纖維素酶高產菌株Tri choderma atroviride HP35-3原生質體制備及轉化

林艷梅 李瑞杰 張慧杰 秦秀林 馮家勛

（廣西大學生命科學與技術學院 亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 5300 04）

纖維素酶高產菌株Tri choderma atroviride HP35-3原生質體制備及轉化

林艷梅 李瑞杰 張慧杰 秦秀林 馮家勛

（廣西大學生命科學與技術學院 亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 5300 04）

旨在優(yōu)化深綠木霉（Trichoderma atroviride）菌株HP35-3原生質體制備和轉化條件，便于對該菌株進行遺傳操作以提高其纖維素酶產量。分別對制備深綠木霉原生質體的菌齡、酶解時間、酶組分及比例和轉化條件進行優(yōu)化。結果顯示，利用3 mg/mL蝸牛酶、3 mg/mL溶菌酶和3 mg/mL裂解酶酶組分酶解菌齡10 h的菌絲2 h，獲得的原生質濃度達到3.5×107個/mL以上，原生質體再生率為61%。利用原生質體進行PEG介導轉化，當原生質體濃度為1×108個/mL、外源DNA 為5 μg時，轉化率達到35個轉化子/μg DNA。建立的高效原生質體制備及轉化體系可用于深綠木霉的遺傳轉化及菌株改造。

深綠木霉；絲狀真菌；原生質體制備；原生質體轉化

原生質體的制備是絲狀真菌遺傳操作中較為重要的環(huán)節(jié)［1］。原生質體廣泛應用于菌株生理、生化研究［2］；應用原生質體融合技術可進行遺傳育種和菌種改造［3，4］；原生質體轉化技術可用于基因敲除和外源基因的導入等遺傳操作［5］。而這些技術的關鍵是制備一定數量再生率較高的原生質體。

隨著絲狀真菌在工業(yè)酶生產中的應用及其基礎研究的快速發(fā)展，絲狀真菌高效原生質體制備方法的研究也與日俱增。通常情況下，酶解細胞壁所用的酶組成［6］、酶濃度和酶解時間［7］，菌絲的菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑［8］等都是制備高質量原生質體需優(yōu)化的因素。獲得一定數量（≥1.0×106個/mL）原生質體后，其高效再生率對于原生質體轉化和原生質體融合等遺傳操作也至關重要。系統(tǒng)優(yōu)化原生質體制備或（和）再生條件后，立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）［9］原生質體再生率不到50%，短密青霉（Penicillium brevicompactum）［10］和深黃被孢霉（Mortierella isabellina）［11］原生質體再生率只達到約25%，大部分真菌原生質體再生率都較低，一定程度上制約了其在遺傳操作中的應用。而應用較為廣泛的木霉，其原生質體再生率也較低，哈茨木霉（Trichoderma harzianum）［12，13］最適菌齡為15 h以上且再生率低于50%，綠色木霉（Trichoderma viride）［13-15］最適菌齡則多為24 h，原生質體再生率不到35%。因此，優(yōu)化木霉原生質體制備條件，提高其再生率并縮短原生質體制備周期，對木霉進行遺傳改造顯得極其重要。

深綠木霉（Trichoderma atroviride）菌株HP35-3是本實驗室從原始森林篩選獲得的對結晶纖維素（Avicel）降解能力與美國工業(yè)生產菌株Trichoderma reesei Rut-C30相當的絲狀真菌［16］。為了便于對T. atroviride HP35-3進行遺傳改造以進一步提高其纖維素酶產量，本研究對深綠木霉的原生質體制備條件進行了優(yōu)化并建立了其高效 的PEG介導原生質體轉化體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 與 質 粒 深 綠 木 霉（Trichoderma atroviride HP35-3）菌株［16］為本實驗室保存，為廣西花坪自然保護區(qū)采集得到的野生深綠木霉菌株。

用于驗證原生質體轉化效率的質粒pESAY-kanr，具有kanr篩選標記，轉化后使得轉化子具有G418抗性，該質粒由本實驗室構建和保存。

1.1.2 工具酶和試劑 工具酶：蝸牛酶（Snailase），溶菌酶（Lysozyme enzyme），纖維素酶（Cellulase）購自solarbio公司，裂解酶（Lysing enzyme）購自Sigma公司。試劑：抗生素G418購于Solarbio公司。培養(yǎng)基PDA購自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司。其他培養(yǎng)基配制及原生質體制備所需試劑均為國藥分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基和所需溶液 （1）產孢培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯，切碎后煮沸約40 min，使用8層紗布過濾取濾液，定容至1 L，分裝每200 mL至加有4 g葡萄糖、0.2 g酵母提取物和1.5 g瓊脂的500 mL三角瓶中，121℃，20 min滅菌備用。（2）菌絲生長液體培養(yǎng)基CM：50 mL 20×硝酸鹽（NaNO3120 g/L，KCl 10.4 g/L，MgSO4.7H2O 10.4 g/L，KH2PO430.4 g/L），微量元素1 mL（ZnSO4.7H2O 22 g/L，H3BO311 g/L，MnCl2.4H2O 5 g/L，FeSO4.7H2O 5 g/L，CoCl2.6H2O 1.7 g/L，CuSO4.5H2O 1.6 g/L，Na2MoO4.2H2O 1.5 g/L，Na4EDTA 50 g/L），復合維生素1 mL（Biotin 0.1 g/L，PABA 0.1 g/L，Pyridoxin 0.1 g/L，Riboflavin 0.1 g/L，Thiamine 0.1 g/L，Nicotinic 0.1 g/L），D-葡萄糖10 g，蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，酸水解酪蛋白1 g，水補足1 L，自然pH。（3）原生質體再生培養(yǎng)基OCM：酸水解酪蛋白1 g，酵母提取物1 g，蔗糖342 g，瓊脂15 g，水補足1 L，自然pH。（4）篩選培養(yǎng)基PDA：主要成分為馬鈴薯淀粉4 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L。

溶液參照相關文獻［17］配制：（1）0.6 mol/L MgSO4.7H2O，用于收集菌絲后清洗菌絲。（2）OM（1.2 mol/L MgSO4.7H2O，10 mmol/L NaH2PO4，pH 5.8），用于溶解所選用的酶，形成所需酶解液。（3）Trapping Buffer（0.4 mol/L Sorbitol，0.1 mol/L Tris-HCl，pH7.0），在菌體形成原生質體后，滴加至酶解液中，離心時形成密度梯度使得原生質體懸浮于酶解液與Trapping Buffer之間。（4）1 mol/L Sorbitol，清洗原生質體。（5）STC（1 mol/L Sorbitol，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L CaCl2，pH8.0），清洗并保存原生質體。（6）PTC（40% PEG6000，0.1 mol/L Tris-HCl、0.1 mol/L CaCl2，pH8.0），保存原生質體

1.2 方法

1.2.1 菌絲的培養(yǎng) 深綠木霉菌株T. atroviride HP35-3在產孢培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)6-7 d，收集孢子并用0.1%（W/V）Tween-80的滅菌水制備孢子懸浮液（108個/mL）。接種2 mL濃度為1×108個/mL新鮮孢子懸浮液于200 mL CM中，在28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 酶解液的配制 稱取適量的蝸牛酶、溶解酶、裂解酶、纖維素酶及其互配的酶組分，溶解于6 mL體積的OM中，振蕩搖勻約30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌備用。

1.2.3 原生質體制備 將在CM中培養(yǎng)10 h的深綠木霉通過離心收集菌絲，使用0.6 mol/L MgSO4.7H2O清洗兩次，稱取0.1 mg濕重菌絲放入5 mL酶解液中，使用50 mL三角瓶盛放（加入少許的玻璃球用來打散菌絲），并使用移液器吹打使得菌絲盡量分開，在28℃，180 r/min振蕩酶解。酶解結束后，使用血球計數板計算原生質體產量。將酶解液倒入滅菌的50 mL離心管中，置于冰上，用巴氏吸管逐滴滴加Trapping Buffer至2倍體積的酶解液，在4℃，3 500 r/min離心30 min。離心結束后用巴氏吸管將懸浮于酶解液與Trapping Buffer之間的原生質體層吸出并放入干凈的15 mL離心管，加入15 mL的1 mol/L Sorbitol清洗原生質體，重復一次。接著使用STC清洗兩次后，按STC∶PTC為4∶1（V/V）比例重懸原生質體，吸取每100 μL分裝于1.5 mL EP管中，即為深綠木霉原生質體懸浮液，可用于原生質體的再生與轉化。

1.2.4 原生質體再生 原生質體再生采用涂布法，首先在顯微鏡下用血球計數板對原生質體懸浮液進行計數，取100 μL原生質體懸浮液用STC進行適當稀釋，以OCM作為再生培養(yǎng)基，吸取100 μL稀釋好的懸浮液涂布于培養(yǎng)基上。置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，對形成的菌落進行計數（A）。為消除未除盡的菌絲片段或是萌發(fā)較晚的孢子再生出菌落所造成的誤差，同時采用涂布法，將原生質體懸浮液用滅菌水進行等梯度稀釋，并涂布于PDA培養(yǎng)基，其再生菌落數作為對照（B）。顯微鏡下觀察的原生質體數計為（C）。再生率計算：原生質體再生率=［（A-B）/C］×100%［18］。

1.2.5 原生質體轉化 取100 μL原生質體懸浮液，加入適量的DNA，加入6 μL100 mmol/L的亞精胺混勻，冰浴30 min，然后緩緩加入1 mL PTC，混勻后，室溫放置25 min，再加入2 mL STC并混勻，最后將混合物倒入20 mL已融化并于55℃溫浴的OCM中，上下輕輕顛倒混勻后，按每個2-3 mL量倒到干凈的培養(yǎng)皿中，室溫放置1 h。

1.2.6 轉化子的篩選及驗證 將上述在培養(yǎng)皿中再生約1 h的原生質體，在其OCM上層覆蓋含200 μg/mL G418的PDA。在28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)約3 d，培養(yǎng)基表面生長的菌落即為轉化子。

使用牙簽將培養(yǎng)基表面的單菌落挑取適量的菌絲于1.5 mL EP管中，加入適量的液氮并研磨成粉末，使用酚氯仿抽取的方法提取轉化子的基因組DNA，并使用引物G418F（5'AGAAGATGATATTGAAGGAGCATT3'） 和G418R（5'CTAGAAAGAAGGATTACCTCT3'）進行PCR驗證。

PCR體系及參數設置：2×Easy Tag Mix 12.5 μL，引物G418F和G418R各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，共25 μL體系。參數為95℃，預變性5 min；95℃，變性30 s；55℃，退火15 s；72℃，延伸90 s；25個循環(huán)后，72℃延伸10 min。

2 結果

2.1 不同酶組分對T. atroviride HP35-3原生質體產

量影響

選常用的商業(yè)化水解酶蝸牛酶、裂解酶、纖維素酶和溶菌酶來制備不同酶組分的酶解液。取生長10 h濕重為1 mg菌絲至5 mL酶解液中，28℃，180 r/min酶解2 h，檢測所產生的原生質體數量，結果如表1所示。單獨使用纖維素酶（c組）酶解菌絲無原生質體產生，其他組的酶解液酶解菌絲后都能產生原生質體，其中3 mg/mL蝸牛酶、3 mg/mL溶菌酶和3 mg/mL裂解酶（i組）產生的原生質體量最多，因此選用i組酶解液進行后期的原生質體制備。

2.2 菌齡對原生質體制備和再生率的影響

為了考察菌齡對原生質體產量和再生率的影響，接種2 mL濃度為1×108個/mL的T. atroviride HP35-3孢子懸浮液至200 mL的CM培養(yǎng)基中，置于28℃，180 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)24 h，取9、10、11、12和24 h的培養(yǎng)液鏡檢以觀察菌絲生長情況，并用i組酶解液酶解不同菌齡的菌絲（濕重為1 mg）。圖1所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，孢子萌發(fā)、菌絲變長分叉、菌絲量不斷增加；經酶解后，菌齡為9、10 h的菌絲完全被酶解并釋放出原生質體；菌齡為11、12 h的菌絲還殘余部分菌絲；24 h菌齡的菌絲幾乎沒有被酶解，基本無原生質體產生。菌齡為10 h的菌絲經酶解后釋放的原生質體數量最多，再生率達到了60%以上（圖2），故產生原生質體數量和質量最適的菌絲菌齡為10 h。

表1 酶組分對深綠木霉原生質體產量影響

2.3 酶解時間對原生質體產量和再生率的影響

利用i組酶解液對菌齡為10 h的菌絲（1 mg濕重）分別進行1 h、2 h、3 h和4 h酶解，結果如圖3所示。酶解1 h時，有較多的原生質體產生，但菌絲體并沒有完全酶解；酶解2 h時，反應體系中基本沒有菌絲體，原生質體數量最多；酶解3 h和4 h時，原生質體數量銳減，部分原生質體已被降解。菌絲酶解2 h時，制備的原生質體產量（1.5×107個/mL）和再生率均達到最高（69%）（圖4）。因此，制備T.atroviride HP35-3原生質體的最佳酶解反應條件為：利用3 mg/mL蝸牛酶、3 mg/mL溶菌酶、3 mg/mL裂解菌酶組分，取菌齡10 h的菌絲，酶解2 h。

原生質體只有具備高效再生率才便于遺傳轉化。將優(yōu)化條件下酶解得到的原生質體置于再生培養(yǎng)基OCM中培養(yǎng)36 h，其再生率達到69%。

圖1 菌齡對原生質體制備的影響

2.4 原生質體的轉化效率

為了驗證所制備原生質體的轉化效率，將帶有kanr篩選標記的外源DNA片段經PEG介導轉化至T. atroviride HP35-3的原生質體中。當原生質體數量為108個/mL，外源DNA片段為5 μg時，轉化率最高達到35個轉化子/μg DNA（表2）。隨機挑選其中7個轉化子提取基因組DNA并PCR驗證外源DNA片段是否整合至轉化子的基因組中，這7個轉化子基因組中均有目的片段的擴增條帶（圖5），為陽性轉化子。將其中3個陽性轉化子在無抗性培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5次，PCR驗證均檢測到目的片段，表明外源DNA進入深綠木霉原生質體并得到穩(wěn)定傳代。

圖2 菌齡對原生質體產量及再生的影響

圖3 酶解時間對原生質體制備的影響

圖4 酶解時間對原生質體產量及再生的影響

表2 深綠木霉原生質體轉化效率

圖5 PCR驗證轉化子

3 討論

原生質體的制備是絲狀真菌遺傳操作中較為重要的環(huán)節(jié)［1］。絲狀真菌原生質體的制備技術雖然比較成熟，相關的文獻報道也較多［19，20］，但由于菌株間細胞壁成分存在差異，即便使用同一方法制備原生質體，對于不同菌株取得的效果也不盡相同。因此，針對不同的絲狀真菌，必須對酶解反應體系pH、滲透壓穩(wěn)定劑、酶組分、酶濃度、酶解時間和菌齡等條件進行優(yōu)化［7，21，22］，以確定原生質體制備的最佳條件。通常情況下，較中性或堿性條件，弱酸性（pH5.8）環(huán)境更有益于高質量真 菌原生質體的制備［22］。滲透壓會影響原生質體的釋放、再生率及其結構的完整性，而對絲狀真菌原生質體而言，無機鹽溶劑0.6 mol/L MgSO4.7H2O是較好的滲透壓穩(wěn)定劑［20］。因此，將酶解體系中的緩沖體系和滲透壓穩(wěn)定劑分別定為OM溶液（1.2 mol/L MgSO4.7H2O，10 mmol/L NaH2PO4，pH 5.8）和0.6 mol/L MgSO4.7H2O，檢測了不同酶組分、菌齡、酶解時間對深綠木霉原生質體制備產量和再生率的影響。

相對于單一酶，幾種酶配合使用時酶解T. atroviride HP35-3菌絲產生原生質體的數量較多，最佳的酶組分為：3 mg/mL蝸牛酶、3 mg/mL溶菌酶、3 mg/mL裂解酶。張曉立等［23］的研究也發(fā)現類似結果，黑曲霉原生質體得率與酶解體系組成及配比關系密切，利用酶的混合液制備原生質體比單獨使用一種酶的效果好。優(yōu)化酶組分后，一定程度上減少了原生質體制備過程中酶的添加量，本研究中用于制備T. atroviride原生質體的酶濃度均較低為3 mg/ mL，Feng等［9］制備立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）原生質體所用酶的最低濃度為5 mg/mL，You等［14］制備綠色木霉（Trichoderma viride）原生質體所用酶量為10 mg/mL。

絲狀真菌菌齡對于原生質體的制備至關重要，酶解過程中，年輕的菌絲體比較老的菌絲體能更有效的釋放原生質體，這可能是因為年輕菌絲對細胞壁裂解酶的作用更敏感［24］，且減少菌絲培養(yǎng)時間可利于縮短原生質體的制備周期。Tmova等［25］發(fā)現，選用菌齡為15-18 h的綠色木霉（Trichoderma viride）菌絲制備原生質體所得的數量最多。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和長梗木霉（Trichoderma longibrachiatum）［26］制備原生質體的最適菌齡分別為18和24 h。也有報道發(fā)現水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）［7］、普爾頂粘束孢（Graphium putredinis）和哈茨木霉（T. harzianum）［22］制備原生質體的最適菌齡均為24 h，而刺糙青霉（Penicillium echinulatum）［3］的為48 h。這些研究表明，不同真菌盡管同是木霉屬，菌種間制備原生質體的最適菌齡也存在較大差異。本研究發(fā)現，對于T. atroviride HP35-3而言，菌齡10 h的菌絲體制備的原生質體效果最佳，超過該菌齡（特別是菌齡為24 h）的菌絲原生質體產量下降，這可能是因為培養(yǎng)時間過長菌絲較長分叉較多易于結團，導致酶解液無法充分接觸結球菌絲，酶解不完全；也可能是由于菌絲老齡化其細胞壁組成成分比例發(fā)生變化，酶解液無法有效降解細胞壁。相較于哈茨木霉（T. harzianum）［13，26］最適菌齡為16 h和18 h、綠色木霉（Trichoderma viride）［14，15］最適菌齡為24 h，T. atroviride HP35-3最適菌齡則為10 h，時間縮短6 h以上，并且原生質體產量提高了約2倍，再生率也提高了約30%。

酶解菌絲的時間，會影響原生質體的產量及質量，酶解時間太短，菌絲酶解不完全，釋放的原生質體數量少，而原生質體的濃度又會影響其轉化效率；酶解時間太長，釋放的原生質體會被酶解破裂，導致原生質體的質量較差，影響原生質體的再生。本研究發(fā)現，對于菌齡10 h的T. atroviride HP35-3菌絲，酶解2 h制備的原生質體產量和再生率最高，酶解時間比Balasubramanian 等［13］、You等［14］和Savitha等［23］制備木霉原生質體至少縮短1 h。

4 結論

本研究確立了深綠木霉T. atroviride HP35-3原生質體制備和轉化最佳條件：利用3 mg/mL蝸牛酶、3 mg/mL裂解酶和3 mg/mL溶菌酶酶組分酶解菌齡10 h的菌絲2 h，獲得的原生質濃度達到3.5×107個/mL以上，原生質體再生率為61%。當原生質體數量為108個/mL，外源DNA片段為5 μg時，PEG介導轉化率達到35個轉化子/μg DNA。因此，所建立的高效原生質體制備及轉化體系可用于深綠木霉的遺傳轉化及菌株改造。

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（責任編輯 李楠）

Formation and Transformation of Protoplast of Trichoderma atroviride HP35-3 Highly Yielding Cellulase

LIN Yan-mei LI Rui-jie ZHANG Hui-jie QIN Xiu-lin FENG Jia-xun
（College of Life Science and Technology，State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Guangxi University，Nanning 530004）

The purpose of this work is to optimize the conditions of formatting and transforming the protoplast of Trichoderma atroviride HP35-3，aiming at genetically manipulating the strain for increasing the yield of cellulase. The individual condition for formatting the protoplast of Trichoderma atroviride，i.e.，mycelium age，hydrolysis time of enzyme，constituents and ratios of enzymes，as well as transformation conditions were optimized respectively. Results showed that the combination of 3 mg/mL snailase，3 mg/mL lysing enzyme，and 3 mg/mL lysozyme enzyme was effective in releasin g protoplasts from T. atroviride HP35-3 mycelium（at the age of 10 h）after digestion for 2 h，the concentration was ov er 3.5×107protoplasts/mL，and the regenerat ion rate was 61%. The protoplasts were mediated and transformed by PEG，and the transformation rate was 35 transformants/μg DNA when 1×108protoplasts were employed with 5 μg DNA. In conclusion，establishing efficient formation and transformation of protoplasts may be applied in strain improvement and gene transformation of T. atroviride in biotech industries and laboratories.

Trichoderma atroviride；filamentous fungi；formation of protoplast；transformation of protoplast

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.030

2016-01-03

國家自然科學基金項目（31300076），廣西自然科學基金項目（2013GXNSFBA019096）

林艷梅，女，碩士，研究方向：微生物學；E-mail：930231670@qq.com

秦秀林，女，副教授，博士，研究方向：微生物學；E-mail：xiulinqin@gxu.edu.cn