海洋細(xì)菌Halomonas elongate的次級代謝產(chǎn)物研究

苗子，馬小妮，程軒軒，夏金梅，楊全

(1 .廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物資源遺傳重點實驗室，福建 廈門 361005)

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海洋細(xì)菌Halomonaselongate的次級代謝產(chǎn)物研究

苗子1，2，馬小妮1，2，程軒軒1，夏金梅2，楊全1

(1 .廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物資源遺傳重點實驗室，福建 廈門 361005)

摘要:目的 對具有抗腫瘤活性的海洋細(xì)菌Halomonas elongate進行次級代謝產(chǎn)物的分離、純化及抗腫瘤活性研究。方法 通過大孔吸附樹脂、硅膠、ODS、Sephadex LH-20凝膠柱色譜等分離純化手段，對H. elongate的次級代謝產(chǎn)物進行分離純化；根據(jù)1H NMR譜、13C NMR譜及MS分析，并結(jié)合文獻確定結(jié)構(gòu)；采用MTT法對分離得到的次級代謝產(chǎn)物進行活性檢測。結(jié)果 從海洋細(xì)菌H. elongate的發(fā)酵粗提物中分離鑒定3個化合物，分別為胸腺嘧啶-2′-脫氧核苷(1)、環(huán)(L-甘氨酸-L-脯氨酸)二肽(2)、1-(2′-脫氧-β-D-赤式-呋喃戊糖)-1氫-1,2,4-三嗪酮(3)，活性檢測結(jié)果顯示3個化合物對人肺癌細(xì)胞H1299生長活性均無顯著抑制作用(IC50>20 μmol/L)。結(jié)論 化合物1～3均為首次從Halomonas中分離得到。

關(guān)鍵詞:Halomonas elongate； 海洋細(xì)菌； 次級代謝產(chǎn)物； 結(jié)構(gòu)鑒定

近幾十年來，陸地微生物來源的新先導(dǎo)化合物數(shù)量逐漸減少[1]。海洋微生物因所處的高鹽等極端環(huán)境，形成了獨特的代謝途徑，代謝產(chǎn)物也因此具有更多樣的結(jié)構(gòu)和更廣泛的活性。據(jù)統(tǒng)計，截至2010年，人們已分離得到超過20 000個海洋微生物來源的化合物，其中，以含氮化合物、酰胺、環(huán)肽和吲哚生物堿為主[2-3]。這些化合物大多具有廣泛的活性，如抗菌、抗腫瘤、抗病毒等[2]。因此在陸地微生物資源日益匱乏的今天，海洋微生物成了重要的藥物開發(fā)資源[3]。目前，人們對海洋微生物的研究更多集中于海洋放線菌和海洋真菌，對海洋細(xì)菌的研究較少[4]。

在本實驗室的前期研究中，海洋細(xì)菌Halomonaselongate的發(fā)酵液粗提物經(jīng)活性測試表現(xiàn)出較好的體外抗人肺癌細(xì)胞(H1299)生長活性(在20 μmol/L時，抑制率為80%)。本文對該菌株的次級代謝產(chǎn)物及生物活性進行研究，共分離得到3個化合物，經(jīng)鑒定為胸腺嘧啶-2′-脫氧核苷(1)、環(huán)(L-甘氨酸-L-脯氨酸)二肽(2)、1-(2′-脫氧-β-D-赤式-呋喃戊糖)-1氫-1,2,4-三嗪酮(3)，均為首次從Halomonas分離得到。3個化合物的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1化合物1～3的結(jié)構(gòu)

Figure 1Structures of compounds 1-3

1儀器與材料

1.1菌株

海洋細(xì)菌菌株Halomonaselongate購于ATCC(ATCC 33173)，為革蘭陰性菌，在2216E培養(yǎng)基上菌落呈白色，半透明，表面光滑濕潤，邊緣規(guī)則，無暈環(huán)，菌落形態(tài)大小2～3 mm，生長鹽度為3.4%，最適生長溫度為20～26 ℃，好氧菌。

1.2細(xì)胞

H1299(人肺癌細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海生化細(xì)胞所。

1.3培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，陳海水，pH 7.4～7.6(培養(yǎng)基121 ℃ 高壓滅菌30 min，待冷卻至30 ℃左右使用)。

1.4儀器與材料

Bruker AV500和Bruker AV400核磁共振波譜儀(美國Bruker公司)；Xevo G2 Q-Tof四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化株式會社)；IS-RDS3C恒溫振蕩器(美國精騏有限公司)；分析型薄層色譜硅膠板和柱色譜硅膠(煙臺江友硅膠有限公司)；Sephadex LH-20凝膠(40～70 μm，Amersham Pharmacia)；其余試劑均為市售分析純。

2菌株發(fā)酵和次級代謝產(chǎn)物分離

2.1菌株發(fā)酵

從固體平板培養(yǎng)基上選取大小適中的單菌落，挑取適量接入200 mL液體培養(yǎng)基(置于1 L三角燒瓶)中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h；將一級種子按5%(體積比，下同)接種量，接入1 L液體培養(yǎng)基(置于5 L三角燒瓶)中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h；將二級種子按5%接種量，接入40 L液體培養(yǎng)基(置于50 L發(fā)酵罐)，28 ℃、180 r/min、通氣量28 L/min培養(yǎng)72 h，得到約35 L發(fā)酵液。

2.2發(fā)酵液處理

發(fā)酵液離心后，上清液經(jīng)大孔吸附樹脂梯度洗脫(乙醇-水，10∶90→95∶5)，洗脫液減壓濃縮得到發(fā)酵液浸膏；菌體經(jīng)水混懸，混懸液經(jīng)1 200～1 300 kPa均質(zhì)后，16 000 r/min離心，上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮，合并菌液和菌體提取物，得到發(fā)酵粗提物4 g。

2.3次級代謝產(chǎn)物分離

將粗提物經(jīng)ODS中壓柱(甲醇-水，5∶95→100∶0)，得到17個流分(Fr.1～ Fr.17)。Fr. 13(470.3 mg)經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱色譜洗脫(甲醇)，再經(jīng)正相硅膠柱(100～200目，三氯甲烷-甲醇，體積比5∶1)純化，得到化合物1(16.8 mg)。Fr. 14(344.7 mg)經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱色譜洗脫(甲醇)，再經(jīng)正相硅膠柱色譜(100～200目，三氯甲烷-甲醇，體積比5∶1)純化，得到化合物2(92.1 mg)。Fr. 16(299.2 mg)經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱洗脫(甲醇)，再經(jīng)HPLC(乙腈-水，體積比5∶95)制備，得到化合物3(5.5 mg)。

3化合物鑒定

化合物1：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z184[M-H]-。1H NMR (MeOD，500 MHz)δ：7.82 (1H，d，J=1.5 Hz，H-6)，6.28 (1H，t，J=2.0 Hz，H-1′)，4.61 (1H，s，H-3′)，4.40 (1H，dt，J=6.0，3.5 Hz，H-4′)，3.91 (1H，dt，J=3.5，3.5 Hz，H-5′)，3.80 (1H，m，H-5)，3.75 (3H，s，H-3′)，2.24 (1H，m，H-2′)，1.88(3H，d，J=1.0 Hz，H-7)。13C NMR (MeOD，125 MHz)δ：166.6 (C，C-4)，152.5 (C，C-2)，138.3 (C，C-6)，111.7 (C，C-5)，88.9 (C，C-1′)， 6.4 (C，C-4′)，72.4 (C，C-3′)，63.0 (C，C-5′)，41.3 (C，C-2′)，12.6 (C，C-7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[5]報道一致，故確定化合物1為胸腺嘧啶-2′-脫氧核苷(thymidine)。

化合物2：淡黃色無定形固體(甲醇)，ESI-MSm/z155 [M+H]+。1H NMR (DMSO，500 MHz)δ：4.12 (1H，t，J=8.5 Hz，H-6)，3.99 (1H，d，J=20.5 Hz，H-3a)，3.50 (1H，dd，J=20.5，5.5 Hz，H-3b)，3.35(1H，dd，J=9.5，4.0 Hz， H-5a，H-5b)，2.12 (1H，m，H-7a)，1.85 (1H，m，H-7b)，1.82 (1H，m，H-6a)，1.77 (1H，m，H-6b)。13C NMR (DMSO，125 MHz)δ：169.4 (C，C-1)，163.9 (C，C-4)，58.0 (C，C-9)，45.9 (C，C-5)，44.7 (C，C-3)，27.9 (C，C-7)，22.1 (C，C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[6]報道一致，故確定化合物2為環(huán)(L-甘氨酸-L-脯氨酸)二肽[cyclo(L-Gly-L-Pro)]。

化合物3：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z184 [M+H]+。1H NMR (MeOD，500 MHz)δ： 8.32 (1H，s，H-4)，8.17 (1H，s，H-2)，6.42 (1H，dd，J=11.0，8.0 Hz，H-1′)，4.58 (1H，m，H-4′)，4.08 (1H，m，H-3′)，3.85 (1H，dd，J=12.5，3.0 Hz，H-5′a)，3.75 (1H，dd，J=12.5，3.5 Hz，H-5′b)，2.81 (1H，m，H-2′a)，2.42 (1H，m，H-2′b)。13C NMR (MeOD，125 MHz)δ：153.6 (C，C-2)，141.7 (C，C-4)，90.0 (C，C-1′)，87.3 (C，C-4′)，73.2 (C，C-3′)，63.8(C，C-5′)，41.6 (C，C-2′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[7-8]報道一致，故確定化合物3為1-(2′-脫氧-β-D-赤式-呋喃戊糖)-1氫-1,2,4-三嗪酮[1-(2′-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1H-1,2,4-triazone]。

4體外細(xì)胞生長抑制活性測試

人肺癌細(xì)胞H1299常規(guī)消化后，重懸吹打成細(xì)胞懸液，以每孔200 μL、2×103～5×103個細(xì)胞加入96孔板，以不含細(xì)胞的等量培養(yǎng)液的孔為空白對照；于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入5、10、15、20 μmol/L濃度化合物處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37 ℃避光反應(yīng)3 h；小心吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解；用酶標(biāo)儀測定570 nm波長處的吸光度，計算抑制率。

結(jié)果顯示，化合物1～3對體外人肺癌細(xì)胞H1299生長抑制活性的IC50>20 μmol/L，表明3個化合物對人肺癌細(xì)胞H1299均無抑制活性。

5討論

本研究從海洋細(xì)菌Halomonaselongate中分離得到3個化合物，其中化合物2為環(huán)二肽類化合物。據(jù)報道，海洋微生物環(huán)二肽化合物具有多種活性，如抗菌、抗腫瘤等[9]。本研究中分離得到的1個環(huán)二肽類化合物、1個三唑化合物及1個核苷在體外人肺癌細(xì)胞(H1299)生長抑制活性測試中均無活性，提示這3個化合物可能不是H.elongate次級代謝產(chǎn)物中的抗腫瘤活性成分，H.elongate次級代謝產(chǎn)物中其他活性成分及其生物活性有待擴大發(fā)酵后進一步研究。

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(責(zé)任編輯：陳翔)

Study on the secondary metabolites from the marine bacteriumHalomonaselongate

MIAO Zi1,2,MA Xiaoni1,2,CHENG Xuanxuan1,XIA Jinmei2,YANG Quan1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.KeyLaboratoryofMarineBiogeneticResources,ThirdInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Xiamen361005,China)

Abstract:Objective To isolate and purify antitumor-active secondary metabolites from Halomonas elongate and study their antitumor activity. Methods Compounds were isolated and purified by column chromatography over macroporous resin,silica gel,ODS and Sephadex LH-20. The structures of secondary metabolites were identified by1H NMR,13C NMR,MS and reference data. The cytotoxic assay was performed by using MTT method. Results Three compounds were isolated from the crude abstract of zymotic fluid of H. elongate and identified as thymidine (1),cyclo(L-Gly-L-Pro) (2),and 1-(2′-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1H-1,2,4-triazone (3). All three compounds didn′t show antitumor activity against human lung cancer cell H1299(IC50>20 μmol/L). Conclusion All three compounds were isolated for the first time from the marine bacterium Halomonas elongate．

Key words:Halomonas elongate； marine bacteria； secondary metabolites; structural identification

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015111301

中圖分類號：R284.2

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0029-03

作者簡介：苗子(1989—)，女，2013級碩士研究生，Email：miaoziiris@163.com；通信作者：楊全(1972—)，男，博士，教授，主要從事中藥資源方面研究，Email：yangquan7208@vip.163.com。

基金項目：國家海洋局第三海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(2015028)；海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項經(jīng)費資助項目(GD2012-D01-001)

收稿日期：2015-11-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-15 16:44網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1644.003.html