二硫鍵及其連接方式對防御素抗菌功能的影響研究進展

陳惠嫻毛若雨滕達王秀敏馮興軍王建華

（1. 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點開放實驗室，北京 100081；2. 東北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，哈爾濱 150030；3. 中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所基因工程室，北京 100081）

二硫鍵及其連接方式對防御素抗菌功能的影響研究進展

陳惠嫻1，2，3毛若雨1，3滕達1，3王秀敏1，3馮興軍2王建華1，3

（1. 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點開放實驗室，北京 100081；2. 東北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，哈爾濱 150030；3. 中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所基因工程室，北京 100081）

防御素是一類內(nèi)源性、高度穩(wěn)定、富含半胱氨酸的抗菌肽，對抗感染和宿主免疫調(diào)控具有重要作用。其序列內(nèi)一般有6-8個保守半胱氨酸形成3-4對二硫鍵。二硫鍵對數(shù)和連接方式在維持防御素結(jié)構(gòu)和抗菌功能方面具有重要作用，此外，高活性線型及低二硫鍵含量突變體在減少生產(chǎn)成本，簡化生產(chǎn)流程方面具有重要作用。綜述了防御素分子特征、結(jié)構(gòu)和功能，在此基礎(chǔ)上報道二硫鍵氧化還原狀態(tài)、數(shù)量及其連接方式影響防御素抗菌活性的最新研究進展。

防御素；二硫鍵；氧化還原；連接；抗菌活性

防御素（defensin）是一類高度穩(wěn)定、富含半胱氨酸（Cys）在宿主防御系統(tǒng)中起重要作用的內(nèi)源性抗菌肽［1］，存在于真菌，植物和動物等組織［2］，分子量約2-6 kD，含較多正電荷氨基酸殘基，多由6-8個保守Cys殘基形成3-4對二硫鍵［3］，因其具有效抵御細菌［4］、真菌［5，6］及病毒［7-9］等高效廣譜抗菌功能和免疫調(diào)理作用備受關(guān)注。二硫鍵是防御素的共有重要結(jié)構(gòu)和功能基團對防御素分子抗菌功能、正確折疊和空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起重要作用。據(jù)報道用二硫蘇糖醇 DTT還原人防御素HBD3中的二硫鍵會導致其三級結(jié)構(gòu)被破壞［10］。缺一對二硫鍵的人防御素HBD1的三級結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在水溶液中呈無規(guī)則卷曲狀態(tài)［11］。故揭示二硫鍵和防御素之間的定向構(gòu)效關(guān)系及其突變體對病原菌及惡性腫瘤細胞等病原體的殺傷機制［12，13］一直是該領(lǐng)域關(guān)注熱點。此外，具有高活性的單二硫鍵和線型肽突變體對簡化生產(chǎn)流程、減少成本至關(guān)重要。因此，本文就防御素功能、結(jié)構(gòu)，二硫鍵突變方式、突變體對其結(jié)構(gòu)與功能影響作一綜述，對該領(lǐng)域研究和發(fā)展方向作出展望。

1 防御素來源及結(jié)構(gòu)

1.1 防御素分類

依據(jù)防御素來源可以將其分為5大類，分別為：哺乳動物源、植物源、無脊椎動物源、類防御素及其他防御素［14］，根據(jù)分子內(nèi)半胱氨酸的位置和連接方式又可將哺乳動物防御素分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素［15］。

1.2 防御素二硫鍵分子特征

α-防御素的成熟肽由29-36個氨基酸組成，6個保守Cys殘基組成3個分子內(nèi)二硫鍵，連接方式為Cys1-Cys6，Cys2-Cys4，Cys3-Cys5；β-防御素由38-42個氨基酸殘基組成，3對分子內(nèi)二硫鍵連接方式為 Cys1-Cys5，Cys2-Cys4，Cys3-Cys6；θ-防御素含有18個氨基酸殘基，3對分子內(nèi)二硫鍵 Cys1-Cys6，Cys2-Cys5，Cys3-Cys4 連接成環(huán)形結(jié)構(gòu)［16］；成熟的昆蟲防御素大多由38-42個氨基酸組成，6個半胱氨酸殘基組成3對二硫鍵，其連接方式為Cys1-Cys4，Cys2- Cys5，Cys3-Cys6，這種連接方式與真菌防御素Plectasin的二硫鍵連接方式相同；植物防御素由45-54個氨基酸殘基組成，一般含4對二硫鍵，其二硫鍵連接方式為Cys1-Cys8，Cys2-Cys5，Cys3-Cys6，Cys4-Cys7［17］。

1.3 防御素的結(jié)構(gòu)與功能

防御素一級結(jié)構(gòu)可分為結(jié)構(gòu)殘基和功能殘基。結(jié)構(gòu)殘基與高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性緊密相關(guān)，這類氨基酸殘基高度保守。功能殘基主要包括帶電荷、疏水性氨基酸殘基，由此決定防御素的抗菌功能、鹽離子敏感性［18］。例如，防御素中Cys序列高度保守，由此決定pH和熱穩(wěn)定性［19］。禽類防御素AvBD2在-20至100℃和pH3-12范圍內(nèi)能保持顯著抑金黃色葡萄球菌活性［20］。

防御素二級結(jié)構(gòu)多含一個α-螺旋結(jié)構(gòu)和一對反向平行的β-折疊片層結(jié)構(gòu)及位于其間起連接作用的Loop區(qū)。其中α-螺旋結(jié)構(gòu)具兩親性，即其兩面分別為親水性殘基面和疏水性殘基面，該結(jié)構(gòu)有助于防御素分子與靶生物細胞膜接觸并作用［21］。β-折疊結(jié)構(gòu)區(qū)域則富含帶有正電荷的氨基酸殘基［22］。Loop區(qū)的構(gòu)象和柔韌性對防御素的抗菌功能具有決定性作用［23］。大多數(shù)防御素都含具有兩親性的α-螺旋或富含正電荷的β-折疊，這兩種結(jié)構(gòu)特征有利于與微生物細胞膜互作，兩親性結(jié)構(gòu)和較多凈電荷數(shù)都是防御素實現(xiàn)抗菌功能的必備條件［24］。

防御素三級結(jié)構(gòu)包含一個典型的CSαβ結(jié)構(gòu)，即二硫鍵穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)［25］。防御素四級結(jié)構(gòu)就是其單體間二聚所形成的二聚體。四級結(jié)構(gòu)可使防御素電荷表面和疏水表面的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而影響抗菌功能［26］。

2 二硫鍵對防御素活性的影響

在多項國家基金與科研計劃資助下，本小組對含有3對二硫鍵的首例真菌防御素Plectasin及其衍生肽進行一系列研究。在畢赤酵母中實現(xiàn)Plectasin［27］及NZ2114［28］的高效分泌表達，產(chǎn)量分別達748和2 390 mg/L，質(zhì)譜驗證Plectasin及NZ2114具有完整3對二硫鍵，一級結(jié)構(gòu)與理論相符，所建立生產(chǎn)體系達到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)水平，有效降低抗菌肽生產(chǎn)成本。在此基礎(chǔ)上，對NZ2114進行改造，設(shè)計其衍生肽MP1102［29］，產(chǎn)量為695 mg/L，質(zhì)譜驗證完整形成3對二硫鍵，對臨床分離Staphylococcus aureus最低抑菌濃度（MIC）為0.04-0.23 μmol/L，活性較NZ2114顯著增強，進一步拓寬抗MRSA候備藥物選用范圍。

為進一步評價二硫鍵對防御素抗菌功能的影響，本小組Yang等［30］用二甲基亞砜（DMSO）氧化或用DTT還原Plectasin發(fā)現(xiàn)，氧化型Plectasin與氧化前抑菌圈大小一致，而被DTT還原1 h后的Plectasin抑菌圈遠小于還原前和氧化型Plectasin的抑菌圈。Cao等［31］用DMSO氧化和用DTT還原MP1106發(fā)現(xiàn)，10%和20% DMSO處理后，MP1106對S. aureus ATCC25923的抑菌圈與對照無明顯改變，但經(jīng)5 mmol/L 和10 mmol/L DTT還原處理的MP1106活性比對照減弱（直徑13 mm對15 mm），說明DTT對重組MP1106活性有輕微影響。王少然等［16］用丙氨酸替代Plectasin中Cys，并檢測突變體對S. aureus ATCC 25923抑菌活性發(fā)現(xiàn)，7個突變體均有抗S. aureus活性，其中突變體C4/30A、C19/39A、C4/19/30/39A和 C15/19/37/39A抗 性 最強，相比Plectasin略微降低；突變體all C→A抑菌活性次之；突變體C15/37A和C4/15/30/37A對 S. aureus的抑菌活性基本喪失。經(jīng)Garnier 軟件預測Plectasin及其二硫鍵突變體二級結(jié)構(gòu)表明（C19/39A）Plectasin、（C4/19/30/39A）Plectasin、（C15/19/37/39A）Plectasin、（all C→A）Plectasin 等4個突變體的螺旋度增加，其中（all C→A）Plectasin螺旋度是Plectasin兩倍；除（C15/19/37/39A）Plectasin外，其余突變體折疊有所上升；隨著二硫鍵增多轉(zhuǎn)角比例明顯降低，所有突變體的無規(guī)則卷曲有所下降。

然而，二硫鍵對防御素抗菌功能的作用影響機制尚未完全闡明。對某些防御素改變其氧化還原狀態(tài)或二硫鍵連接方式并不影響其抗菌功能［22，32］。但另外也有一些報道說明二硫鍵對某些防御素的抗菌功能來說是必需的［30，33］。目前研究二硫鍵對防御素功能的影響主要有以下幾種方式：（1）氧化還原：如使用還原劑DTT或氧化劑DMSO處理防御素分子，打開或連接分子內(nèi)二硫鍵，測定抗菌活性的變化［30，31］；（2）半胱氨酸替代：用丙氨酸（Ala）或絲氨酸（Ser）替代防御素序列中Cys使其不能形成二硫鍵［34，35］；（3）二硫鍵連接方式重排：改變防御素分子中二硫鍵天然連接方式，觀察抗菌活性的變化［22，36］。

2.1 二硫鍵的氧化還原對防御素抗菌功能的影響

Schroeder等［33］發(fā)現(xiàn)，加入還原劑DTT，人β-防御素-1（hBD-1）能抑制G+菌Bifidobacterium adolescentis生長，抑制圈大小和程度隨DTT濃度而增大，不加DTT對生長沒影響。同樣用DTT處理人β-防御素-3（hBD-3）和溶菌酶卻使抗菌活性降低。為排除DTT的影響，厭氧條件下，培養(yǎng)基不加DTT，發(fā)現(xiàn)合成的氧化型hBD-1對雙歧桿菌的生長沒影響，而線型hBD-1對所檢菌株均有抗菌活性。類似結(jié)果也在乳酸桿菌中觀察到。但沒有檢測到任何形式的hBD-1對G-菌Bacteroides vulgatus具抗菌活性。對兼性厭氧菌Escherichia coli K12，氧化型和還原型hBD-1都有抗菌活性。還原型hBD-1對被檢測的5株共生致病真菌Candida albicans中的4株有抗菌活性，而氧化型的沒有。此外，還原型hBD-1碳端結(jié)構(gòu)有別于氧化型和含游離半胱氨酸的hBD-1，認為這是影響其抗菌活性的重要原因。且還原型hBD-1屏蔽了健康上皮細胞抵抗共生菌和致病性真菌的定植。

Peng等［32］用DTT（5 μmol/L和10 μmol/L）和DMSO（10%和20%）處理重組豬β-防御素-2（rp-BD2）后與S. aureus ATCC 6538孵育，發(fā)現(xiàn)抑菌圈直徑大小均與對照相同。表明氧化和還原狀態(tài)對rpBD2的抗菌活性沒有影響。

2.2 氨基酸突變對防御素抗菌功能的影響

2.2.1 Ala突變對防御素抗菌功能的影響 Maemoto等［34］用Ala替代鼠源cryptdin-4（Crp4）中Cys改變其二硫鍵數(shù)量發(fā)現(xiàn)，突變體體外抗菌活性（E. coli ML35，Salmonella enterica serovar Typhimurium（serovar Typhimurium）CS022、JSG210和 14082，Vibrio cholerae，S. aureus 710a，Listeria monocytogenes 104035）均等于或大于天然Crp4。25 μg/mL 或更低濃度的Crp4與突變體都可使病原菌存活率降低至少1 000倍，但其中3個突變體 C6A/C21A、C4A/C11A/ C28A/C29A和C4A/C6A/C11A/C21A/C28A/C29A抗 野生型serovar Typhi-murium的活性比母體肽更高。

Lee等［37］報道來自Copris tripartitus（三開蜣螂）含43個氨基酸的coprisin缺少任意一對二硫鍵都減弱其抗細菌活性，但仍保留抗真菌活性。用丙氨酸替代半胱氨酸形成Cop［Ala3，34］，Cop［Ala20，39］和Cop［Ala24，41］突變體，供試菌G-性菌有E. coli，Salmonella typhimurium，Pseudomonus aeruginosa；G+菌 有S. aureus，S. epidermidis，Bacillus subtilis） 和真菌（C. albicans，C. parapsilosis，Malassezia furfur，Trichosporon beigelii），體外實驗發(fā)現(xiàn)coprisin對細菌MIC為0.8-3.1 μmol/L，對真菌MIC為5-10 μmol/L。而Cop［Ala3，34］，Cop［Ala20，39］和Cop［Ala24，41］的細菌MIC>100 μmol/L，但抑制真菌作用略有降低。說明3對二硫鍵對coprisin抗細菌活性必不可少，但對抗真菌活性則沒有明顯作用。

2.2.2 Ser突 變 對 防 御 素 抗 菌 功 能 的 影響 Wanniarachchi等［35］用絲氨酸或丙氨酸殘基替代人α-防御素-5（HD5）中Cys改變二硫鍵數(shù)量，低濃度HD5ox對E. coli ATCC 25922 和 S. aureus ATCC 25923顯示抗菌活性（在2和2.5 μmol/L時菌落值為10 CFU/mL）。去除任何一對二硫鍵都會降低其抗S.aureus活性。包括HD5［Serhexa］在內(nèi)的大部分絲氨酸突變體顯示不同程度抗E. coli活性，只有HD5［Ser5；20］ox（3-30）（10-31）表現(xiàn)弱抗菌活性。根據(jù)圓二色譜結(jié)果推測減少二硫鍵可增加肽構(gòu)象靈活性。

Haag等［36］用絲氨酸替代蒺藜狀苜蓿Medicago truncatula NCR247中 Cys，2 μmol/L的 NCR247使Sinorhizobium melilot細 胞 變 大， 而NSR247在4 μmol/L時才使S. meliloti細胞開始增大，且程度比NCR247低；同樣1 μmol/L的NCR247即可增加S. meliloti DNA含量，而NSR247在4 μmol/L才開始；此外，用10 μmol/L肽處理S. meliloti，NSR247抗菌活性明顯比NCR247低。

2.2.3 其他氨基酸突變對防御素抗菌功能的影響 Chandrababu等［38］替代hBD-3中的半胱氨酸（依次為A、Y、V、V、K和V），命名為Def-A。兩種肽都只在低離子強度（含0.13 mmol/L Ca2+和0.10 mmol/L Mg2+）時才有活性，且Def-A比rHBD-3的MIC值略高（突變體疏水性和正電荷均有所增加）。在高離子強度（0.5 mmol/L Ca2+和0.4 mmol/L Mg2+）時，抗菌活性顯著降低（MIC≥ 300 μg/mL）。

2.3 二硫鍵連接方式對防御素抗菌功能的影響

Haag等［36］將M. truncatula中NCR247的二硫鍵連接方式由1-2，3-4調(diào)整為1-3，2-4后，用不同濃度的NCR2471-3，2-4處理S. meliloti，發(fā)現(xiàn)S. meliloti細胞大小和DNA含量均小于同濃度的NCR2471-2，3-4。但Hoover等［22］將hBD3二硫鍵連接方式由1-5，2-4，3-6改為1-6，2-5，3-4，卻發(fā)現(xiàn)兩者對E. coli，S. aureus和C. albicans有相近的抗菌活性（E. coli，S.aureus和C. albicans的LC90分別為5 μg/mL，12 μg/mL和15 μg/mL）。

Sharma等［39］改變二硫鍵對數(shù)及連接方式設(shè)計了人β-防御素-4（HBD4）同系物系列，發(fā)現(xiàn)所有同系物（增加了EF）抗菌功能均有增強。其中，含一對二硫鍵突變體顯示出最大抗菌活性。同時，這些同系物二級結(jié)構(gòu)無明顯差別。只含一對二硫鍵同系物H4-1d（C3-C6）對細菌（E. coli MG 1655，P. aeruginosa NCTC 6750和 S. aureus NCTC 8530）（LC）和真菌（C. albicans）（MFC）致死濃度均≤5 μmol/L，而含兩對二硫鍵的H4-2d（C2-C4和C3-C6）和含3對二硫鍵的H4-3d（C1-C5，C2-C4及C3-C6）顯示了略低的抗菌活性，其LC和MFC為5-12.5 μmol/L。H4-1d對P. aeruginosa和S. aureus抗菌活性是天然HBD4的四倍，對E. coli抗菌活性是天然HBD4的兩倍。H4-2d和H4-3d對P. aeruginosa及S. aureus的抗菌活性也比HBD4高。這表明改變HBD4二硫鍵對數(shù)和連接方式對抗菌活性的影響尚未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律。

3 結(jié)語

防御素制備途徑包括天然提取、化學合成和基因工程表達。天然提取方法獲得的產(chǎn)物濃度偏低，只能滿足實驗室研究。化學合成方法成本偏高，且對含有二對以上的二硫鍵結(jié)構(gòu)合成很難；轉(zhuǎn)基因表達雖成本較低，也易發(fā)生錯誤折疊及二硫鍵連接難題［1，40］。顯然揭示增減防御素二硫鍵及其氧化還原狀態(tài)影響抗菌活性的機制有助于選擇科學的生產(chǎn)制備方式。如（1）發(fā)現(xiàn)二硫鍵對防御素抗菌活性影響不大，可選用化學合成方法生產(chǎn)，不強求二硫鍵配對。（2）對于減少一或兩對二硫鍵后抗菌活性增減劇烈的防御素，需巧用化學合成或基因工程表達，專注二硫鍵連接成功率和準確率。（3）對高含二硫鍵且對抗菌功能至關(guān)重要的防御素，則需突破二硫鍵合成和肽折疊技術(shù)瓶頸?？傊C合考慮二硫鍵增減對構(gòu)象和理化性質(zhì)穩(wěn)定性的影響，精準把控二硫鍵突變體構(gòu)效關(guān)系，夯實產(chǎn)品制備技術(shù)基礎(chǔ)。

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（責任編輯 狄艷紅）

Review on Effects of Disulfide Bond and Its Connection on Antimicrobial Activity in Defensins

CHEN Hui-xian1，2，3MAO Ruo-yu1，3TENG Da1，3WANG Xiu-min1，3FENG Xing-jun2WANG Jian-hua1，3
（1. Key Laboratory of Feed Biotechnology，Ministry of Agriculture，Beijing 100081；2. Institute of Animal Nutrition，Northeast Agricultural University，Harbin 150030；3. Gene Engineering Laboratory，F(xiàn)eed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Defensins are a class of endogenous，highly stable and cysteine-rich antimicrobial peptides，which play an important role in anti-microbial infection and the regulation of host immune. Six to eight conserved cysteines in the sequence form 3 to 4 pairs of disulfide bonds. The number of disulfide bond and its connection play an crucial role in maintaining the structure and antibacterial functions of defensins. In addition，mutants with high activity and low disulfide bond content also play an key role in reducing production costs and simplifying the production processes. The molecular characteristics，structure and function of defensins and their effects of redox status，number and connection mode of disulfide bonds on the antimicrobial activity are reviewed.

defensin；disulfide bond；oxidation and reduction；linkage；antimicrobial activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.005

2016-01-08

國家自然科學基金項目（31372346，31302004，31572444，31572445），科技支撐計劃項目課題（2013BAD10B02），中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2013-FRI-02）

陳惠嫻，女，碩士研究生，研究方向：動物營養(yǎng)與飼料科學；E-mail：1090031362@qq.com

王建華，男，研究員，博士生導師，研究方向：微生物生物技術(shù)；E-mail：wangjianhua@caas.cn；2681298635@qq.com