補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗阿爾茨海默病有效成分的分離與鑒定

董曉紅++劉斌++姚壯++劉海洋+++張艷++周忠光

[摘要] 目的 研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯化學(xué)成分。方法 利用現(xiàn)代植物化學(xué)手段，對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯的水提物進(jìn)行硅膠柱層析，最后通過(guò)制備型液相色譜的方法得到純的化合物單體，并通過(guò)現(xiàn)代波譜學(xué)的方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。結(jié)果 從中共分離并鑒定了5個(gè)化合物，分別為xanthokeisminsA （1）， xanthokeisminsB （2），2'，4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'，5'-dimethylchalcone（3），5，7，3'，4'-tetrahydroxy-2'-（3，3-dimethylallyl） isoflavone （4）和3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1-2）-β-D-glucuronopyranosyl-22-O-β，β-dimethylacryloyl-A1-barrigenol （5）。結(jié)論 化合物1～5均為首次從補(bǔ)陽(yáng)還五湯中分離得到。

[關(guān)鍵詞] 補(bǔ)陽(yáng)還五湯；化學(xué)成分；分離；結(jié)構(gòu)鑒定；阿爾茨海默病

[中圖分類號(hào)] R914 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（b）-0015-03

[Abstract] Objective To investigate the anti-Alzheimer′s disease active ingredients of BuyangHuanwu Decotion. Methods After the decotion was extracted and subjected to silica gel chromatography to obtain subfractions， then the purified compounds were isolated by pre-HPLC method. And their structures were elucidated by comprehensive spectroscopic methods. Results Five compounds were separated and identified as xanthokeismins A （1）， xanthokeismins B （2）， 2'，4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'，5'-dimethylchalcone （3），5，7，3'，4'-tetrahydroxy-2'-（3，3-dimethylallyl） isoflavone （4）， and 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1-2）-β-D-glucuronopyranosyl-22-O-β，β-dimethylacryloyl-A1-barrigenol（5）， respectively. Conclusion Compounds 1-5 were isolated from BuyangHuanwu Decotion for the first time.

[Key words] BuyangHuanwu Decoction； Chemical Constituents； Isolation； Identification ； Alzheimer's Disease

補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、桃仁、川芎、紅花、地龍7味中藥組成。諸藥合用，共奏補(bǔ)氣活血、通經(jīng)活絡(luò)之功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有改善腦血循環(huán)和微循環(huán)[2-3]、促進(jìn)血管新生[4]、抗細(xì)胞凋亡[5-6]、對(duì)抗興奮性氨基酸[7]等藥理作用。補(bǔ)陽(yáng)還五湯以往多用于治療缺血性腦血管疾病[8-10]。本課題組采用大鼠單側(cè)海馬區(qū)定向注射Aβ1-40 復(fù)制阿爾茨海默?。ˋD）動(dòng)物模型，從整體、細(xì)胞、分子和基因水平，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)AD模型大鼠的作用及相關(guān)機(jī)制。研究結(jié)果表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Aβ1-40所致AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯改善作用[11]；可顯著地降低AD模型大鼠海馬和皮質(zhì)Aβ沉積，改善Aβ所造成的神經(jīng)元和微血管損害，減輕腦組織炎性反應(yīng)；并且可以影響免疫炎性細(xì)胞因子及相關(guān)基因的表達(dá)[12-14]。但相關(guān)補(bǔ)陽(yáng)還五湯的化學(xué)成分報(bào)道較少，為明確其抗AD的物質(zhì)基礎(chǔ)，本文對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯的化學(xué)成分進(jìn)行研究，以闡明該方藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。從復(fù)方中分離并鑒定了5個(gè)化合物，分別為xanthokeisminsA（1）， xanthokeisminsB （2），2'，4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'，5'-dimethylchalcone（3），5，7，3'，4'-tetrahydroxy-2'-（3，3-dimethylallyl） isoflavone （4）和3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1-2）-β-D-glucuronopyranosyl-22-O-β，β-dimethylacryloyl-A1-barrigenol （5）。

1 儀器與材料

Bruker 400 核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司），硅膠（200～300目）、硅膠板（高效板）（青島海洋化學(xué)有限責(zé)任公司），制備型高效液相色譜儀（Agilent 1200），XBridge Prep C18 （10 μm，10 mm×250 mm），高效液相色譜用化學(xué)試劑為色譜純（ThermoFisher公司），Quintix125D-1CN分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）。復(fù)方中藥材購(gòu)自河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)陳效忠副教授分別鑒定為黃芪、歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁和紅花。

2 提取分離

將該復(fù)方（黃芪1200 g、歸尾60 g、赤芍45 g、地龍30 g、川芎30 g、桃仁30 g、紅花30 g）經(jīng)水煮3次，合并濾液，濃縮后經(jīng)石油醚（體積比1︰1）萃取3次，得余下水提物550 g，選用氯仿-甲醇系統(tǒng)進(jìn)行硅膠柱層析，根據(jù)薄層色譜鑒別的方法合并相同/相似餾分，得10個(gè)部分（Fr1～Fr10），其中Fr8（30 g）多次通過(guò)石油醚-丙酮，氯仿-丙酮系統(tǒng)，硅膠柱層析的方法，后經(jīng)制備型HPLC（甲醇-水作為洗脫劑）的方法得到化合物1 （18.0 mg）， 2 （22.5 mg），3 （27.6 mg），4（15.0 mg），5 （10.5 mg）和6 （22.3 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

3.1 化合物1

淡黃色油狀，溶于氯仿-甲醇混合溶劑。1HNMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.46（1H，d，J=15.4 Hz，H-α），7.84（1H，d，J=8.8 Hz，H-β），7.55（1H，d，J=8.8 Hz，H-2），6.87（1H，d，J=8.8 Hz，H-3），6.88（1H，d，J=8.8 Hz，H-5），7.56（1H，d，J=8.8 Hz，H-6），6.43（1H，d，J=8.8 Hz，H-5'），7.71（1H，d，J=8.8 Hz，H-6'），3.45（2H，d，J=7.0 Hz，H-1''），5.34（1H，m，J=7.0 Hz，H-2''），2.76（2H，d，J=6.6 Hz，H-4''），5.70（1H，m，J=15.8，6.6 Hz，H-5''），5.68（1H，d，J=15.8 Hz，H-6''），1.34（3H，s，H-8''），1.34（3H，s，H-9''），1.83（3H，s，H-10''）；13CNMR（CDCl3，100 MHz）δ：192.2（C=O），117.6（C-α），144.3（C-β），126.9（C-1），130.6（C-2），116.0（C-3），159.6（C-4），116.0（C-5），130.5（C-6），113.7（C-1'），161.9（C-2'），115.3（C-3'），163.8（C-4'），107.3（C-4'），129.1（C-6'），21.9（C-1''），123.1（C-2''），134.6（C-3''），42.7（C-4''），129.5（C-5''），134.9（C-6''），82.1（C-7''），24.5（C-8''），24.4（C-9''），16.4（C-10''）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定化合物為xanthokeismins A，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

3.2 化合物2

淡黃色油狀，溶于氯仿-甲醇混合溶劑1HNMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.46（1H，d，J=15.2 Hz，H-α），7.85（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），7.58（1H，d，J=8.2 Hz，H-2），6.91（1H，d，J=8.2 Hz，H-3），6.91（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），7.58（1H，d，J=8.2 Hz，H-6），6.49（1H，d，J=8.7 Hz，H-5'），7.95（1H，d，J=8.7 Hz，H-6'），5.64（1H，d，J=3，5 Hz，H-1''），4.52（1H，d，J=3，5 Hz，H-2''），2.38（1H，dd，J=14.0，6.6 Hz，H-4''），2.45（1H，dd，J=14.0，6.6 Hz，H-4''），5.79（1H，m，J=15.9，6.6 Hz，H-5''），5.72（1H，d，J=15.9 Hz，H-6''），1.36（3H，s，H-8''），1.34（3H，s，H-9''），1.19（3H，s，H-10''）；13CNMR（CDCl3，100 MHz）δ：190.8（C=O），115.0（C-α），143.5（C-β），124.9（C-1），129.1（C-2），114.4（C-3）158.5（C-4），114.4（C-5），129.2（C-6），114.6（C-1'），160.8（C-2'），115.4（C-3'），165.6（C-4'），100.8（C-4'），132.2（C-6'），68.4（C-1''），95.5（C-2''），71.1（C-3''），40.3（C-4''），123.4（C-5''），137.2（C-6''），80.1（C-7''），22.9（C-8''），22.6（C-9''），20.2（C-10''）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定化合物2為xanthokeismins B，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

3.3化合物3

橘色粉末，溶于甲醇溶液。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.66（1H，d，J=7.2 Hz，H-2），7.44（1H，m，H-3），7.44（1H，m，H-4），7.44（1H，m，H-5），7.67（1H，d，J=7.2 Hz，H-6），8.01（1H，d，J=15.7 Hz，H-α），7.86（1H，d，J=15.7 Hz，H-β），2.16（3H，s，CH3-3'），2.17（3H，s，CH3-5'），3.68（3H，s，OCH3-6'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定化合物為2'，4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'，5'-dimethylchalcone，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

3.4化合物4

橙色粉末，溶于甲醇溶液。1HNMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.89（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），6.29（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），6.43（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），6.76（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），6.56（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），3.30（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），5.08（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），1.43（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），1.52（1H，d，J=15.2 Hz，H-β）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定化合物4為5，7，3'，4'-tetrahydroxy-2'-（3，3-dimethylallyl）isoflavone，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

3.5化合物5

白色無(wú)定型粉末，溶液甲醇溶液。1HNMR（CDCl3， 400 MHz）δ：0.72（2H，H-1a），1.28（2H，H-1b），1.73（1H，H-2a），2.09（1H，H-2b），3.21（1H，dd，J=10.5，5.5 Hz，H-3），0.71（1H，H-5），1.21（2H，H-6a），1.44（2H，H-6b），1.95（2H，H-7），2.03（2H，H-7），1.61（1H，H-9），1.77（2H，H-11a），1.83（2H，H-11b），5.52（1H，m，t，J=3.0 Hz，H-12），4.21（1H，d，J=3.8 Hz，H-15），4.48（1H，d，J=3.8 Hz，H-16），2.97（1H，dd，J=13.6，3.0 Hz，H-18），1.29（2H，H-19a），2.79（2H，t，J=13.6 Hz，H-19b），1.93（3H，H-21a），2.68（3H，t，J=10.9 Hz，H-21b），6.02（1H，dd，J=10.9，4.0 Hz，H-22），1.14（3H，s，H-23），0.89（3H，s，H-24），0.75（3H，s，H-25），1.01（3H，s，H-26），1.78（3H，s，H-27），3.52（1H，d，J=10.9 Hz，H-28a），3.71（1H，d，J=10.9 Hz，H-28b），0.99（3H，s，H-29），1.21（3H，s，H-30）；GlcA4.78（1H，d，J=7.2 Hz，H-1），4.50（1H，H-2），4.04（1H，t，J=8.0 Hz，H-3），4.12（1H，H-4），4.38（1H，t，J=8.7 Hz，H-5）；Rha5.84（1H，m，H-1），4.87（1H，m，H-2），4.54（1H，H-3），4.18（1H，H-4），4.84（1H，H-5），1.52（1H，d，J=5.8 Hz，H-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]基本一致，故鑒定化合物為3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1-2）-β-D-glucuronopyranosyl-22-O-β，β-dimethylacryloyl-A1-barrigenol，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

4討論

AD的治療一直是醫(yī)學(xué)界的難題，從中藥中尋找多成分、多靶點(diǎn)、毒副作用小的AD治療藥物是一種有效途徑[15-17]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯具補(bǔ)氣活血、通經(jīng)活絡(luò)之功效，藥理實(shí)驗(yàn)表明該復(fù)方對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯改善作用，具有抗阿爾茨海默病的作用，為弄清其藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，本文開展了相應(yīng)的化學(xué)方面的研究工作[18-20]。從復(fù)方中分離并鑒定了5個(gè)主要的化合物，這些化合物可能是治療阿爾茨海默病的效用物質(zhì)。

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（收稿日期：2017-01-10 本文編輯：王 麗）