胺和尸胺通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)體中的解毒酶，從而增加組胺和酪胺的毒性，并且能夠與亞硝基鹽反應(yīng)生成亞硝基吡咯烷、亞硝基哌啶等致癌物質(zhì)；精胺和亞精胺能促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，加速機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，是細(xì)胞增殖的重要物質(zhì)；章魚(yú)胺是一種重要的神經(jīng)介質(zhì)，有調(diào)節(jié)代謝和能量平衡的功效；苯乙胺有神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)與示蹤胺的作用[2]。生物胺是生物體內(nèi)的正常生理組分，具有非常重要的生理功能，是合成荷爾蒙、核酸、蛋白質(zhì)的前體，但當(dāng)人體攝入過(guò)量的生物胺時(shí)，會(huì)引起頭痛、惡心、心悸、血壓變化呼吸紊亂等過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重的還會(huì)危及生命[3]。在貯藏過(guò)程中，細(xì)菌產(chǎn)生的消化酶以及對(duì)蝦自身的自溶酶把蛋白質(zhì)分解成氨基酸，經(jīng)攜帶脫羧酶的微生物脫羧而形成生物胺，其產(chǎn)生的前體條件是：1）機(jī)體中含有游離的氨基酸；2）滿足脫羧反應(yīng)的條件；3）適宜微生物生長(zhǎng)的環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacteria）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、弧菌屬（Vibrio）是對(duì)蝦腸道中發(fā)現(xiàn)最多的生物胺產(chǎn)生菌[4-8]。

中國(guó)對(duì)蝦是我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大名蝦之一，具有個(gè)體大、肉質(zhì)緊實(shí)，顏色鮮美等特點(diǎn)，并含有多種維生素及人體必須的微量元素，是高蛋白營(yíng)養(yǎng)水產(chǎn)品。近年來(lái)，僅靠國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖的產(chǎn)量已跟不上消費(fèi)需求，從東南亞國(guó)家進(jìn)口的中國(guó)對(duì)蝦數(shù)量有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，研究不同形態(tài)中國(guó)對(duì)蝦貯藏過(guò)程中產(chǎn)生生物胺的變化，可以為水產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控檢測(cè)，運(yùn)輸貯藏保鮮技術(shù)等提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用中國(guó)對(duì)蝦依據(jù)SC/T 3016-2004《水產(chǎn)品抽樣方法》[9]抽檢于同一報(bào)檢批越南進(jìn)口冰鮮對(duì)蝦，符合GB 18406.4-2001《農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無(wú)公害水產(chǎn)品安全要求》[10]的鮮度和感官要求，抽樣量為1000g，規(guī)格為30尾/ 1000g，裝入聚乙烯抽樣袋，上覆碎冰，封口運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，2h內(nèi)制樣。取15尾對(duì)蝦去頭、去殼、去消化腺和鰓絲，僅留可食部分肌肉，制成蝦仁，與另外15尾整蝦各平均分為3組，分別置于0、4℃冰箱和25℃恒溫箱中貯藏。

1.1.2試劑

苯乙胺（Phe）、組胺（His）、腐胺（Put）、酪胺（Tyr）（純度皆為98%），尸胺（Cad）、亞精胺（Spe）（純度為99%），章魚(yú)胺（Oct）（純度95 %），丹磺酰氯（純度98 %）：均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乙腈、丙酮、甲醇均為色譜純：德國(guó)CNW公司；其他試劑（皆為分析純）：廣東西隴化工有限公司；試驗(yàn)用水為超純水：美國(guó)Millipore公司。

1.1.3儀器和設(shè)備

AgiLent 1200高效液相色譜儀（四元梯度泵）配紫外檢測(cè)器，3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；SJ-Ⅱ均質(zhì)器：上海昆蟲(chóng)科技開(kāi)發(fā)公司；pHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CHP9270恒溫箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；CPA224S十萬(wàn)分之一電子天平。

1.1.4色譜條件

色譜柱：AgiLent SB C18反相色譜柱，250 mm× 4.6 mm；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A：0.01 mol/L乙酸銨，B：水+乙腈（10+90）含0.01 mol/L乙酸銨；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.2方法

1.2.1感官評(píng)價(jià)

以氣味、色澤、肌肉彈性為感官評(píng)價(jià)指標(biāo)，將對(duì)蝦的質(zhì)量分為3個(gè)等級(jí)：1.可接受級(jí)（無(wú)異味、色澤光鮮、肌肉緊實(shí)），2.初期腐敗級(jí)（有輕微腐敗氣味、色澤微紅、肉質(zhì)半透明），3.腐敗級(jí)（異味明顯、色澤暗淡、肉質(zhì)軟化），對(duì)整蝦和蝦仁進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.2 pH測(cè)定

取可食部分肌肉，用剪刀剪碎，混勻。稱取5.0 g放入離心管中，平行稱3份，加入45 mL超純水，攪拌均勻，放置30 min進(jìn)行浸出，并不斷振搖，然后過(guò)濾，濾液用酸度計(jì)測(cè)定，直接讀出pH。

1.2.3菌落總數(shù)測(cè)定

參照GB/T 4789.2-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[11]操作。

1.2.4生物胺測(cè)定

稱取2.00g樣品，置于50mL離心管中，加入10mL 0.4mol/L高氯酸溶液，均質(zhì)1min，4000r/min離心5min，上清液移入25mL容量瓶中，沉淀物用10 mL 0.4 moL/L高氯酸溶液重復(fù)提取1次，合并上清液，用0.4moL/L高氯酸定容至刻度。取1.0 mL提取液加入5 mL容量瓶中，依次加入0.1 mL 2 moL/L氫氧化鈉溶液、0.3 mL飽和碳酸氫鈉溶液和2 mL 10 mg/mL丹酰氯溶液，蓋塞，于40℃避光反應(yīng)45 min，然后加入0.1 mL 25 %～28 %氫氧化銨，靜置30 min，用乙腈定容到刻度，取1 mL過(guò)0.45 μm濾膜后進(jìn)樣，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS V16.0軟件，對(duì)不同貯藏條件下，中國(guó)對(duì)蝦的pH、菌落總數(shù)、生物胺含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較，EXCEL2007繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1品質(zhì)指標(biāo)的變化

中國(guó)對(duì)蝦在不同貯藏條件下感官等級(jí)和pH的變化見(jiàn)表2。

表2不同貯藏條件下中國(guó)對(duì)蝦感官等級(jí)、pH的變化Table 2 Changes in pH and sensory rating of Chinese shrimp during different storage condition

由表2可知，在10 d的貯藏時(shí)間里，對(duì)蝦品質(zhì)逐漸下降，至第8天，所有試驗(yàn)組都出現(xiàn)不同程度的腐敗，不適宜食用，說(shuō)明貯藏溫度越高，腐敗速度越快。0、4、25℃貯藏條件下，中國(guó)對(duì)蝦感官可接受時(shí)間分別為6 d～8 d、4 d～6 d、0.5 d～1 d。蝦仁和整蝦相比較，相同溫度下，蝦仁感官可接受期比整蝦滯后1 d～2 d，貯藏溫度越低差異越顯著。在整個(gè)貯藏過(guò)程中pH從接近中性的（7.06±0.02）升至腐敗后的大于8，總體趨勢(shì)是上升的。0、4、25℃貯藏條件下，溫度越高，pH升高速率越大，相互間差異顯著（P<0.05），整蝦pH升速大于蝦仁pH的升速。值得注意的是，感官等級(jí)出現(xiàn)變化時(shí)，pH上升的速率最大，當(dāng)對(duì)蝦品質(zhì)達(dá)到腐敗級(jí)后，pH上升緩慢，說(shuō)明而蝦體中的蛋白質(zhì)、氨基酸及其他含氮物質(zhì)被分解為吲哚、氨、三甲胺等呈堿性的產(chǎn)物不斷增加，pH持續(xù)上升，隨著機(jī)體中分解出的小分子化合物增多，能被微生物利用的小分子化合物越多，細(xì)菌增殖的速度就越快，對(duì)蝦品質(zhì)下降明顯。

2.2菌落總數(shù)的變化

不同形態(tài)的中國(guó)對(duì)蝦儲(chǔ)藏于0、4、25℃時(shí)活菌數(shù)的變化見(jiàn)圖1和圖2。

圖1中國(guó)對(duì)蝦（整蝦）儲(chǔ)藏于0、4、25℃時(shí)活菌數(shù)的變化Fig.1 Chinese shrimp（whole shrimp）stored at 0，4，25℃，changes in the number of viable cells

圖2中國(guó)對(duì)蝦（蝦仁）貯藏于0、4、25℃時(shí)活菌數(shù)的變化Fig.2 Chinese shrimp（Peeled prawns）stored at 0，4，25℃，changes in the number of viable cells

有研究表明，對(duì)蝦細(xì)菌總數(shù)（個(gè)/g）≤105為一級(jí)鮮度；≤5×105為二級(jí)鮮度；細(xì)菌總數(shù)達(dá)到106～107時(shí)，對(duì)蝦已嚴(yán)重腐敗，不能食用[12]。由圖1圖2中得知，對(duì)蝦初始細(xì)菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值為4.12，在整個(gè)貯藏期內(nèi)呈上升趨勢(shì)。0℃下整蝦冰藏5 d，細(xì)菌總數(shù)達(dá)過(guò)了6 lg（cfu/g），已不能食用，而經(jīng)過(guò)處理的蝦仁冰藏5 d僅為5.09 lg （cfu/g），至第7天為6.76 lg（cfu/g）；4℃下整蝦冷藏4 d細(xì)菌總數(shù)就達(dá)到6.95 l g（cfu/g），蝦仁冷藏4 d僅為5.78 lg（cfu/g），至第5天達(dá)到6.62 lg（cfu/g）；25℃下恒溫貯藏僅1 d后細(xì)菌總數(shù)就超過(guò)106個(gè)/g這個(gè)腐敗限值，說(shuō)明25℃時(shí)中低溫菌繁殖和新陳代謝加速，酶的活性增強(qiáng)，導(dǎo)致蝦體內(nèi)酶促和生化等一系列反應(yīng)的速度加快，整蝦和蝦仁兩者差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，冰藏比冷藏對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制效果更顯著（P＜0.05），在0、4、25℃下貯藏，整蝦可接受期為5、4、1 d，蝦仁可接受期為7、5、1 d，與感官等級(jí)、pH變化趨勢(shì)基本一致。

細(xì)菌是造成水產(chǎn)品腐敗最主要的因素，蝦體中細(xì)菌數(shù)量：腸道>胃>肝胰腺>鰓>甲殼>肌肉。王祥紅等在野生中國(guó)對(duì)蝦腸道中分離出47株菌8個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)菌屬為弧菌屬、發(fā)光桿菌屬，次優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬[13]，Dempsey等對(duì)蝦類的腸道菌群進(jìn)行了研究，分離并鑒定了腸道菌群的好氧菌，發(fā)現(xiàn)弧菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬和假單胞菌屬占優(yōu)勢(shì)[14]。在對(duì)蝦生長(zhǎng)不同時(shí)期，腸道菌群的數(shù)量和組成主要受內(nèi)因（腸的結(jié)構(gòu)和發(fā)育階段）和外因（攝食對(duì)象，水體環(huán)境，溫度等）的影響[15]。腸炎弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌等易引起感染型食物中毒的致病菌在10℃以下不能正常發(fā)育，但有少數(shù)好氣和厭氣低溫細(xì)菌即使在0℃也能旺盛的生長(zhǎng)[16]。當(dāng)對(duì)蝦死亡后，細(xì)菌從甲殼和消化道侵入肌肉，也可以從鰓絲經(jīng)血液系統(tǒng)侵入到肌肉內(nèi)，鮮蝦去頭、殼、消化道后低溫貯藏能降低肌肉被致病菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此，低溫貯藏能有效抑制細(xì)菌的增殖，延長(zhǎng)對(duì)蝦的可接受期。

2.3生物胺含量變化

在0、4、25℃下貯藏0、2、4、6、8、10 d，測(cè)定中國(guó)對(duì)蝦體內(nèi)生物胺變化的情況，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3不同貯藏條件下中國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)生生物胺的變化Table 3 Changes in biogenic amines rating of Chinese shrimp during different storage condition

表3可見(jiàn)，生物胺總量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在0、4℃下貯藏，腐胺和尸胺是變化最顯著的生物胺，貯藏初始僅檢出有少量亞精胺，至貯藏終期酪胺和亞精胺變化呈輕微波動(dòng)的規(guī)律，0℃下貯藏，腐胺和尸胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)第10天達(dá)到（206.48±14.19）mg/kg和（162.45±18.13）mg/kg；4℃下貯藏，腐胺和尸胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)第10天達(dá)到（397.48±14.19）mg/kg和（201.95± 15.84）mg/kg，在對(duì)蝦感官等級(jí)變化時(shí)，腐胺和尸胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升明顯，0℃和4℃兩種貯藏溫度相比，中國(guó)對(duì)蝦生物胺變化差異顯著（P＜0.05）。蝦仁在經(jīng)過(guò)去殼、頭、消化腺后，單位含菌量上要低于整蝦，這在一定程度上會(huì)影響到低溫貯藏時(shí)腐胺和尸胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)期結(jié)果相符。25℃下貯藏，酪胺是主要生物胺，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第2天急速升高到（343.31± 13.24）mg/kg，貯藏終期高達(dá)（675.66±20.25）mg/kg，遠(yuǎn)超靜脈注射小鼠LD50229 mg/kg限值，足以危及人體生命安全，F(xiàn)DA認(rèn)為，酪胺的安全閾值建議參考上限為100 mg/kg～800 mg/kg[17]，而腐胺和尸胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)至第10天僅為（191.82±10.64）mg/kg和（49.44±4.02）mg/kg。針對(duì)高溫貯藏會(huì)改變細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌種的種類，進(jìn)而影響主要生物胺產(chǎn)生的現(xiàn)象，Guizani[18]分析了生物胺產(chǎn)生菌的性質(zhì)，認(rèn)為這些菌一般為嗜溫菌，所以20℃更加容易產(chǎn)生生物胺，相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。在0、4、25℃下貯藏，組胺、章魚(yú)胺和苯乙胺始終沒(méi)有檢出。

亞精胺由精氨酸脫羧產(chǎn)生，是生物體內(nèi)的必需物質(zhì)，貯藏初期呈上升趨勢(shì)，到第4天最高，然后持續(xù)下降。有學(xué)者認(rèn)為在腐胺的產(chǎn)生過(guò)程中，精氨酸很有可能被利用作為腐胺的前體物質(zhì)，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制精氨酸的產(chǎn)生[19]。甲殼類的肌肉中幾乎沒(méi)有肌肽和游離組氨酸，因而不太可能會(huì)產(chǎn)生組胺，但是其肌肉中含有大量的磷酸精氨酸，精氨酸與鳥(niǎo)氨酸之間可以相互轉(zhuǎn)化，因此能產(chǎn)生大量的腐胺。Rezaei等研究表明，當(dāng)假單胞菌為主要腐敗菌時(shí)其主要的生物胺為尸胺和腐胺[20]。Huss發(fā)現(xiàn)假單胞菌需氧、嗜冷生長(zhǎng)，能分泌嗜鐵素等物質(zhì)抑制其他競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌的生長(zhǎng)，同時(shí)分泌高活性蛋白酶和脫羧酶，因此被認(rèn)為有氧冷藏特定腐敗菌[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相同溫度下貯藏不同形態(tài)的蝦仁和整蝦，兩者間差異顯著（P＜0.05），蝦仁能有效降低活菌數(shù)，進(jìn)而抑制生物胺產(chǎn)生，對(duì)對(duì)蝦貯藏的防腐保鮮有積極意義。

3　結(jié)論

中國(guó)對(duì)蝦的感官等級(jí)、pH、菌落總數(shù)和生物胺總量的變化規(guī)律具有一致性，可作為鮮度評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。不同形態(tài)的對(duì)蝦在0、4、25℃下貯藏，整蝦的可接受期為5、4、1 d，蝦仁可接受期為7、5、1 d。中國(guó)對(duì)蝦低溫貯藏產(chǎn)生的主要生物胺是腐胺和尸胺，常溫貯藏產(chǎn)生大量酪胺，細(xì)菌是造成蝦體內(nèi)生物胺累積的主要原因。

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Produce Different Forms of Chinese Shrimp during Storage Analysis of Changes in Biogenic Amines

HU Li-yuan，SUN Gao-ying，LIAO He-jing
（Dongxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongxing 538100，Guangxi，China）

Abstract：In order to improve the level of imports and exports of shrimp risk monitoring，measuring different forms of Chinese shrimp produced changes in biogenic amines during storage，combined with sensory testing using reverse-phase high performance liquid chromatography，pH and the total number of colonies of the test results，the analysis process and the reasons for corruption shrimp . The results show that at 0℃and 4℃storage，putrescine and cadaverine was most remarkable，storage first 10 days quality scores were（206.48± 14.19）mg/kg，（162.45±18.13）mg/kg and（397.48±14.19）mg/kg，（201.95±15.84）mg/kg；mainly biogenic amines produced under 25℃storage is tyramine，storage 10 days the mass fraction of（675.66±20.25）mg/kg，followed by putrescine and cadaverine. Determine the different forms of shrimp at 0，4，25℃storage，whole shrimp acceptable period of 5，4，1 d，shrimp acceptable period of 7，5，1 d，bacteria are the main cause of shrimp in vivo accumulation of biogenic amines .

Key words：Chinese shrimp；biogenic amines；corruption；bacteria；storage

收稿日期：2014-10-09

作者簡(jiǎn)介：胡禮淵（1979—），男（漢），助理工程師，本科，研究方向：水產(chǎn)品檢測(cè)。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.043