液相色譜-串聯(lián)質譜測定小麥粉中11種真菌毒素

李磊，李海暢，周貽兵，林野（.貴州省疾病預防控制中心，貴州貴陽550004；.貴陽市疾病預防控制中心，貴州貴陽55000）

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液相色譜-串聯(lián)質譜測定小麥粉中
11種真菌毒素

李磊1，李海暢2，周貽兵1，林野1
（1.貴州省疾病預防控制中心，貴州貴陽550004；2.貴陽市疾病預防控制中心，貴州貴陽550002）

摘要：建立小麥粉中11種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法。樣品用乙腈-水溶液提取，經多功能凈化柱PriboFast 100進行凈化，采用XTerra MS C18色譜柱進行分離，以20 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈梯度洗脫，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜進行分析。11種真菌毒素在測定濃度范圍內線性關系良好，各組分相關系數(shù)R2>0.998，加標回收率范圍72.4%～90.7%，方法精密度范圍6.2%～11.8%，測定各組分真菌毒素定量限范圍1.2μg/kg～2.0μg/kg。該方法前處理過程簡潔、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于小麥粉中11種真菌毒素的測定。

關鍵詞：小麥粉；真菌毒素；超高效液相色譜-串聯(lián)質譜

真菌毒素是霉菌在污染食品后所產生的有毒代謝物，是各種糧食及農副產品的主要污染物之一，據聯(lián)合國糧農組織（FAO）報道世界上約有25 %的農作物受到真菌毒素的污染[1]。真菌毒素具有致癌及極強的細胞毒性，極易威脅到人體的健康[2-3]。我國是小麥制品的消耗大國，小麥運輸儲存過程中也極易受到真菌毒素的污染，目前已有報道在小麥制品中檢出了黃曲霉毒素、嘔吐毒素等真菌毒素[4]。

目前對于真菌毒素的檢測主要方法有酶聯(lián)免疫法[5]，氣相色譜法[6]，高效液相色譜法[7-8]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[9-10]。酶聯(lián)免疫法雖然設備要求簡單，但是準確度上無法保證，大批量檢測時容易出現(xiàn)假陽性結果；氣相色譜法由于對分析物質要求具有低沸點且熱穩(wěn)定性好，所以在多組分真菌毒素的分析上應用受到了限制；高效液相色譜法穩(wěn)定性較好，但是單一通過保留時間定性很難應用于多組分的真菌毒素的測定；高效液相色譜-串聯(lián)質譜法能夠克服上訴方法的缺點，具有高分離度、高準確度的特點。因此建立以乙腈-水溶液為提取液、多功能凈化柱凈化、超高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時檢測小麥粉中11種真菌毒素的方法。

1　材料與方法

1.1主要儀器

TSQ Quantum三重四極桿串聯(lián)質譜儀、戴安U3000超高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技公司；多功能凈化柱（型號PriboFast 100，2 mL）：Pribolab公司；離心機：德國Sigma公司；（SB25-12YDTD）超聲水浴鍋：寧波新芝生物科技公司；（UP1600）超純水機：艾普科技公司。

1.2標準品及配置

黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、伏馬菌素B1、伏馬菌素B2、伏馬菌素B3、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（純度≥92 %）：均購自ROMER公司。將上述標準溶液用乙腈配置為10 μg/mL的混合標準儲備液，使用時用流動相初始比例配置標準曲線。

1.3樣品前處理

稱取粉碎并混合均勻后的樣品5.0 g于50 mL離心管，加入提取液（乙腈∶水=60∶40，體積比）20 mL，超聲輔助提取30 min，于10 000 r/min離心5 min，取上清液過多功能柱凈化，準確移取凈化后的樣液2 mL于40℃下氮氣吹干，使用流動相初始比例定容至1 mL，過0.45 μm微孔濾膜，用UPLC-MS/MS測定。

1.4超高效液相色譜及質譜條件

1.4.1超高效液相色譜條件

色譜柱：XTerra MS C18（150×2.1 mm，5 μm）色譜柱（Waters公司）；進樣量：10μL；流動相：A為20mmol/L乙酸銨，B為乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃。梯度進樣程序見表1。

表1梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution conditions

1.4.2質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI±模式同時掃描）；多反應監(jiān)測MRM模式；噴霧電壓正離子模式3 500 V，負離子模式3 000 V；離子源溫度280℃；脫溶劑溫度300℃；鞘氣（N2）40 arb；輔助氣（N2）5 arb。質譜條件參數(shù)見表2。

表2質譜參數(shù)Table 2 Mass condition

2　結果與討論

2.1多功能凈化柱的選擇

多功能凈化柱相對于免疫親和柱具有操作簡便、成本較低的特點，但是不同的柱填料對小麥粉中不同種類的真菌毒素凈化效力有所不同。在實際測試中發(fā)現(xiàn)PriboFast 100多功能凈化柱對小麥粉中11種真菌毒素有良好的回收率且相對于免疫親和柱具有成本低、能夠同時凈化小麥粉中多組分真菌毒素的特點。所以，筆者選擇了以PriboFast 100多功能凈化柱。

2.2色譜條件的優(yōu)化

由于要同時兼顧質譜正負離子同時掃描，所以流動相選擇了20 mmol/L的乙酸銨與乙腈梯度洗脫，試驗中得到的鋒型良好。11種真菌毒素標準溶液MRM色譜圖見圖1。

2.3質譜條件優(yōu)化

本試驗由于采用正負離子同時掃描，而不分段同時正負離子掃描會大大降低儀器靈敏度，所以采取了分時段采集模式，并配合XTerra MS C18色譜柱在保留時間完成正離子采集區(qū)域與負離子采集區(qū)域上的保留時間分離，相關質譜條件參數(shù)見表2。

2.4方法線性及檢出限

將11種真菌毒素的混合標準溶液配置成系列濃度，以響應強度的峰面積為縱坐標，以質量濃度（μg/L）作為橫坐標，繪制標準系列曲線，線性方程見表3。

將線性范圍最低濃度點稀釋并上機測定，以3倍信噪比（S/N）響應時所對應的濃度（μg/kg）作為檢出限，以10倍信噪比（S/N）響應時所對應的濃度（μg/kg）作為定量限，結果見表3。

2.5方法回收率及精密度

圖1 11種真菌毒素標準溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 11 mycotoxins

表3 11種真菌毒素的線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Linear equation，correlation coefficient，LOD and LOQ of 11 mycotoxins

選擇空白小麥粉樣品分高、中、低3個濃度進行加標回收試驗，高、中、低組加標回收試驗分別添加2、10、20 μg/kg質量濃度的混合標準物質，按照1.3所述樣品前處理方法進行處理后測定加標回收率，并同時進行6次平行測定，考察方法精密度，結果見表4。

表4 11種真菌毒素加標回收率及精密度（n = 6）Table 4 Recoveries and RSD of 11 mycotoxins（n = 6）

試驗結果顯示各種真菌毒素的回收率范圍為72.4 %～90.7 %，精密度范圍為6.2 %～11.8 %。

3　結論

以小麥粉為研究對象，建立了超高效液相色譜串聯(lián)質譜測定小麥粉中11種真菌毒素的方法。該方法測定11種真菌毒素線性關系良好，加標回收測定率范圍為72.4 %～90.7 %，方法精密度范圍為6.2 %～11.8 %，11種真菌毒素的定量限范圍為1.2 μg/kg～2.0 μg/kg，樣品前處理條件具有較高的基質干擾消除能力且準確度、靈敏度高，能夠滿足小麥粉中真菌毒素的檢測要求。

參考文獻：

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Determination of 11 Mycotoxins in Wheat Flour by Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

LI Lei1，LI Hai-chang2，ZHOU Yi-bing1，LIN Ye1
（1. Guizhou Provincial Physical and Chemical Inspection of Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China；2. Guiyang Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550002，Guizhou，China）

Abstract：Objects Establish method to detect the 11 kinds of mycotoxins in wheat flour by ultra performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry. Methods Samples were crushed and sieved extracted by aqueous acetonitrile，purified by multifunctional cleaning column PriboFast 100，separated by Xterra MS C18 chromatographic column，gradient eluted by 20 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile，and detected by ultra high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry. Results The 11 kinds of mycotoxins show good linear relationship between the concentration range，components correlation coefficient R2＞0.998，standard addition recovery range of 72.4 %-90.7 %，precision range 6.2 %-11.8 %，and LOQ components range 1.2 μg/kg-2.0 μg/kg. Conclusion The method shows high sensitivity，accurate，reproducible，which suitable for detection of 11 kinds of mycotoxins in wheat flour.

Key words：wheat flour；mycotoxins；UPLC-MS/MS

作者簡介：李磊（1986—），男（漢），主管技師，碩士研究生，從事環(huán)境及食品衛(wèi)生檢驗研究。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.040