金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Ply187的CHAP結(jié)構(gòu)域的表達(dá)及抗菌活性分析

吳蒙陸海榮，2黃青山，2

（1. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；2. 上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司， 上海 201206）

金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Ply187的CHAP結(jié)構(gòu)域的表達(dá)及抗菌活性分析

吳蒙1陸海榮1，2黃青山1，2

（1. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；2. 上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司， 上海 201206）

噬 菌體裂解酶是一種高效的抗菌蛋白，系統(tǒng)地分析噬菌體裂解酶催化域的活性，有助于設(shè)計(jì)高效雜合裂解酶。合成噬菌體裂解酶P ly187的CHAP催化結(jié)構(gòu)域（CHAPPly187）基因，并構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-CHAPPly187轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和兩步純化，獲得高純度的CHAPPly187，再與溶葡萄球菌酶催化域（CATLysn）進(jìn)行活性比較。比濁法檢測(cè)顯示CHAPPly187和CATLysn對(duì)金黃色葡萄球菌都具有較強(qiáng)的抗菌活性；CHAPPly187具有更寬的抗菌譜，最適作用pH范圍更大，對(duì)離子強(qiáng)度的耐受能力更好，易受EDTA的影響。低濃度的二價(jià)金屬離子Ca2+、Mg2+、Mn2+對(duì)兩種催化域都有明顯的促進(jìn)作用，低濃度的Zn2+、Cu2+、Fe2+對(duì)它們有很強(qiáng)的抑制作用。

噬菌體裂解酶；溶葡萄球菌酶；催化結(jié)構(gòu)域；CHAP；抗菌活性

隨著各種抗生素大量使用，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，導(dǎo)致臨床治療困難以及患者病死率增高，嚴(yán)重威脅人類健康［1，2］。為了控制耐藥性細(xì)菌引起的感染，迫切需要研發(fā)與傳統(tǒng)抗生素作用模式不同的新型抗菌藥物。噬菌體裂解酶是噬菌體感染宿主晚期表達(dá)的一類肽聚糖水解酶。當(dāng)它體外應(yīng)用時(shí)，能快速水解革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁，對(duì)多重耐藥的革蘭氏陽(yáng)性致病菌同樣有效，而且不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生新的抗性［3，4］。因此，噬菌體裂解酶有望成為新型抗菌藥物。裂解酶SAL-1已經(jīng)進(jìn)入臨床II期，用于治療對(duì)甲氧西林和 萬(wàn)古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌（MRSA和VRSA）引起的全身性感染［5］。

目前已被發(fā)現(xiàn)的噬菌體裂解酶有1 000多種，一般由N端水解細(xì)菌細(xì)胞壁的催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domain，CA T）和C端特異性靶向細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cell wall targeting domain，CWT）組成［6，7］。為進(jìn)一步提高裂解酶的抗菌活性，國(guó)內(nèi)外研究人員將不同裂解酶之間的功能結(jié)構(gòu)域重新組合，形成新的雜合裂解酶［8］。其中，雜合裂解酶P128已經(jīng)進(jìn)入臨床II期，用于清除住院患者鼻腔黏膜的金黃色葡萄球菌定植［9，10］。

選擇高抗菌活性的催化結(jié)構(gòu)域，是構(gòu)建雜合裂解酶的關(guān)鍵［11，12］。然而，目前還沒有研究人員對(duì)單獨(dú)催化域進(jìn)行系統(tǒng)的活性分析。本研究選擇金黃色葡萄球 菌噬菌體187裂解酶（Ply187）的CHAP（cysteine and histidine-dependent aminopeptidase/ hydrolase）催化結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)分析其抗菌活性、影響因素、抗菌譜，并與臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用的抗菌蛋白——溶葡萄球菌酶（lysostaphin，Lysn）的催化域（catalytic domain of lysostaphin，CATLysn）進(jìn)行比較，從而促進(jìn)針對(duì)多重耐藥菌的高活性雜合裂解酶設(shè)計(jì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 實(shí)驗(yàn)所用的菌株詳，見表1；表達(dá)載體pET28a（+）、大腸埃希菌表達(dá)菌株BL21（DE3）購(gòu)自Novagen公司。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；DNA Marker、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；IPTG、卡那霉素購(gòu)自TaKaRa公司；純化填料購(gòu)自GE公司；其余常用試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

表1 受試菌株

1.2 方法

1.2.1 CHAPPly187的表達(dá)和純化 通過(guò)GenBank獲得噬菌體裂解酶Ply187蛋白序列（Y07740），根據(jù)CHAPPly187（1-157 aa）氨基酸序列，選用大腸埃希菌偏愛密碼子，人工合成編碼CHAPPly187的基因序列，并在5'端引入Nco-位點(diǎn)，3'端引入Hind Ⅲ位點(diǎn)。CHAPPly187基因的人工合成由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成，合成基因克隆于pUC57載體的多克隆位點(diǎn)，重組質(zhì)粒命名為pUC57-CHAPPly187。pUC57-CHAPPly187經(jīng) NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，割膠回收CHAPPly187基因片段，克隆到pET28a（+）載體的NcoⅠ和Hind Ⅲ位點(diǎn)間，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-CHAPPly187，陽(yáng)性克隆送上海英駿生物公司測(cè)序。將測(cè)序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài) 細(xì)胞，獲得表達(dá)CHAPPly187工程菌。

挑單克隆接種于LB培養(yǎng)液（含30 mg/L卡那霉素），37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1%接種到相同的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至光密度值（波長(zhǎng)600 nm）≈0.6時(shí)，加入終濃度為0.05 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)4 h左右，離心收集菌體，菌體重懸于破菌緩沖液（20 mmol/L Tris-Cl含2 mmol/L EDTA，pH8.0），超聲破菌。破菌液4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。

將離心后破菌上清液進(jìn)樣至預(yù)先用50 mmol/L Tris-Cl pH 9.0緩沖液平衡的Capto MMC陽(yáng)離子交換層析柱（26 mm × 60 mm），用含1.0 mol/L NaCl 的Tris-Cl緩沖液洗脫，收集目的峰。收集峰經(jīng)超濾濃縮后，進(jìn)樣至Sephadex G50凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行精純，用含150 mmol/L NaCl 的20 mmol/L PBS（pH 7.0）緩沖液進(jìn)行洗脫，收集目的峰。純化后的樣品經(jīng)超濾濃縮后置于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

重組溶葡萄球菌酶的催化域（CATLysn）的表達(dá)和純化參考文獻(xiàn)［13］。

用12%SDS-PAGE測(cè)定重組蛋白樣品的大小和純度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.2 比濁法測(cè)定CHAPPly187抗菌活性 采用比濁法測(cè)定CHAPPly187的抗菌活性，，在特定條件下細(xì)菌懸液濁度下降值代表重組蛋白的酶活。過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌（ATCC6538）轉(zhuǎn)接后生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期（OD600≈0.5），離心（5 000 r/ min）收集菌體。菌體用5 mmol/L PBS（pH 7.3）清洗2次，然后重懸浮 于5 mmol/L PBS（pH7.3）緩沖液中。在96孔板中加入15 μL稀釋10倍的樣品（終濃度為200 nmol/L）和50 μL菌懸液（最終OD600約為0.5），再加入無(wú)菌水，使得最終反應(yīng)體系為200 μL，反應(yīng)溫度設(shè)為37℃，在OD600下讀數(shù)。所有的酶活測(cè)定結(jié)果為3次重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值。

為了檢測(cè)CHAPPly187的抗菌譜，采用比濁法測(cè)定CHAPPly187對(duì)葡萄球菌（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌）、藤黃微球菌、肺炎鏈球菌、停乳鏈球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的抗菌活性，以CATLysn（終濃度為200 nmol/L）為對(duì)照。

1.2.2.1 溫度對(duì)CHAPPly187抗菌活性的影響 在28-41℃范圍內(nèi)，分別測(cè)定CHAPPly187的抗菌活性，以CATLysn為對(duì)照。

1.2.2.2 pH對(duì)CHAPPly187抗菌活性的影響 菌體用5 mmol/L PBS（pH 7.3）清洗2次，然后重懸浮于無(wú)菌水中。在37℃下，測(cè)定pH值的變化（pH 4-5：50 mmol/L NaAC，pH 6-8：20 mmol/L，pH 9-10：100 mmol/L Tris-HCL）對(duì)CHAPPly187抗菌活性的影響，以CATLysn為對(duì)照。

1.2.2.3 離子強(qiáng)度對(duì)CHAPPly187抗菌活性的影響 在37℃和pH 7.3條件下，反應(yīng)體系中分別加入0、5、 10、20、40、60、150和300 mmol/L NaCl時(shí)，測(cè)定CHAPPly187的抗菌活性，以CATLysn為對(duì)照。

1.2.2.4 EDTA和金屬離子對(duì)CHAPPly187抗菌活性的影響 在37℃和pH 7.3條件下，反應(yīng)體系中含不同濃度的EDTA或二價(jià)金屬離子（Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+和Fe2+），分別測(cè)定CHAPPly187的抗菌活性，以CATLysn為對(duì)照。

1.2.2.5 血清對(duì)CHAPPly187抗菌活性的影響 在37℃和pH 7.3條件下，反應(yīng)體系中含0、50%兔血清時(shí)，分別測(cè)定CHAPPly187的抗菌活性，以CATLysn為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 CHAPPly187和CATLysn的表達(dá)和純化

將表達(dá)的CHAPPly187的重組質(zhì)粒（圖1-A）轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破菌，收集破菌上清液。經(jīng)Capto MMC陽(yáng)離子交換和Sephadex G50凝膠排阻純化，SDS-PAGE（圖1-B）顯示重組CHAPPly187位于18 kD與理論分子量（17.84 kD）相符，且純度均大于95%。

圖1 CHAPPly187和CATLysn蛋白序列示意圖（A）以及重組催 化域的SDS-PAGE分析（B）

2.2 CHAPPly187的抗菌活性

采用比濁法，分別測(cè)定CHAPPly187和CATLysn的抗菌活性。結(jié)果（圖2）顯示，30 min內(nèi)終濃度為200 nmol/L的單獨(dú)催化域能將金黃色葡萄球菌的濁度從0.5降至0.1。說(shuō)明CHAPPly187和CATLysn一樣對(duì)金黃色葡萄球菌具有非常強(qiáng)的抗菌活性。

圖2 催化域的抗菌活性分析

2.3 CHAPPly187的抗菌譜

抗菌譜檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，CHAPPly187對(duì)葡萄球菌屬有非常專一的抗菌作用，且對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌同樣有效；CATLysn同樣只對(duì)葡萄球菌有效，然而其對(duì)表皮葡萄球菌和模仿葡萄球菌的抗菌效果明顯變?nèi)?，分別下降了57%和70%。

2.4 溫度對(duì)CHAPPly187抗菌活性的影響

CHAPPly187和CATLysn的最適反應(yīng)溫度為37℃，在28-41℃范圍之間，抗菌活性變化不大（數(shù)據(jù)未顯示）。

2.5 pH對(duì)CHAPPly187抗菌活性的影響

CHAPPly187在pH 6.0-9.0范圍內(nèi)，具有較高的抗菌活性（圖4）；而CATLysn在pH 7.0-9.0，抗菌活性較高。

2.6 不同離子強(qiáng)度對(duì)CHAPPly187抗菌活性的影響

在37℃和pH7.3條件下，CHAPPly187隨著鹽濃度的升高，活性慢慢上升，在20 mmol/L NaCl時(shí)的活性最高，隨后活性明顯下降，鹽濃度在300 mmol/L時(shí)，基本無(wú)活性（圖5）；而CATLysn最適離子強(qiáng)度為0-5 mmol/L NaCl，隨著鹽濃度的升高，活性急劇下降，在60 mmol/L NaCl時(shí)活性只有原來(lái)的1%。

圖3 催化域的抗菌譜

圖4 pH對(duì)催化域抗菌活性的影響

圖5 離子強(qiáng)度對(duì)催化域抗菌活性的影響

2.7 EDTA和金屬離子對(duì)CHAPPly187抗菌活性影響

CHAPPly187隨著反應(yīng)體系中EDTA濃度的升高，活性快速下降，在1 mmol/L EDTA時(shí)，基本無(wú)活性（圖6）；CATLysn隨著EDTA濃度的升高，活性緩慢下降，當(dāng)EDTA的濃度超過(guò)20 mmol/L時(shí)，抗菌活性只有原來(lái)的5%。

CHAPPly187隨著反應(yīng)體系中Ca2+、Mg2+濃度的上升，活性有顯著的提高，在1 mmol/L時(shí)的活性最高，提高60%左右，隨后活性開始下降，濃度在8 mmol/L時(shí)，開始有輕微抑制（圖7-A）；Mn2+、Ba2+在0.5 mmol/L時(shí)對(duì)CHAPPly187的活性有明顯的促進(jìn)作用，濃度在4 mmol/L以上開始有抑制作用。Fe2+、Zn2+、Cu2+金屬離子在極低濃度（3 μmol/L）時(shí)，有促進(jìn)作用，隨后開始產(chǎn)生抑制作用，濃度達(dá)100 μmol/L時(shí)，CHAPPly187基本無(wú)活性（圖7-B）。

CATLysn隨著反應(yīng)體系中Ca2+、Mg2+、Mn2+濃度的上升，活性有顯著的提高，在50 μmol/L左右活性最高，提高40%左右，隨后活性開始下降，在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，Ca2+沒有產(chǎn)生抑制作用，Mg2+、Mn2+濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí)，有輕微抑制作用（圖7-C）。Ba2+在0-1 mmol/L時(shí)，對(duì)CATLysn的抑制作用不斷增加。Fe2+在極低濃度（3 μmol/L）時(shí)，有明顯促進(jìn)作用，隨后產(chǎn)生抑制作用（圖7-D），Zn2+、Cu2+對(duì)CATLysn的抑制作用非常明顯，尤其是Cu2+，在10 μmol/L時(shí)幾乎完全抑制CATLysn的活性。

2.8 血清對(duì)CHAPPly187抗菌活性的影響

當(dāng)反應(yīng)體系中含有50%的兔血清時(shí)，測(cè)不出CHAPPly187和CATLysn對(duì)金黃色葡萄球菌的裂解活性。

3 討論

隨著抗生素的廣泛使用，多重耐藥菌在臨床上的檢出率越來(lái)越高，治療耐藥菌感染變得非常困難，因此迫切需要研發(fā)新型抗菌藥物［1，14］。大量的研究表明，噬菌體裂解酶可以成為克服耐藥菌感染的抗菌藥物［15，16］。目前，一些高效、安全的噬菌體裂解酶已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段［5，9，10］。針對(duì)特定耐藥菌，研究人員通過(guò)設(shè)計(jì)雜合噬菌體裂解酶來(lái)提高抗菌活性［17-20］。從1 000多個(gè)催化域中篩選出具有高抗菌活性的目標(biāo)，是設(shè)計(jì)高效的雜合裂解酶的關(guān)鍵［21］。

CHAPPly187屬于依賴組氨酸、半胱氨酸肽酶家族的一類催化域［22，23］，其主要作用位點(diǎn)位于細(xì)胞壁肽聚糖側(cè)鏈的丙氨酸與肽鍵橋中第一位甘氨酸之間形成的肽鍵，其活性中心含Ca2+［24，25］。CATLysn屬于金屬蛋白酶，其作用位點(diǎn)位于細(xì)胞壁肽聚糖中五甘氨酸肽鍵橋的第2與第3位甘氨酸之間形成的肽鍵，其活性中心含Zn2+［26］。兩者的作用底物的位置非常相近。

圖6 EDTA對(duì)催化域抗菌活性的影響

CHAPPly187和CATLysn對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性比較相似，說(shuō)明CHAPPly187是一個(gè)活性非常強(qiáng)的噬菌體裂解酶催化域，這與Mao等［27］報(bào)道單獨(dú)Ply187的CHAP活性很低的結(jié)果不同，主要是因?yàn)樗麄冊(cè)谑褂帽葷岱z測(cè)活性時(shí)，在緩沖液體系中加入一定濃度的NaCl，從而影響了催化域與細(xì)菌細(xì)胞壁之間的靜電吸附［13］?？咕V研究表明，CHAPPly187對(duì)葡萄球菌屬非常專一，相比CATLysn，CHAPPly187對(duì)表皮葡萄球菌和模仿葡萄球菌具有更好的效果，因?yàn)楸砥て咸亚蚓湍７缕咸亚蚣?xì)胞壁肽鍵糖中五甘氨酸肽鍵橋的部分甘氨酸被絲氨酸取代，從而對(duì)CATLysn產(chǎn)生一定的耐受［28］。

環(huán)境pH對(duì)催化域的活性有顯著影響，對(duì)pH的耐受性決定了裂解酶的臨床應(yīng)用范圍，CHAPPly187的最適作用pH為6.0-9.0，比CATLysn（pH 7.0-9.0）寬泛些，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［29］。CATLysn的活性隨著環(huán)境離子強(qiáng)度的升高而急劇下降（圖5），而CHAPPly187催化域在20 mmol/L NaCl時(shí)活性最高，且隨著NaCl濃度的上升，活性緩慢下降，表明CHAPPly187對(duì)離子強(qiáng)度的耐受性優(yōu)于CATLysn。

圖7 二價(jià)金屬離子對(duì)催化域抗菌活性的影響

CHAPPly187和CATLysn的活性中心都帶有二價(jià)金屬離子，當(dāng)檢測(cè)環(huán)境中含1 mmol/L的EDTA時(shí)，EDTA幾乎完全抑制200 nmol/L CHAPPly187的活性；而完全抑制CATLysn的活性，至少需要20 mmol/L以上的EDTA，說(shuō)明CATLysn對(duì)活性中心的金屬離子結(jié)合更加緊密。進(jìn)一步研究二價(jià)金屬離子對(duì)催化域活性的影響，發(fā)現(xiàn)大部分二價(jià)金屬離子在低濃度時(shí)表現(xiàn)出促進(jìn)作用，隨著濃度的升高開始產(chǎn)生抑制作用，而Zn2+和Cu2+主要表現(xiàn)為強(qiáng)的抑制作用。Filatova等［30］研究表明CHAP家族的活性位點(diǎn)需要Ca2+、Mg2+激活。

本研究系統(tǒng)比較了CHAPPly187和CATLysn的生物活性，它們對(duì)臨床主要病原菌金黃色葡萄球菌的抗菌活性都非常強(qiáng)，但在不同條件下，活性表現(xiàn)不盡相同。由于本研究選擇的催化域有限，相信有更好的催化域可被用來(lái)設(shè)計(jì)雜合裂解酶，用于治療耐藥性細(xì)菌感染。在下一步的工作中，將選擇更多的催化域進(jìn)行表達(dá)和活性研究。

4 結(jié)論

本研究是首次將單獨(dú)催化域CHAPPly187與溶葡萄球菌酶的催化域CATLysn進(jìn)行抗菌活性比較，成功地獲得高純度CHAPPly187重組蛋白，并且系統(tǒng)的分析了不同溫度、不同pH、不同離子強(qiáng)度、EDTA和金屬離子等影響因素對(duì)其抗菌活性的影響。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression and Antibacterial Activity of CHAP Catalytic Domain of Staphylococcus aureus Phage Lysin Ply187

WU Meng1LU Hai-rong1，2HUANG Qing-shan1，2
（1. State Key Laboratory of Genetic Engineering，Institute of Genetics，F(xiàn)udan University， Shanghai 200438；2. Shanghai Hi-Tech United Bio-Technological R&D Co. Ltd，Shanghai 201206）

Bacteriophage lysins are efficiently antibacterial proteins，thus systematically analysing the activity of catalytic domain of it is conducive to the design of efficient heterozygous lysins. The coding sequence of the CHAP catalytic domain of Ply187（CHAPPly187）was synthesized，and a recombinant expression plasmid pET28a-CHAPPly187was constructed，which then was transformed into Escherichia coli BL21（DE3）. The highly pure recombinant CHAPPly187protein was produced by IPTG induction，further purified by a two-step method，reaching > 95% purity，and finally compared with the catalytic domain of lysostaphin（CATLysn）. The results from turbidimetry showed that both CHAPPly187and CATLysnpossessed the solid antibacterial activities to Staphylococcus aureus. CHAPPly187showed a much broader antibacterial spectrum and optimal activity in a wider range of the pH，tolerated higher ionic strength，and more easily affected by EDTA. Ca2+，Mg2+，and Mn2+in low concentration significantly promoted the catalytic domains of both proteins，while the Zn2+，Cu2+，and Fe2+in low con centration strongly inhibited the catalytic domains.

bacteriophage lysin；lysostaphin；catalytic domain；CHAP；antibacterial activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.031

2016-01-14

中國(guó)博士后科學(xué)基金（2014M551322），上海市工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心（13DZ2252000）

吳蒙，男，碩士，研究方向：噬菌體裂解酶催化域的抗菌活性；E-mail：mengwu13@fudan.edu.cn

黃青山，男，博士，研究方向：抗腫瘤抗菌新藥的研發(fā)；E-mail：qshuang@fudan.edu.cn