DSPAα1缺失突變體在畢赤酵母中的表達及活性研究

陳韻牛純青宋小雙蘇暢華子春劉堰

（1. 重慶西南大學生命科學學院，重慶 400715；2. 南京大學醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，南京 210093）

DSPAα1缺失突變體在畢赤酵母中的表達及活性研究

陳韻1牛純青1宋小雙1蘇暢1華子春2劉堰1

（1. 重慶西南大學生命科學學院，重慶 400715；2. 南京大學醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，南京 210093）

吸血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑（Desmodus salivary plasminogen activators，DSPAs）共有4種：DSPAα1、α2、β及γ。其中，DSPAα含有指形區(qū)（F）、表皮生長因子區(qū)（E）、kringle區(qū)（K）和絲氨酸蛋白酶區(qū)（P），DSPAβ含E、K、P區(qū)，DSPAγ含K和P區(qū)。以DSPAα1為基礎，研究其結(jié)構(gòu)對纖溶活性的影響。采用重疊延伸PCR技術(shù)（splicing overlap extension PCR，SOE-PCR）獲得缺失E區(qū)的DSPAα1突變體（mDSPAα1），分別構(gòu)建mDSPAα1/pPIC9K、DSPAβ/pPIC9K和DSPAγ/pPIC9K重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）菌株GS115中表達，纖維平板法測活。結(jié)果顯示未檢測到DSPAγ的表達，DSPAα1活性為2.64×105U/mg，DSPAβ的活性為1.32×104U/mg，mDSPAα1活性為151.52 U/mg；同時使用DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ時，總活性幾乎不受影響，單獨使用任意兩者時，發(fā)現(xiàn)活性均降低2-3倍。mDSPAα1纖溶活性幾乎沒有，同時DSPAβ與野生型DSPAα1相比保留了相當?shù)拇呋钚?。DSPAα1的N端區(qū)域可以影響其溶栓活性，而缺失E區(qū)后幾乎喪失活性，說明E區(qū)在DSPAα1溶栓過程中起著至關(guān)重要的作用。

DSPAα1；SOE-PCR；缺失突變體；畢 赤酵母；纖維平板法

吸血蝙蝠唾液中含有可以幫助吸血動物進食的纖溶酶原激活劑，稱為吸血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑（DSPAs）。研究發(fā)現(xiàn)DSPAs有4種形式，分別為：DSPAα1、α2、β及γ。 其 中，DSPAα1和 DSPAα2包含信號肽、指形區(qū)（F）、表皮生長因子區(qū)（E）、kringle區(qū)（K）和絲氨酸蛋白酶區(qū)（P），而DSPAβ缺乏F，DSPAγ缺乏F和P。DSPAs與組織性纖溶酶原激活劑（t-PA）相似，但是不含t-PA分子的K2區(qū)和纖溶酶切割位點［1，2］。

DSPAs 與t-PA不同，對纖溶酶原的激活嚴格要求血纖蛋白作為輔助因子，DSPAs的纖維蛋白依賴性及纖維蛋白選擇性需要其與纖維蛋白結(jié)合來介導，與F區(qū)有關(guān)［3］。DSPAs的4種形式中以DSPAα1的活性最高，研究也最多。同t-PA相比，DSPAα1的血纖蛋白依賴性［4］和選擇特異性更高［5］，當血纖蛋白存在時，DSPAα1的催化速率將提高105倍，而t-PA僅提高550倍。動物實驗證明，重組的DSPAα1的溶栓速度比重組的t-PA更快［6］，對血栓中血纖蛋白選擇性更強，持續(xù)的時間更長。同時，在給藥后， t-PA致使血纖蛋白原、纖溶酶原、α2-抗纖溶酶下降的比例都明顯大于DSPAα1［7-9］。還有研究發(fā)現(xiàn)t-PA用藥后有高分子質(zhì)量的血纖蛋白原降解產(chǎn)物片段的積累，而DSPAα1不積累；t-PA導致纖溶酶原和因子VIII下降，而DSPAα1引起的變化不明顯。從稀有物種中發(fā)現(xiàn)的天然的溶栓物質(zhì)DSPAα1因其絕佳的自然選擇性及對新鮮血栓的溶解作用已經(jīng)被報道用作溶栓藥物［10］。

研究證明［11］，在纖維蛋白凝塊的溶解實驗中，DSPAγ具有溶解纖維蛋白凝塊的能力，但其作用比DSPAα1差，取得相同的溶栓效果時，所需的DSPAγ的量約為DSPAα1的48倍。DSPAα1溶栓性能最為優(yōu)越，具有高度的纖維蛋白結(jié)合特性。血漿凝塊溶解實驗顯示DSPAγ未表現(xiàn)出溶栓作用。因而推斷Finger區(qū)和EGF區(qū)對DSPAα1的功能至關(guān)重要。為此，本研究通過SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建出了缺乏E區(qū)的DSPAα1（命名為mDSPAα1），與DSPAα1、DSPAβ和DSPAγ一起克隆到畢赤酵母中進行表達，隨后采用纖溶平板法進行了活性測定，探討DSPAs結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

畢赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）菌株GS115，質(zhì)粒pPIC9K購自Invitrogen公司，宿主菌E.coil Top10由本實驗室保存。DSPAα1全長由上海生工合成，mDSPAα1、mDSPAα1、DSPAγ引物及測序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。DSPAα1巴斯德畢赤酵母工程菌株由本實驗室構(gòu)建并保存［12］。各類限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，Taq酶，Primer STARTMHS DNA Polymerase等 購 自Takara公 司，RNase購自上海生工。膠回收試劑盒購自BioFlux；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生物。其他試劑為分析純試劑。蛋白電泳儀購自Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒mDSPAα1/pPIC9K、DSPAβ/pPIC9K、DSPAγ/pPIC9K的構(gòu)建 以合成的 pUC57-DSPAa1為模板，設計引物（表1）通過PCR技術(shù)合成mDSPAα1、DSPAβ、DSPAγ。引物1及引物2擴增出F區(qū)，引物3和引物4擴增出KP區(qū)。以F和KP區(qū)為模板，通過引物1和引物4擴增得到F+KP（即mDSPAα1）；引物5和引物6擴增得到EKP區(qū)（即DSPAβ）；引物7和引物8擴增得到KP區(qū)（即DSPAγ）。

將擴增得到的3種PCR產(chǎn)物分別進行 Xho I和EcoR I雙酶切后連接到畢赤酵母表達載體 pPIC9K構(gòu)建重組質(zhì)粒mDSPAα1/pPIC9K、DSPAβ/pPIC9K、DSPAγ/pPIC9K。

1.2.2 重組酵母工程菌的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒mDSPAα1/pPIC9K、DSPAβ/pPIC9K、DSPAγ/pPIC9K分別電轉(zhuǎn)入P. pastoris GS115，通過 5' AOX1 和3' AOX1 引物進行菌落PCR篩選陽性克隆。篩選到的陽性克隆進行G418篩選高拷貝菌株，將只在2-4 mg/mL G418下生長良好的菌株用作表達分析。

1.2.3 重組酵母工程菌的表達 重組mDSPAα1、DSPAα1、DSPAβ和DSPAγ酵母工程菌進行小量表達并分析其表達情況。將工程菌接種到3 mL BMGY培養(yǎng)基，30℃，250 r/min培養(yǎng)至OD600=3-6（約24 h），1 500 g離心5 min，棄上清，將細胞沉淀懸浮于3 mL BMMY培養(yǎng)基中誘導表達。期間，每24 h補加甲醇至終濃度為1%，誘導72 h后取樣。樣品經(jīng)三氯乙酸（TCA）沉淀法處理后進行 SDS-PAGE分析，采用Bradford（CBB）法測定蛋白質(zhì)濃度。

表1 引物表

1.2.4 重組蛋白的活性測定 將重組酵母工程菌進行大量表達，甲醇誘導72 h后，離心收集上清，經(jīng)65%硫酸銨沉淀并透析后，使用纖維平板法對其進行活性測定［13］。

1.2.4.1 標準曲線的繪制 在制備好的纖維平板上打九個孔，分別加入總體積為50 μL總酶活梯度為：0 U、20 U、40 U、80 U、160 U、320 U、640 U、960 U、1 280 U的尿激酶。37℃恒溫觀察12 h乳白色平板透明圈情況。從第2 h開始，每隔2 h記錄一次透明圈直徑（D/mm），截止12 h止。參考以前纖溶平板測定纖溶活性的方法，通過數(shù)學模擬的方法，建立纖溶斑直徑與樣品纖溶酶活性的函數(shù)關(guān)系。通過對纖溶直徑的測量，計算出樣品活性大小。

1.2.4.2 活性測定 向纖維平板中分別加入50 μL 重組 DSPAα1，DSPAβ，DSPAγ 和 mDSPAα1 于37℃孵育，根據(jù)所建立的數(shù)學模型計算出各重組蛋白的活性，活性用比活表示：

比活=上清單位蛋白活性（U/mL）/上清蛋白含量（μg/mL）。

1.2.5 重組蛋白的活性比較 取透析后樣品DSPAα1、mDSPAα1和DSPAβ按照表2混合后滴加在纖溶平板的點樣孔中，經(jīng)4 h后對每個樣品的纖溶直徑（D/mm）進行測量。

表2 樣品添加比例表

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒mDSPAα1/pPIC9K、DSPAβ/ pPIC9K、DSPAγ/pPIC9K的構(gòu)建

以引物1-4為擴增引物，pUC57-DSPAa1為模板，通過SOR-PCR技術(shù)擴增出擴增F+KP區(qū)（即mDSPAα1）大小約為1 218 bp（圖1-A）。以引物5-8為擴增引物，分別擴增出1 176 bp的 EKP區(qū)（即DSPAβ）和約為1 068 bp的KP區(qū)（即DSPAγ）（圖1-B）。對獲得的陽性克隆進行序列測定，分析測定結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 mDSPAα1的PCR結(jié)果（A）、DSPAβ 和DSPAγ的PCR結(jié)果（B）

2.2 重組酵母工程菌的構(gòu)建及表達

將經(jīng)G418篩選到的高拷貝重組克隆mDSPAα1、DSPAβ、DSPAγ酵母工程菌以及本實驗室保存的重組DSPAα1酵母工程菌分別進行小量表達，收集表達上清用TCA（三氯乙酸）法濃縮15倍后進行SDS-PAGE。結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)有DSPAγ的目的條帶；重組DSPAα1在分子量約為66 kD處比GS115多一條可誘導表達的蛋白條帶，與分子量預測值基本相符（圖2-A）；重組mDSPAα1在分子量約為45kD處比GS115多一條可誘導表達的蛋白條帶，與分子量預測值基本相符（圖2-B）；重組DSPAβ在分子量約為43 kD處比GS115多一條可誘導表達的蛋白條帶，與分子量預測值基本相符（圖2-C）。

圖2 重組DSPAα1酵母工程菌（A）、重組mDSPAα1酵母工程菌（B）及重組DSPAβ酵母工程菌表達結(jié)果（C）

2.3 重組蛋白的活性測定

2.3.1 標準曲線的繪制及數(shù)學模型的建立 以測量直徑的平均值為縱坐標，時間為橫坐標，作8個不同活性標準品的變化曲線（圖3-A）；以測量直徑的平均值為縱坐標，活性濃度為橫坐標，作6個時間點上的變化曲線（圖3-B）；以平均直徑的對數(shù)為縱坐標，活性的對數(shù)為橫坐標，作6個時間點上的變化曲線（圖3-C）。分析比較可以看出在6個不同的時間點（2、4、6、8、10、12 h），6條平均纖溶直徑的對數(shù)與活性對數(shù)的變化曲線（圖3-C）較6條平均纖溶直徑的與活性的變化曲線（圖3-B）具有更明顯的線性關(guān)系。因此，利用平均纖溶直徑的對數(shù)同活性對數(shù)之間的變化曲線作為標準曲線更為準確。

通過對實驗數(shù)據(jù)的分析可知，纖溶斑的直徑D與樣品活性U的對數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系。以lgD為自變量，lgU為因變量，利用一元線型回歸方程，擬合兩者之間的關(guān)系式為：lgU=a+b*lgD。

圖3 標準曲線（A）、纖溶直徑與纖溶活性的關(guān)系（B）、纖溶直徑對數(shù)與纖溶活性對數(shù)的關(guān)系（C）

2.3.2 重組蛋白的活性測定 通過對實驗數(shù)據(jù)建立了數(shù)學模型的表達式：lgU=a+b*lgD。應用最小二乘法確定線性回歸系數(shù)a和b，用相關(guān)系數(shù)R2值判斷模型的擬合效果（表3），R2越大，模型的擬合效果越好，方程分析F值檢驗回歸方程顯著性，F(xiàn)值越大，說明回歸顯著。從表3看出，4 h的時候R2最大，因此選取4 h作為最佳活性測定時間，數(shù)學模型表達式為lgU=-8.91+9.20*lgD。

取透析后樣品mDSPAα1和DSPAβ各50 μL滴加在纖溶平板的點樣孔中，經(jīng)4 h后對每個樣品的纖溶直徑（D/mm）進行測量。經(jīng)計算，DSPAα1的活性為2.64×105U/mg，DSPAβ的活性為1.32×104U/mg，mDSPAα1的活性為151.52 U/mg。

表3 不同時間下a、b、R2、F值

2.4 重組DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ的活性比較

纖溶平板測活實驗結(jié)果（表4）表明，將DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ三者按1∶1∶1混合、點樣測活后，發(fā)現(xiàn)同時使用DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ三者時，各自的活性幾乎不受影響，即三者之間不存在相互拮抗作用。當將DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ中任意兩者按1∶1比例混合時，活性均降低2-3倍。

表4 重組蛋白活性比較結(jié)果

3 討論

溶栓藥物的研究已經(jīng)發(fā)展到了第三代，這代藥物向著更安全、更高效的方向發(fā)展，但在副作用方面新一代的藥物較之第二代的藥物，大規(guī)模臨床試驗中，其主要指標如并發(fā)性出血、凝前效應等差異并不顯著，仍不能滿足臨床的需要。因此，更為安全有效的新型溶栓藥物的研制是一項緊迫而艱巨的任務。生理學和藥理學研究發(fā)現(xiàn)DSPAa1具有安全性和耐受性［14，15］。DSPAa1用于急性缺血性中風（DIAS）試驗已部分完成，二期臨床試驗證明它是安全有效的，然而三期臨床試驗沒有得到理想的結(jié)果，雖然安全性沒有問題，但對患者還達不到主要的療效指標，名為DIAS-3 和 DIAS-4的三期臨床試驗仍在進行［16］。人們一直致力于研究DSPAa1，并將其作為新型候選溶栓藥物［17-19］，而研究過程中不可避免地需要大量的原材料。天然的DSPAa1只能從吸血蝙蝠得到，共477個氨基酸，約有30個半胱氨酸形成的二硫鍵。因此，如果在大腸桿菌中表達DSPAa1，會導致其半胱氨酸折疊發(fā)生錯誤而失去活性。目前，已從哺乳動物細胞和昆蟲細胞中獲得DSPAa1［20，21］，但是價格昂貴，不易操作。在過去的15年，甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母已經(jīng)成功表達多種外源蛋白［22］，與釀酒酵母相比，缺少發(fā)生在外部寡糖鏈上的α-1，3鍵連接，糖基化程度低，寡糖鏈上增加的甘露糖殘基數(shù)目較少。因此畢赤酵母中的糖基化可能與哺乳動物細胞中的情況相似。在CHO 細胞和 Sf 9 昆蟲細胞中表達的DSPAa1活性完全相同且在酶活特異性上未見明顯差異［21］，且N-型糖基鏈對畢赤酵母表達的 DSPAα1 分泌和酶活性具有重要作用［23］。因此，畢赤酵母表達系統(tǒng)使大量獲得DSPAa1成為可能，成為開發(fā)新型溶栓藥物的前提。

本研究中構(gòu)建的重組DSPAγ在畢赤酵母表達后并發(fā)現(xiàn)未有目的蛋白出現(xiàn)，分析其原因可能是以下幾方面的因素造成的。蛋白的分泌表達受外源蛋白自身理化性質(zhì)的影響［24］。蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中被加工修飾后的去向是由蛋白自身特點決定。因此，未發(fā)現(xiàn)DSPAγ表達，其空間結(jié)構(gòu)、糖基化位點、氨基酸組成及其它理化特性都影響畢赤酵母對其分泌；對于表達分泌型外源蛋白來說，蛋白酶降解是影響表達量的一個重要因素。因此DSPAγ也有可能是被蛋白酶降解掉。外源蛋白在畢赤酵母中的表達受多種因素的影響，已有許多細菌、真菌和高等動植物的基因在P. pastoris中成功表達（如破傷風毒素片段C，12 g/L）［25］，但也有許多蛋白的表達量并不理想（如多瘤病毒大T 抗原，0. 5 mg/L）［26］，甚至不能表達（如HIV表面糖蛋白）［27］。限于目前對畢赤酵母的了解程度，仍然無法預見某種外源蛋白是否能在其中獲得高產(chǎn)，甚至僅僅能否表達。

本課題組在畢赤酵母中成功表達了重組DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ，同時使用纖溶平板法測得DSPAα1的活性為2.64×105U/mg，DSPAβ的活性為1.32×104U/mg，mDSPAα1的活性為151.52 U/mg。取得相同的溶栓效果時，所需的mDSPAα1的量約為DSPAα1的1 700倍，所需的DSPAβ的量約為DSPAα1的20倍，表明E區(qū)的缺失使得DSPAα1的纖溶活性大大降低，而F區(qū)的缺失對其纖溶能力有一定的影響，但其影響程度遠低于E區(qū)的缺失。由此推測，E區(qū)是DSPA的一個重要的結(jié)構(gòu)域。通過測定同時使用DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ三者和單獨使用其中的任意兩者的溶栓活性發(fā)現(xiàn)，當同時使用DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ時，總活性幾乎不受影響，但當單獨使用任意兩者時，發(fā)現(xiàn)活性均降低2-3倍。對于產(chǎn)生這樣的現(xiàn)象的原因需要進一步的實驗進行探索。

4 結(jié)論

DSPAα1的結(jié)構(gòu)與活性相關(guān)，構(gòu)建了并表達了無F區(qū)的DSPAβ，無E區(qū)的mDSPAα1以及無FE區(qū)的DSPAγ。在測定活性的時候，建立了數(shù)學模型，使測定結(jié)果更為準確可靠。經(jīng)過表達重組DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ后測定其活性，發(fā)現(xiàn)DSPAα1 N端區(qū)域?qū)ζ浠钚院苤匾?，且E區(qū)在DSPAα1溶栓過程中起關(guān)鍵作用。同時，當DSPAα1、mDSPAα1、DSPAβ三者共同存在時，總活性幾乎不受影響，但當單獨使用任意兩者時，活性均降低2-3倍。

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（責任編輯 李楠）

Expression and Activity Analysis of DSPAα1 Deletion Mutants in Pichia pastoris

CHEN Yun1NIU Chun-qing1SONG Xiao-shuang1SU Chang1HUA Zi-chun2LIU Yan1
（1. School of Life Sciences，Southwest University，Chongqing 400715；2. The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology，Nanjing University，Nanjing 210093）

There are 4 types of desmodus salivary plasminogen activators（DSPAs），i.e.，DSPAα1，DSPAα2，DSPAβ and DSPAγ. DSPAα1 and DSPAα2 contain a finger domain（F），an epidermal growth factor domain（E），a kringle domain（K）and a serine proteinase domain（P）；DSPAβ contains E，K and P domains；and DSPAγ contains K and P. The effect of DSPAα1’s structure on fibrinolytic activity was also investigated. A deletion mutant of DSPAα1（mDSPAα1）lacking the E domain was synthesized by splicing overlap extension PCR（SOE-PCR）method，and the recombinant plasmids of mDSPAα1/pPIC9K，DSPAβ/pPIC9K and DSPAγ/pPIC9K were constructed and transformed into Pichia pastoris GS115. Fibrinolytic activity was determined by fibrin plate assay. Results showed that the expression of DSPAγ was not detected，the activities of DSPAα1，DSPAβ，and mDSPAα1 were 2.64 × 105U/mg，1.32 × 104U/mg and 151.52 U/mg respectively. The total activity hardly changed when using DSPAα1，mDSPAα1 and DSPAβ together，but there led a 2-3 folds of reduction by using either two of them. The mDSPAα1 exhibited almost no fibrinolytic activity，whilst DSPAβ retained comparable catalytic activity to the wild-type DSPAα1. Deletion mutant studies illustrated that N-terminal region of DSPAα1 greatly affected the PA activity，and it without E domain nearly lost its activity，indicating that the E domain of DSPAα1 plays a key role during fibrinolytic process.

DSPAα1；SOE-PCR；deletion mutants；Pichia pastoris；fibrin plate assay

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.033

2016-01-08

陳韻，女，碩士研究生，研究方向：生物技術(shù)制藥；E-mail：ailucat@163.com

劉堰，女，博士，教授，研究方向：生物化學與分子藥學；E-mail：liuyan@swu.edu.cn