差示掃描量熱法分析光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914 TXT基序?qū)箖龌钚缘挠绊?/h1>
2016-06-13 10:44:39杜榮俸劉忠淵毛新芳
生物技術(shù)通報 2016年9期
杜榮俸 劉忠淵 毛新芳
（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）
差示掃描量熱法分析光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914 TXT基序?qū)箖龌钚缘挠绊?/p>
杜榮俸 劉忠淵 毛新芳
（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）
研究光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914及其突變體的原核表達及活性，推測TXT基序的突變對昆蟲抗凍蛋白抗凍活性的影響。通過定點突變新疆荒漠昆蟲光滑鱉甲抗凍蛋白apafp914基因TXT基序的規(guī)則位點個數(shù)，并亞克隆至pET32a原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，Ni-NTA純化得到融合蛋白TrxA-ApAFP914及3種突變體蛋白；利用SwisS-Model服務(wù)器預(yù)測分析了ApAFP914蛋白的三維結(jié)構(gòu)；通過差示掃描量熱法測定TrxA-ApAFP914及其突變體的熱滯活性。結(jié)果顯示，4種融合蛋白分子量均在30 kD左右；且突變蛋白TrxA-A19T具有最高的熱滯活性，而突變體TrxA-T33F和TrxA-T33&45F的熱滯活性顯著低于未突變的TrxA-914。研究結(jié)果表明昆蟲抗凍蛋白的TXT基序越規(guī)則其具有的熱滯活性越高。
光滑鱉甲抗凍蛋白；TXT基序；差示掃描量熱法（DSC）
抗凍蛋白（antifreeze protein，AFPs）是耐寒（freeze-avoidance）生物為適應(yīng)冷環(huán)境而產(chǎn)生的小分子蛋白質(zhì)，能非依數(shù)性的降低溶液冰點但不改變?nèi)埸c，兩者產(chǎn)生的差值即為熱滯活性（Thermal hysteresis activity，THA），可以用來評價抗凍蛋白抗凍活性的強弱［1］。按照來源的不同可以分為魚類抗凍蛋白、昆蟲抗凍的蛋白、植物抗凍蛋白以及菌類抗凍蛋白。其中昆蟲抗凍蛋白主要在甲蟲（Tenebrio molitor）、云杉卷葉蛾（Choristoneura fumigerana）、美洲長椿（Oncopeltus fasciatus）和毛蟲（Dendroides canadensis）等耐凍昆蟲體內(nèi) 表達，其熱滯活性可達魚類抗凍蛋白的10-100倍［2］。一般認為抗凍蛋白吸附于冰晶表面，就需要外加一些推動力（如冰點下降），才能使冰繼續(xù)生長，這就是吸附抑制理論認為冰點下降的原因［3］。吸附抑制理論認為抗凍蛋白的作用方式具有共性，它們都有一定的疏水性，表面較平坦的面可作為結(jié)合冰的位點［4］。
光滑鱉甲（Anatolica polita borealis）屬擬步甲科鱉甲屬昆蟲，能適應(yīng)新疆古爾班通古特沙漠-40℃的寒冷冬季。其產(chǎn)生的抗凍蛋白種類豐富且具有高度相似的一級結(jié)構(gòu)，重復(fù)的TCT基序數(shù)量從4-8個不等，形成了每個螺環(huán)上的β平面，也形成了相似的冰結(jié)合區(qū)域和空間上的右手β螺旋結(jié)構(gòu)［5］。這種結(jié)構(gòu)與云杉卷葉蛾抗凍蛋白重復(fù)出現(xiàn)在每一螺圈當(dāng)中的TXT序列十分吻合［6］，與皮花天牛（Rhagium inquisitor）抗凍蛋白中出現(xiàn)的重復(fù)TxTxTxT序列相似［7］。由此推測這幾種昆蟲抗凍蛋白與冰晶的作用方式也十分相似［5］。在利用定點突變抗凍蛋白保守位點（TXT基序）使其抗凍活性顯著降低的特性已經(jīng)被廣泛報道［8］。而Friis通過定點突變將皮花天牛抗凍蛋白保守位點上不規(guī)則的His或Lys替換為更為規(guī)則的Thr可以使其抗凍活性顯著增強，說明TXT基序的規(guī)則排列可能影響抗凍活性的強弱［7］。
本研究利用定點突變將光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914保守區(qū)域不規(guī)則的ACT序列替換為規(guī)則的TCT序列。同時將規(guī)則的TCT序列替換為不規(guī)則的TCF序列，打亂原有TXT基序的規(guī)則排列。通過差示掃描量熱儀（DSC Q2000）法［9，10］比較光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914及其各突變體蛋白的熱滯活性，旨在探討在光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914中 TXT規(guī)則程度對抗凍活性的影響。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 質(zhì)粒及菌株 原核表達載體pET32a為新疆生物資源基因工程重點實驗室保存載體，菌株DH5α及BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Xho I，EcoR I，T4 DNA連接酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以及DNA標準品購于TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司。Ni-NTA柱料和色譜柱購自QIAGEN公司。引物合成及序列測定由北京六合華大基因科技有限公司完成。其他常用試劑均為分析純。
1.2 方法
1.2.1 定點突變TXT基序 采用重疊延伸PCR法對光滑鱉甲抗凍蛋白基因apafp914（GenBank：GU358704.1）功能區(qū)域進行定點突變。根據(jù)apafp914全長序列設(shè)計4對引物（表1），在P1和P2引物中插入EcoR I和Xho I酶切位點（劃線部分）用于擴增apafp914全長；引物P3和P4中引入第33位Thr向Phe突變（劃線部分），以apafp914為模板，P1與P4為引物擴增得到突變基因前半段，P3與P2為引物擴增得到突變基因后半段，將前后兩段突變基因混合后再以P1與P2為引物擴增得到apafp914-T33F單點突變體基因；引物P5和P6中引入第45位Thr向Phe突變（劃線部分），以apafp914-T33F為模板，擴增得到apafp914-T33&45F雙點突變體基因；引物P7和P8中引入第19位Ala向Thr突變（劃線部分）以apafp914為模板，擴增得到TXT基序排列更規(guī)則的apafp914-A19T突變體基因。如圖1所示，apafp914基因由264個堿基編碼86個氨基酸。分別以藍色字體表示上游引物，以紫色字體表示下游引物，劃線部分表示限制性內(nèi)切酶酶切位點以及擬突變的氨基酸位點。
1.2.2 三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 經(jīng)Blast比對，選取與ApAFP914相似性最高的熱滯蛋白YL-1型蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB NO. 1ezg.1.A）進行分子模擬；利用ExPASy蛋白分析程序的Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org/）服務(wù)器在線分析構(gòu)建apafp914基因推導(dǎo)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并用SwisSPDB viewer軟件展示ApAFP914蛋白的三級結(jié)構(gòu)的分子模型。
表1 引物列表
圖1 光滑鱉甲抗凍蛋白apafp914基因與氨基酸序列比對及引物位置示意圖
1.2.3 apafp914及其突變體基因的表達及條件優(yōu)化 將 測 序 正 確 的pET32a- apafp914；pET32aapafp914-T33F；pET32a- apafp914-T33&45F；pET32a- apafp914-A19T質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細胞。經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后的陽性單克隆接種于5 mL含50 mg/L Amp的LB培養(yǎng)基，37℃、220 r/min培養(yǎng)12-14 h，按體積比1∶100轉(zhuǎn)接入10 mL新鮮 LB（50 mg/L Amp）培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600達到0.6-0.8時，收集2 mL誘導(dǎo)前菌液12 000 r/min離心10 min后備用，其余培養(yǎng)液中加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，相同條件下誘導(dǎo)表達4 h，收集2 mL菌液12 000 r/min離心10 min，用1×SDS樣品緩沖液100 μL分別重懸誘導(dǎo)前沉淀與誘導(dǎo)后沉淀，煮沸15 min，15% SDSPAGE電泳分析表達結(jié)果。
1.2.4 融合蛋白的純化 6 000 r/min離心10 min收集1 L新鮮LB（50 mg/L Amp）培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達后的菌液，用4%（V/V）預(yù)冷的1×Ni-NTA 洗滌緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，pH8.0）重懸。超聲破碎，12 000 r/min離心15 min收集上清液進行純化，純化步驟參見The QIAexpressionistTM說明書（QIAGEN公司）。利用SDS-PAGE凝膠灰度掃描確定蛋白純度并用于實驗。
1.2.5 差示掃描量熱法測定各融合蛋白熱滯活性
經(jīng)純化的TrxA-914及其突變體TrxA-T33F、TrxAA19T各取5 μL 于樣品盤中密封后稱重，以空鋁盤為參比盤。待DSC Q2000儀器穩(wěn)定后，以3℃/min的速度將溫度降至-30℃ 再升溫至10℃記錄樣品的過冷卻點和熔點（Tm），計算體系的熔融焓（△Hm）。再勻速降溫至-30℃保持5 min，待樣品穩(wěn)定后升溫至體系處于冰水混合物狀態(tài)的保持溫度（Th），在Th溫度下保持5 min待樣品再次穩(wěn)定后降低溫度至-30℃；重復(fù)上述過程在不同的Th溫度下停留，并分別記錄不同Th下樣品體系的結(jié)晶焓（△Hf）和結(jié)晶含量（結(jié)晶率Φ=（1-ΔHf/ΔHm）×100%）。熱滯活性THA=Th-To（其中To為體系在保持溫度下融化部分再次結(jié)冰時對應(yīng)的溫度）。TrxA-914及其突變體蛋白以0.1 mg/mL為測定濃度分別測量。每個樣品重復(fù)3次。
2 結(jié)果
2.1 ApAFP914蛋白三維結(jié)構(gòu)的模擬
根據(jù)同源建模的預(yù)測選取與ApAFP914一致性最高（71.95%）的熱滯蛋白YL-1型蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB NO. 1ezg.1.A）進行分子模擬。如圖2-A所示，ApAFP914蛋白由6個規(guī)則的β片層組成環(huán)狀的β螺旋結(jié)構(gòu)，藍色標記為冰結(jié)合域中的Thr，紅色標記為的第19位Ala。由如圖2-B保守序列的分析可知，ApAFP914符合昆蟲抗凍蛋白的一般結(jié)構(gòu)規(guī)律，藍色標記為預(yù)測的7個保守TXT基序，紅色標記為重疊延伸PCR獲得的三個突變氨基酸位點（A19，T33，T45）。
圖2 ApAFP914蛋白三維結(jié)構(gòu)的模擬（A）及突變體氨基酸序列比對（B）
2.2 SDS-PAGE檢測apafp914基因及其突變體的表達
將pET32a-apafp914質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21表達菌株中進行光滑鱉甲抗凍蛋白的原核表達。野生型融合蛋白TrxA-ApAFP914-WT（簡稱TrxA-914）的表達條件優(yōu)化結(jié)果如圖3-A，由不同IPTG濃度誘導(dǎo)后的融合蛋白出現(xiàn)在分子量26.0-35.0 kD之間。從圖中可以看出，加入0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后的融合蛋白表達量最高。由圖3-B可以看出，突變蛋白TrxA-ApAFP914-T33F（簡稱TrxA-T33F）；TrxAApAFP914-T33&45F（簡稱TrxA-T33&45F）；TrxAApAFP914-A19T（簡稱TrxA-A19T）蛋白條帶的分子量在30 kD左右，與TrxA-914分子量保持一致。
2.3 融合蛋白的純化及濃度測定
誘導(dǎo)后的pET32a-apafp914/BL21菌體經(jīng)過超聲破碎的上清和沉淀中均發(fā)現(xiàn)了帶有Trx標簽的融合蛋白Trx-914。為不影響4種融合蛋白之間的熱滯活性比較，實驗選取在上清中表達的融合蛋白進行熱滯活性分析。利用His標簽與Ni-NTA的親和層析純化融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測及Western blot檢測結(jié)果（圖4）顯示，TrxA-914及其突變體的洗脫液發(fā)現(xiàn)條帶分子量在30 kD左右，通過凝膠灰度掃描分析其純度均在95%以上，認為已得到條帶單一的融合蛋白。
2.4 差示掃描量熱法測定各融合蛋白熱滯活性
如圖5-A所示，采用DSC Q2000差示掃描量熱法檢測融合蛋白TrxA-914及其突變體的熱滯活性時選用BSA作為陰性對照，溶液隨箭頭方向先升溫后降溫至Th溫度停留后再降溫則立即出現(xiàn)吸放熱峰（即To=Th），說明BSA不能改變?nèi)芤罕c不具有熱滯活性。而融合蛋白TrxA-914及其突變體在溫度下降時均表現(xiàn)出熱滯活性。如圖5-B所示，曲線a到e表示Th溫度由低到高所形成的多條熱流曲線。當(dāng)Th溫度越高時溶液冰晶含量越低，此時的Th溫度也越接近熔點溫度，To可反映出溶液再次因結(jié)冰而放熱的溫度即為冰點溫度。
圖3 融合蛋白TrxA-ApAFP914表達條件優(yōu)化（A）及其突變體蛋白表達（B）
圖4 融合蛋白 TrxA-914 及其突變體的純化（A）及Western Blot檢測結(jié)果（B）
圖5 DSC熱流曲線判斷溶液熱滯活性
如圖6所示，實驗均采取了結(jié)冰率為5%以下的熱流曲線b作為最終熱滯活性的計算依據(jù)；經(jīng)DSC Q2000儀器最終測定了光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914及其突變體在0.1 mg/mL濃度下的抗凍活性。表2給出了各融合蛋白熱流曲線b的相關(guān)參數(shù)，Th為保持溫度，To為結(jié)冰溫度，熱滯活性THA=Th-To；曲線下方與x坐標軸圍成的面積可表示為結(jié)晶放熱焓△Hr，由融化曲線與x坐標軸圍成的面積為熔化吸熱焓△Hm，經(jīng)冰核率（Nuclei，Φ）公式：Nuclei Φ（%）=［1-（-△Hr）/△Hm］×100%可計算出溶液的冰核率。從表2中可以看出抗凍活性依次為TrxA-A19T（0.55℃）>TrxA-914（0.46℃）>TrxA-T33F（0.38℃）>TrxA-T33&45F（0.31℃），恰好反映出TXT基序的規(guī)則程度，說明昆蟲抗凍蛋白保守區(qū)的TXT基序規(guī)則程度顯著影響了抗凍蛋白的熱滯活性。
3 討論
已知AFP的氨基酸殘基、空間構(gòu)象等雖然有一定差異，但都具一定的抗凍活性，都能有效地與冰晶進行不可逆結(jié)合，并進一步防止冰晶的生長，有的抗凍蛋白具有與冰晶表面結(jié)構(gòu)互補的平面，如I型抗凍蛋白、II型抗凍蛋白、Ⅲ型抗凍蛋白；有的則通過錨定機制與冰晶結(jié)合；而穩(wěn)定AFP-冰晶復(fù)合物的主要作用力為疏水相互作用和范德華力［11］。抗凍蛋白的熱滯活性的影響因素主要包括：（1）同一物種產(chǎn)生的不同亞型抗凍蛋白之間的相互作用效果明顯高于單一亞型的抗凍蛋白單獨作用效果［12］；（2）一些小分子量溶質(zhì)可作為抗凍蛋白的增效劑如檸檬酸鹽、甘油和山梨醇能顯著阻止冰核的形成，提高昆蟲的熱滯活性；（3）抗凍蛋白自身的濃度和肽鏈長度，抗凍蛋白濃度越大，熱滯活性越強，高分子量糖肽比低分子量糖肽熱滯活性更強［13］。許多研究表明增加AFP的重復(fù)序列可增強其熱滯活性，但β螺旋結(jié)構(gòu)的抗凍蛋白隨著螺旋重復(fù)數(shù)在一定范圍內(nèi)的增加其抗凍活性也會相應(yīng)的增加［14］，一般認為9個螺旋時抗凍活性最強，大于10-12個時抗凍活性反而會下降［15］。
表2 融合蛋白TrxA-ApAFP914及其突變體熱滯活性及結(jié)冰率比較
圖6 融合蛋白TrxA-914及其突變體TrxA-T33F；TrxA-A19T；TrxA-T33&45F的DSC熱流曲線
本研究通過同源建模預(yù)測的蛋白的晶體結(jié)構(gòu)可以看出，ApAFP914蛋白是由6個規(guī)則的β片層組成的β螺旋結(jié)構(gòu)，推測其規(guī)則排列的7個保守TXT基序為冰結(jié)合面，符合昆蟲抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)規(guī)律［16］。當(dāng)以疏水氨基酸Phe替換33位和45位的保守氨基酸，改變了TXT基序中Thr位置的疏水性，或?qū)⒌?9位的Ala替換為更保守氨基酸后，均不影響蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，但改變了TXT基序的規(guī)則位點個數(shù)，從而使蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性也發(fā)生了變化。實驗組融合蛋白TrxA-914及其突變體均表現(xiàn)出熱滯活性，且TrxA-A19T的熱滯活性顯著高于野生型TrxA-914，而突變體TrxA-T33F和TrxA-T33&45F的熱滯活性顯著低于野生型TrxA-914。實驗證明光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914 TXT基序的規(guī)則位點個數(shù)可以直接影響到抗凍蛋白的熱滯活性，且隨TXT基序的規(guī)則程度增加/減少而增強/減弱。
溶液在平衡狀態(tài)下的熔點溫度和冰點溫度是相等的，隨著溶質(zhì)的濃度增加二者會同時降低。而抗凍蛋白可以非依數(shù)性降低溶液的冰點溫度而不改變?nèi)埸c溫度，因此直接測量溶液的冰點溫度和熔點溫度，相減即可算出抗凍蛋白的熱滯活性?？箖龅鞍谉釡钚缘臏y量方法包括：（1）通過納升滲透壓系統(tǒng)顯微觀察冰晶緩慢生長或縮小時的溫度可推測冰點和熔點溫度［17］；（2）通過差示掃描量熱法（DSC）測定升溫或降溫過程中溶液的熱焓變化情況也可判斷冰點和熔點溫度［10］；（3）此外，還可以通過微升滲透壓儀檢測溶液的滲透壓再換算出溶液的冰點溫度，并將未添加抗凍蛋白的溶液冰點溫度作為熔點溫度，由此計算并推測抗凍蛋白的熱滯活性［18］。本實驗采用DSC法檢測到融合蛋白TrxA-ApAFP914具有熱滯活性，并通過多次穩(wěn)定的測量數(shù)據(jù)（儀器誤差僅0.01℃）可以說明ApAFP914蛋白結(jié)構(gòu)的改變對熱滯活性產(chǎn)生了影響。該方法在探究昆蟲抗凍蛋白結(jié)構(gòu)對熱滯活性的影響時具有可行性。當(dāng)溶液中冰核量高于10%時，降溫過程中冰晶出現(xiàn)爆發(fā)性生長，說明此結(jié)冰率下ApAFP914的含量不足以完全抑制冰晶的生長。但當(dāng)溶液的冰核量低于5%時再降溫，溶液出現(xiàn)只降溫不放熱的現(xiàn)象即溫度下降但不結(jié)冰，說明溶液冰點顯著下降，并且THA隨結(jié)冰率的下降而升高［9］。當(dāng)實驗選用冰核量最少的條件測定熱滯活性時，結(jié)果顯示TrxA-A19T突變體顯著的表現(xiàn)出最高的熱滯活性，并且TrxA-T33F和TrxA-T33&45F打亂TXT基序保守位點排列后的熱滯活性顯著減弱，這一結(jié)果說明光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914 TXT基序中保守位點的數(shù)量顯著影響了熱滯活性。經(jīng)重復(fù)實驗得出TrxA-A19T突變體比野生型TrxA-914的抗凍活性顯著增強，可以推斷自然條件下的光滑鱉甲抗凍蛋白并非以單獨作用時熱滯活性最高的狀態(tài)存在，而是有保留的替換了TXT基序中保守的Thr位點，其目的尚不清楚。由于實驗材料限制，無法在ApAFP914再找到另一個自然條件下不規(guī)則的保守位點，所以這一現(xiàn)象還需要在其他昆蟲抗凍蛋白中進一步研究。
4 結(jié)論
差示掃描量熱法顯示突變蛋白TrxA-A19T具有最高的熱滯活性，而突變體TrxA-T33F和TrxAT33&45F的熱滯活性顯著低于未突變的TrxA-914。說明在0.1 mg/mL濃度下光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914 TXT基序越規(guī)則抗凍活性越強。推測在一定范圍內(nèi)昆蟲抗凍蛋白的TXT基序越規(guī)則其具有的熱滯活性越高。
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（責(zé)任編輯 馬鑫）
Analysis of the TXT Motifs’Effect on the Antifreeze Activity of Antifreeze Protein ApAFP914 from Anatolica polita borealis Using Differential Scanning Calorimetry
DU Rong-feng LIU Zhong-yuan MAO Xin-fang
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）
This work is to study the prokaryotic expression and activities of antifreeze protein ApAFP914 and its mutants，and deduce the effects of mutations of TXT motifs on the insect’s antifreeze protein’s activities. By site directed mutagenesis in regular site number of TXT motifs of gene apafp914 in Anatolica polita borealis，then the mutant gene was cloned into pET32a vector，and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The fusion protein TrxA-ApAFP914 and the other three mutant proteins were purified using Ni-NTA. The threedimensional structure of the protein ApAFP914 was predicted and analyzed using SwisS-Model server. The thermal hysteresis activities of TrxAApAFP914’s and its mutants were detected by differential scanning calorimetry（DSC）. The results showed that the molecular weight of the 4 fusion proteins was about 30 kD，and the mutant protein TrxA-A19T had the highest thermal hysteresis activity，while the thermal hysteresis activities of mutant TrxA-T33&45F and TrxA-T33F were significantly lower than un-mutated TrxA-914. The results indicate that the more regular the TXT motif of insect antifreeze protein is，the stronger the thermal hysteresis activity of it is.
antifreeze protein in Anatolica polita borealis；TXT motifs；differential scanning calorimetry（DSC）
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.028
2015-12-10
國家自然科學(xué)基金項目（31200588）
杜榮俸，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：408832008@qq.com
毛新芳，女，副教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：lilyxjmm@163.com
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杜榮俸 劉忠淵 毛新芳
（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）
差示掃描量熱法分析光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914 TXT基序?qū)箖龌钚缘挠绊?/p>
杜榮俸 劉忠淵 毛新芳
（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）
研究光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914及其突變體的原核表達及活性，推測TXT基序的突變對昆蟲抗凍蛋白抗凍活性的影響。通過定點突變新疆荒漠昆蟲光滑鱉甲抗凍蛋白apafp914基因TXT基序的規(guī)則位點個數(shù)，并亞克隆至pET32a原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，Ni-NTA純化得到融合蛋白TrxA-ApAFP914及3種突變體蛋白；利用SwisS-Model服務(wù)器預(yù)測分析了ApAFP914蛋白的三維結(jié)構(gòu)；通過差示掃描量熱法測定TrxA-ApAFP914及其突變體的熱滯活性。結(jié)果顯示，4種融合蛋白分子量均在30 kD左右；且突變蛋白TrxA-A19T具有最高的熱滯活性，而突變體TrxA-T33F和TrxA-T33&45F的熱滯活性顯著低于未突變的TrxA-914。研究結(jié)果表明昆蟲抗凍蛋白的TXT基序越規(guī)則其具有的熱滯活性越高。
光滑鱉甲抗凍蛋白；TXT基序；差示掃描量熱法（DSC）
抗凍蛋白（antifreeze protein，AFPs）是耐寒（freeze-avoidance）生物為適應(yīng)冷環(huán)境而產(chǎn)生的小分子蛋白質(zhì)，能非依數(shù)性的降低溶液冰點但不改變?nèi)埸c，兩者產(chǎn)生的差值即為熱滯活性（Thermal hysteresis activity，THA），可以用來評價抗凍蛋白抗凍活性的強弱［1］。按照來源的不同可以分為魚類抗凍蛋白、昆蟲抗凍的蛋白、植物抗凍蛋白以及菌類抗凍蛋白。其中昆蟲抗凍蛋白主要在甲蟲（Tenebrio molitor）、云杉卷葉蛾（Choristoneura fumigerana）、美洲長椿（Oncopeltus fasciatus）和毛蟲（Dendroides canadensis）等耐凍昆蟲體內(nèi) 表達，其熱滯活性可達魚類抗凍蛋白的10-100倍［2］。一般認為抗凍蛋白吸附于冰晶表面，就需要外加一些推動力（如冰點下降），才能使冰繼續(xù)生長，這就是吸附抑制理論認為冰點下降的原因［3］。吸附抑制理論認為抗凍蛋白的作用方式具有共性，它們都有一定的疏水性，表面較平坦的面可作為結(jié)合冰的位點［4］。
光滑鱉甲（Anatolica polita borealis）屬擬步甲科鱉甲屬昆蟲，能適應(yīng)新疆古爾班通古特沙漠-40℃的寒冷冬季。其產(chǎn)生的抗凍蛋白種類豐富且具有高度相似的一級結(jié)構(gòu)，重復(fù)的TCT基序數(shù)量從4-8個不等，形成了每個螺環(huán)上的β平面，也形成了相似的冰結(jié)合區(qū)域和空間上的右手β螺旋結(jié)構(gòu)［5］。這種結(jié)構(gòu)與云杉卷葉蛾抗凍蛋白重復(fù)出現(xiàn)在每一螺圈當(dāng)中的TXT序列十分吻合［6］，與皮花天牛（Rhagium inquisitor）抗凍蛋白中出現(xiàn)的重復(fù)TxTxTxT序列相似［7］。由此推測這幾種昆蟲抗凍蛋白與冰晶的作用方式也十分相似［5］。在利用定點突變抗凍蛋白保守位點（TXT基序）使其抗凍活性顯著降低的特性已經(jīng)被廣泛報道［8］。而Friis通過定點突變將皮花天牛抗凍蛋白保守位點上不規(guī)則的His或Lys替換為更為規(guī)則的Thr可以使其抗凍活性顯著增強，說明TXT基序的規(guī)則排列可能影響抗凍活性的強弱［7］。
本研究利用定點突變將光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914保守區(qū)域不規(guī)則的ACT序列替換為規(guī)則的TCT序列。同時將規(guī)則的TCT序列替換為不規(guī)則的TCF序列，打亂原有TXT基序的規(guī)則排列。通過差示掃描量熱儀（DSC Q2000）法［9，10］比較光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914及其各突變體蛋白的熱滯活性，旨在探討在光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914中 TXT規(guī)則程度對抗凍活性的影響。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 質(zhì)粒及菌株 原核表達載體pET32a為新疆生物資源基因工程重點實驗室保存載體，菌株DH5α及BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Xho I，EcoR I，T4 DNA連接酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以及DNA標準品購于TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司。Ni-NTA柱料和色譜柱購自QIAGEN公司。引物合成及序列測定由北京六合華大基因科技有限公司完成。其他常用試劑均為分析純。
1.2 方法
1.2.1 定點突變TXT基序 采用重疊延伸PCR法對光滑鱉甲抗凍蛋白基因apafp914（GenBank：GU358704.1）功能區(qū)域進行定點突變。根據(jù)apafp914全長序列設(shè)計4對引物（表1），在P1和P2引物中插入EcoR I和Xho I酶切位點（劃線部分）用于擴增apafp914全長；引物P3和P4中引入第33位Thr向Phe突變（劃線部分），以apafp914為模板，P1與P4為引物擴增得到突變基因前半段，P3與P2為引物擴增得到突變基因后半段，將前后兩段突變基因混合后再以P1與P2為引物擴增得到apafp914-T33F單點突變體基因；引物P5和P6中引入第45位Thr向Phe突變（劃線部分），以apafp914-T33F為模板，擴增得到apafp914-T33&45F雙點突變體基因；引物P7和P8中引入第19位Ala向Thr突變（劃線部分）以apafp914為模板，擴增得到TXT基序排列更規(guī)則的apafp914-A19T突變體基因。如圖1所示，apafp914基因由264個堿基編碼86個氨基酸。分別以藍色字體表示上游引物，以紫色字體表示下游引物，劃線部分表示限制性內(nèi)切酶酶切位點以及擬突變的氨基酸位點。
1.2.2 三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 經(jīng)Blast比對，選取與ApAFP914相似性最高的熱滯蛋白YL-1型蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB NO. 1ezg.1.A）進行分子模擬；利用ExPASy蛋白分析程序的Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org/）服務(wù)器在線分析構(gòu)建apafp914基因推導(dǎo)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并用SwisSPDB viewer軟件展示ApAFP914蛋白的三級結(jié)構(gòu)的分子模型。
表1 引物列表
圖1 光滑鱉甲抗凍蛋白apafp914基因與氨基酸序列比對及引物位置示意圖
1.2.3 apafp914及其突變體基因的表達及條件優(yōu)化 將 測 序 正 確 的pET32a- apafp914；pET32aapafp914-T33F；pET32a- apafp914-T33&45F；pET32a- apafp914-A19T質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細胞。經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后的陽性單克隆接種于5 mL含50 mg/L Amp的LB培養(yǎng)基，37℃、220 r/min培養(yǎng)12-14 h，按體積比1∶100轉(zhuǎn)接入10 mL新鮮 LB（50 mg/L Amp）培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600達到0.6-0.8時，收集2 mL誘導(dǎo)前菌液12 000 r/min離心10 min后備用，其余培養(yǎng)液中加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，相同條件下誘導(dǎo)表達4 h，收集2 mL菌液12 000 r/min離心10 min，用1×SDS樣品緩沖液100 μL分別重懸誘導(dǎo)前沉淀與誘導(dǎo)后沉淀，煮沸15 min，15% SDSPAGE電泳分析表達結(jié)果。
1.2.4 融合蛋白的純化 6 000 r/min離心10 min收集1 L新鮮LB（50 mg/L Amp）培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達后的菌液，用4%（V/V）預(yù)冷的1×Ni-NTA 洗滌緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，pH8.0）重懸。超聲破碎，12 000 r/min離心15 min收集上清液進行純化，純化步驟參見The QIAexpressionistTM說明書（QIAGEN公司）。利用SDS-PAGE凝膠灰度掃描確定蛋白純度并用于實驗。
1.2.5 差示掃描量熱法測定各融合蛋白熱滯活性
經(jīng)純化的TrxA-914及其突變體TrxA-T33F、TrxAA19T各取5 μL 于樣品盤中密封后稱重，以空鋁盤為參比盤。待DSC Q2000儀器穩(wěn)定后，以3℃/min的速度將溫度降至-30℃ 再升溫至10℃記錄樣品的過冷卻點和熔點（Tm），計算體系的熔融焓（△Hm）。再勻速降溫至-30℃保持5 min，待樣品穩(wěn)定后升溫至體系處于冰水混合物狀態(tài)的保持溫度（Th），在Th溫度下保持5 min待樣品再次穩(wěn)定后降低溫度至-30℃；重復(fù)上述過程在不同的Th溫度下停留，并分別記錄不同Th下樣品體系的結(jié)晶焓（△Hf）和結(jié)晶含量（結(jié)晶率Φ=（1-ΔHf/ΔHm）×100%）。熱滯活性THA=Th-To（其中To為體系在保持溫度下融化部分再次結(jié)冰時對應(yīng)的溫度）。TrxA-914及其突變體蛋白以0.1 mg/mL為測定濃度分別測量。每個樣品重復(fù)3次。
2 結(jié)果
2.1 ApAFP914蛋白三維結(jié)構(gòu)的模擬
根據(jù)同源建模的預(yù)測選取與ApAFP914一致性最高（71.95%）的熱滯蛋白YL-1型蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB NO. 1ezg.1.A）進行分子模擬。如圖2-A所示，ApAFP914蛋白由6個規(guī)則的β片層組成環(huán)狀的β螺旋結(jié)構(gòu)，藍色標記為冰結(jié)合域中的Thr，紅色標記為的第19位Ala。由如圖2-B保守序列的分析可知，ApAFP914符合昆蟲抗凍蛋白的一般結(jié)構(gòu)規(guī)律，藍色標記為預(yù)測的7個保守TXT基序，紅色標記為重疊延伸PCR獲得的三個突變氨基酸位點（A19，T33，T45）。
圖2 ApAFP914蛋白三維結(jié)構(gòu)的模擬（A）及突變體氨基酸序列比對（B）
2.2 SDS-PAGE檢測apafp914基因及其突變體的表達
將pET32a-apafp914質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21表達菌株中進行光滑鱉甲抗凍蛋白的原核表達。野生型融合蛋白TrxA-ApAFP914-WT（簡稱TrxA-914）的表達條件優(yōu)化結(jié)果如圖3-A，由不同IPTG濃度誘導(dǎo)后的融合蛋白出現(xiàn)在分子量26.0-35.0 kD之間。從圖中可以看出，加入0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后的融合蛋白表達量最高。由圖3-B可以看出，突變蛋白TrxA-ApAFP914-T33F（簡稱TrxA-T33F）；TrxAApAFP914-T33&45F（簡稱TrxA-T33&45F）；TrxAApAFP914-A19T（簡稱TrxA-A19T）蛋白條帶的分子量在30 kD左右，與TrxA-914分子量保持一致。
2.3 融合蛋白的純化及濃度測定
誘導(dǎo)后的pET32a-apafp914/BL21菌體經(jīng)過超聲破碎的上清和沉淀中均發(fā)現(xiàn)了帶有Trx標簽的融合蛋白Trx-914。為不影響4種融合蛋白之間的熱滯活性比較，實驗選取在上清中表達的融合蛋白進行熱滯活性分析。利用His標簽與Ni-NTA的親和層析純化融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測及Western blot檢測結(jié)果（圖4）顯示，TrxA-914及其突變體的洗脫液發(fā)現(xiàn)條帶分子量在30 kD左右，通過凝膠灰度掃描分析其純度均在95%以上，認為已得到條帶單一的融合蛋白。
2.4 差示掃描量熱法測定各融合蛋白熱滯活性
如圖5-A所示，采用DSC Q2000差示掃描量熱法檢測融合蛋白TrxA-914及其突變體的熱滯活性時選用BSA作為陰性對照，溶液隨箭頭方向先升溫后降溫至Th溫度停留后再降溫則立即出現(xiàn)吸放熱峰（即To=Th），說明BSA不能改變?nèi)芤罕c不具有熱滯活性。而融合蛋白TrxA-914及其突變體在溫度下降時均表現(xiàn)出熱滯活性。如圖5-B所示，曲線a到e表示Th溫度由低到高所形成的多條熱流曲線。當(dāng)Th溫度越高時溶液冰晶含量越低，此時的Th溫度也越接近熔點溫度，To可反映出溶液再次因結(jié)冰而放熱的溫度即為冰點溫度。
圖3 融合蛋白TrxA-ApAFP914表達條件優(yōu)化（A）及其突變體蛋白表達（B）
圖4 融合蛋白 TrxA-914 及其突變體的純化（A）及Western Blot檢測結(jié)果（B）
圖5 DSC熱流曲線判斷溶液熱滯活性
如圖6所示，實驗均采取了結(jié)冰率為5%以下的熱流曲線b作為最終熱滯活性的計算依據(jù)；經(jīng)DSC Q2000儀器最終測定了光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914及其突變體在0.1 mg/mL濃度下的抗凍活性。表2給出了各融合蛋白熱流曲線b的相關(guān)參數(shù)，Th為保持溫度，To為結(jié)冰溫度，熱滯活性THA=Th-To；曲線下方與x坐標軸圍成的面積可表示為結(jié)晶放熱焓△Hr，由融化曲線與x坐標軸圍成的面積為熔化吸熱焓△Hm，經(jīng)冰核率（Nuclei，Φ）公式：Nuclei Φ（%）=［1-（-△Hr）/△Hm］×100%可計算出溶液的冰核率。從表2中可以看出抗凍活性依次為TrxA-A19T（0.55℃）>TrxA-914（0.46℃）>TrxA-T33F（0.38℃）>TrxA-T33&45F（0.31℃），恰好反映出TXT基序的規(guī)則程度，說明昆蟲抗凍蛋白保守區(qū)的TXT基序規(guī)則程度顯著影響了抗凍蛋白的熱滯活性。
3 討論
已知AFP的氨基酸殘基、空間構(gòu)象等雖然有一定差異，但都具一定的抗凍活性，都能有效地與冰晶進行不可逆結(jié)合，并進一步防止冰晶的生長，有的抗凍蛋白具有與冰晶表面結(jié)構(gòu)互補的平面，如I型抗凍蛋白、II型抗凍蛋白、Ⅲ型抗凍蛋白；有的則通過錨定機制與冰晶結(jié)合；而穩(wěn)定AFP-冰晶復(fù)合物的主要作用力為疏水相互作用和范德華力［11］。抗凍蛋白的熱滯活性的影響因素主要包括：（1）同一物種產(chǎn)生的不同亞型抗凍蛋白之間的相互作用效果明顯高于單一亞型的抗凍蛋白單獨作用效果［12］；（2）一些小分子量溶質(zhì)可作為抗凍蛋白的增效劑如檸檬酸鹽、甘油和山梨醇能顯著阻止冰核的形成，提高昆蟲的熱滯活性；（3）抗凍蛋白自身的濃度和肽鏈長度，抗凍蛋白濃度越大，熱滯活性越強，高分子量糖肽比低分子量糖肽熱滯活性更強［13］。許多研究表明增加AFP的重復(fù)序列可增強其熱滯活性，但β螺旋結(jié)構(gòu)的抗凍蛋白隨著螺旋重復(fù)數(shù)在一定范圍內(nèi)的增加其抗凍活性也會相應(yīng)的增加［14］，一般認為9個螺旋時抗凍活性最強，大于10-12個時抗凍活性反而會下降［15］。
表2 融合蛋白TrxA-ApAFP914及其突變體熱滯活性及結(jié)冰率比較
圖6 融合蛋白TrxA-914及其突變體TrxA-T33F；TrxA-A19T；TrxA-T33&45F的DSC熱流曲線
本研究通過同源建模預(yù)測的蛋白的晶體結(jié)構(gòu)可以看出，ApAFP914蛋白是由6個規(guī)則的β片層組成的β螺旋結(jié)構(gòu)，推測其規(guī)則排列的7個保守TXT基序為冰結(jié)合面，符合昆蟲抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)規(guī)律［16］。當(dāng)以疏水氨基酸Phe替換33位和45位的保守氨基酸，改變了TXT基序中Thr位置的疏水性，或?qū)⒌?9位的Ala替換為更保守氨基酸后，均不影響蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，但改變了TXT基序的規(guī)則位點個數(shù)，從而使蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性也發(fā)生了變化。實驗組融合蛋白TrxA-914及其突變體均表現(xiàn)出熱滯活性，且TrxA-A19T的熱滯活性顯著高于野生型TrxA-914，而突變體TrxA-T33F和TrxA-T33&45F的熱滯活性顯著低于野生型TrxA-914。實驗證明光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914 TXT基序的規(guī)則位點個數(shù)可以直接影響到抗凍蛋白的熱滯活性，且隨TXT基序的規(guī)則程度增加/減少而增強/減弱。
溶液在平衡狀態(tài)下的熔點溫度和冰點溫度是相等的，隨著溶質(zhì)的濃度增加二者會同時降低。而抗凍蛋白可以非依數(shù)性降低溶液的冰點溫度而不改變?nèi)埸c溫度，因此直接測量溶液的冰點溫度和熔點溫度，相減即可算出抗凍蛋白的熱滯活性?？箖龅鞍谉釡钚缘臏y量方法包括：（1）通過納升滲透壓系統(tǒng)顯微觀察冰晶緩慢生長或縮小時的溫度可推測冰點和熔點溫度［17］；（2）通過差示掃描量熱法（DSC）測定升溫或降溫過程中溶液的熱焓變化情況也可判斷冰點和熔點溫度［10］；（3）此外，還可以通過微升滲透壓儀檢測溶液的滲透壓再換算出溶液的冰點溫度，并將未添加抗凍蛋白的溶液冰點溫度作為熔點溫度，由此計算并推測抗凍蛋白的熱滯活性［18］。本實驗采用DSC法檢測到融合蛋白TrxA-ApAFP914具有熱滯活性，并通過多次穩(wěn)定的測量數(shù)據(jù)（儀器誤差僅0.01℃）可以說明ApAFP914蛋白結(jié)構(gòu)的改變對熱滯活性產(chǎn)生了影響。該方法在探究昆蟲抗凍蛋白結(jié)構(gòu)對熱滯活性的影響時具有可行性。當(dāng)溶液中冰核量高于10%時，降溫過程中冰晶出現(xiàn)爆發(fā)性生長，說明此結(jié)冰率下ApAFP914的含量不足以完全抑制冰晶的生長。但當(dāng)溶液的冰核量低于5%時再降溫，溶液出現(xiàn)只降溫不放熱的現(xiàn)象即溫度下降但不結(jié)冰，說明溶液冰點顯著下降，并且THA隨結(jié)冰率的下降而升高［9］。當(dāng)實驗選用冰核量最少的條件測定熱滯活性時，結(jié)果顯示TrxA-A19T突變體顯著的表現(xiàn)出最高的熱滯活性，并且TrxA-T33F和TrxA-T33&45F打亂TXT基序保守位點排列后的熱滯活性顯著減弱，這一結(jié)果說明光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914 TXT基序中保守位點的數(shù)量顯著影響了熱滯活性。經(jīng)重復(fù)實驗得出TrxA-A19T突變體比野生型TrxA-914的抗凍活性顯著增強，可以推斷自然條件下的光滑鱉甲抗凍蛋白并非以單獨作用時熱滯活性最高的狀態(tài)存在，而是有保留的替換了TXT基序中保守的Thr位點，其目的尚不清楚。由于實驗材料限制，無法在ApAFP914再找到另一個自然條件下不規(guī)則的保守位點，所以這一現(xiàn)象還需要在其他昆蟲抗凍蛋白中進一步研究。
4 結(jié)論
差示掃描量熱法顯示突變蛋白TrxA-A19T具有最高的熱滯活性，而突變體TrxA-T33F和TrxAT33&45F的熱滯活性顯著低于未突變的TrxA-914。說明在0.1 mg/mL濃度下光滑鱉甲抗凍蛋白ApAFP914 TXT基序越規(guī)則抗凍活性越強。推測在一定范圍內(nèi)昆蟲抗凍蛋白的TXT基序越規(guī)則其具有的熱滯活性越高。
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（責(zé)任編輯 馬鑫）
Analysis of the TXT Motifs’Effect on the Antifreeze Activity of Antifreeze Protein ApAFP914 from Anatolica polita borealis Using Differential Scanning Calorimetry
DU Rong-feng LIU Zhong-yuan MAO Xin-fang
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）
This work is to study the prokaryotic expression and activities of antifreeze protein ApAFP914 and its mutants，and deduce the effects of mutations of TXT motifs on the insect’s antifreeze protein’s activities. By site directed mutagenesis in regular site number of TXT motifs of gene apafp914 in Anatolica polita borealis，then the mutant gene was cloned into pET32a vector，and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The fusion protein TrxA-ApAFP914 and the other three mutant proteins were purified using Ni-NTA. The threedimensional structure of the protein ApAFP914 was predicted and analyzed using SwisS-Model server. The thermal hysteresis activities of TrxAApAFP914’s and its mutants were detected by differential scanning calorimetry（DSC）. The results showed that the molecular weight of the 4 fusion proteins was about 30 kD，and the mutant protein TrxA-A19T had the highest thermal hysteresis activity，while the thermal hysteresis activities of mutant TrxA-T33&45F and TrxA-T33F were significantly lower than un-mutated TrxA-914. The results indicate that the more regular the TXT motif of insect antifreeze protein is，the stronger the thermal hysteresis activity of it is.
antifreeze protein in Anatolica polita borealis；TXT motifs；differential scanning calorimetry（DSC）
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.028
2015-12-10
國家自然科學(xué)基金項目（31200588）
杜榮俸，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：408832008@qq.com
毛新芳，女，副教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：lilyxjmm@163.com
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