列當(dāng)中1個(gè)新的苯乙醇苷類(lèi)化合物

張薔蓉

[摘要]為進(jìn)一步了解列當(dāng)Orobanche coerulescens全草的化學(xué)成分。采用大孔樹(shù)脂柱色譜、硅膠柱色譜和反相ODS柱色譜等色譜分離技術(shù)對(duì)列當(dāng)O coerulescens全草中的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)地分離和純化，通過(guò)NMR和MS等波譜學(xué)方法確定了分離得到的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。從列當(dāng)全草的50%乙醇提取物中分離得到1個(gè)新的苯乙醇苷類(lèi)化合物，鑒定為2（3甲氧基4羥基苯基）乙醇1O[（1→3）OαL鼠李糖基4， 6O二阿魏?；鵠βD葡萄糖苷。化合物1為新的苯乙醇苷類(lèi)化合物，命名為列當(dāng)苷B。經(jīng)抑菌活性篩選，列當(dāng)苷B具有一定的抑菌活性，為列當(dāng)?shù)闹饕钚猿煞种?，為該藥材進(jìn)一步活性研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]列當(dāng)； 提取分離； 結(jié)構(gòu)鑒定； 苯乙醇苷類(lèi)化合物； 抑菌活性

[Abstract]The constituents of the whole plant of Orobanche coerulescens were isolated and purified by using various column chromatographic techniques including D101， silica gel and ODS The structures were identified by spectroscopic analyses including NMR and MS A new phenylethanol glycoside was isolated from the whole plant of O coerulescens， and was identified as 2（3methoxy4hydroxyphenyl）ethanol1O [（1→3）OαLrhamnopyranosyl4， 6Odiferuloyl]βDglucopyranoside， named as orobancheoside B Through the antibacterial activity test， orobancheoside B was proved to have certain antibacterial activity， and be one of the main active components of O coerulescens The research result will laid a foundation for the medicinal materials and quality control research Activity screening， broomrape orobancheoside B has certain antibacterial activity， as one of the main active components of O coerulescens， and to constantly improve the quality of the medicinal materials laid a foundation

[Key words]Orobanche coerulescens； extraction and isolation； structure identification； phenylethanoid glycosides； antibacterial activity

列當(dāng)Orobanche coerulescens Steph為列當(dāng)科列當(dāng)屬二年生或多年生寄生草本植物，別名紫花列當(dāng)、兔子拐棍、獨(dú)根草，廣泛分布于內(nèi)蒙古自治區(qū)，東北、西北和華北等地也有分布[1]。列當(dāng)全草可藥用，性溫、味甘，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、潤(rùn)腸的功效，主治腎虛、陽(yáng)痿遺精、腰腿冷痛、神經(jīng)官能癥、小兒腹泄、消腫、腸炎、痢疾等，蒙醫(yī)用于治療炭疽[2]，列當(dāng)也是傳統(tǒng)中藥肉蓯蓉的代用品 [1，3]，可用于緩解肉蓯蓉植物資源匱乏，擴(kuò)大藥源，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。國(guó)內(nèi)外有關(guān)列當(dāng)化學(xué)成分的研究報(bào)道認(rèn)為，苯乙醇苷類(lèi)化合物是其主要活性成分[48]。為了進(jìn)一步闡明其藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，以便于更好的開(kāi)發(fā)利用該藥材，本研究對(duì)列當(dāng)50%乙醇提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，分離得到1個(gè)新的苯乙醇苷類(lèi)化合物，命名為列當(dāng)苷B（orobancheoside B），化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

1材料

UV1780型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；Nicolet 6700 傅里葉紅外變換紅外光譜儀（Thermo Fisher 公司）；DRX500核磁共振儀（Bruker公司）；雙壓線(xiàn)性離子阱串聯(lián)高分辨質(zhì)譜orbitrap Velos Pro（Thermo Fisher 公司）；Waters 2996 HPLC色譜儀配置PDA二極管陣列檢測(cè)器（Waters公司）；C18反相硅膠（40～60 μm，Merk公司）；D101大孔樹(shù)脂（天津浩聚樹(shù)脂科技有限公司）；柱色譜用硅膠（青島海洋化工廠(chǎng)）；氯仿，甲醇均為AR級(jí)試劑（北京化工廠(chǎng)），水為自制蒸餾水。

列當(dāng)藥材于2009年9月采集于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟西烏珠穆沁旗，由南京中醫(yī)藥大學(xué)王春根教授鑒定為列當(dāng)科列當(dāng)屬植物列當(dāng)O coerulescens，憑證標(biāo)本保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。

2實(shí)驗(yàn)部分

21提取與分離列當(dāng)干燥全草10 kg，粉碎后用50%乙醇50 L加熱回流提取3次，每次15 h，合并提取液，濃縮至約10 L。采用D101大孔樹(shù)脂柱分離，依次分別用水、30%乙醇、60%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集60%乙醇洗脫部分，回收溶劑，得浸膏40 g，將這40 g浸膏加100 g硅膠（100～200目）拌樣，另取硅膠1 000 g（100～200目），氯仿濕法裝柱，干法上樣，依次以氯仿甲醇50∶1，20∶1，10∶1，5∶1梯度洗脫，分別收集各洗脫餾分，回收溶劑。

取40～60 μm C18反相硅膠200 g，以40%甲醇濕法裝柱（40 mm × 600 mm），將前述氯仿：甲醇（10∶1）洗脫部分以少量60%甲醇溶解，濕法上樣，60%甲醇洗脫，以TLC檢測(cè)，得化合物1（20 mg），見(jiàn)圖1。

22水解反應(yīng)與糖的鑒定化合物1的水解及衍生化反應(yīng)：取化合物1（15 mg），加入2 mol·L-1 HCl（4 mL），于90 ℃水浴中反應(yīng)2 h。加入等體積水飽和的醋酸乙酯萃取，移除醋酸乙酯層，將水層蒸干，加入左旋半胱氨酸甲酯鹽酸鹽（25 mg）于無(wú)水吡啶取1 mL溶解，置于60 ℃水浴下反應(yīng) 1 h。再加入鄰甲苯基異硫代異氰酸酯（5 μL），繼續(xù)在60 ℃下反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后，直接作為供試品，進(jìn)行 HPLC 分析。單糖對(duì)照品D葡萄糖和L鼠李糖各15 mg，采用相同的方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)后直接作為HPLC供試品。HPLC 分析條件：色譜柱為Cosmosil C18MSI（46 mm ×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相為25%乙腈（含 001%甲酸）；體積流量08 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng) 250 nm。

23抑菌實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）用MuellerHinton肉湯在37 ℃下培養(yǎng)24 h，然后用09% NaCl溶液稀釋至約05 McFarland標(biāo)準(zhǔn)濃度。化合物1用DMSO溶解，然后用二倍稀釋法得到一系列濃度。1 mL溶液與9 mL MuellerHinton瓊脂混合，最終化合物1在瓊脂中的質(zhì)量濃度256～1 mg·L-1。每點(diǎn)2 μL大約為15 × 104 CFU·mL-1的菌種被接種于瓊脂上，然后37 ℃下培養(yǎng)24 h。以肉眼觀(guān)察到的最低抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度為該化合物的最小抑制濃度（MIC）。每個(gè)濃度平行3次。2% DMSO作為空白的陰性對(duì)照。以抗生素甲氧西林為陽(yáng)性對(duì)照。

3結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色無(wú)定形粉末，Molish反應(yīng)呈紫紅色，說(shuō)明該化合物為糖苷類(lèi)化合物。紅外光譜中1 698 cm-1處吸收峰說(shuō)明化合物結(jié)構(gòu)中含共軛羰基結(jié)構(gòu)，而1 633 cm-1處吸收峰顯示化合物結(jié)構(gòu)中含苯環(huán)結(jié)構(gòu)；UV （MeOH） λmax（log ε）： 326 nm （33）；HRESIMS m/z 851272 8 [M+Na]+，提示化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為828，分子式為C41H48O18 （計(jì)算值：851273 8 [M+Na]+），不飽和度為18。

化合物1的1HNMR，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，譜中含有3組典型的苯環(huán)ABX取代：分別是：δH661 （1H，dd，J=80，20 Hz），669 （1H，d，J=20 Hz），664 （1H，d，J=80 Hz）；δH 676 （1H，d，J=80 Hz），702 （1H，dd， J=80，20 Hz），706（1H，d，J=20 Hz）以及δH 672 （1H，d，J=80 Hz），692 （1H，dd， J=80，20 Hz），714（1H，d，J=20 Hz）。2組低場(chǎng)區(qū)氫信號(hào)δH 626 （1H，d，J=160 Hz），758 （1H，d，J=160 Hz）以及δH 634 （1H，d，J=160 Hz），765 （1H，d，J=160 Hz）說(shuō)明結(jié)構(gòu)中存在2個(gè)反式雙鍵。

根據(jù)化合物1的13CNMR譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1及DEPT譜中δC 1692，1687信號(hào)可判斷2個(gè)酯羰基的存在；根據(jù)1HNMR中δH 111 （3H，d，J=60 Hz），521 （1H，br s）和13CNMR中δC 189，1035推測(cè)存在αL鼠李糖結(jié)構(gòu)，而1HNMR中δH 441 （1H，d，J=80 Hz）是典型的βD葡萄糖端基氫信號(hào)，結(jié)合13CNMR中δC 1049，649信號(hào)可推測(cè)βD葡萄糖的存在；將化合物1水解后衍生化進(jìn)行HPLC分析，并與對(duì)照品對(duì)照，進(jìn)一步驗(yàn)證化合物1中含有D葡萄糖（tR=2054 min）和L鼠李糖（tR=3247 min）?；衔?與已知化合物列當(dāng)苷A[9]的結(jié)構(gòu)極其類(lèi)似，主要區(qū)別在于化合物1比列當(dāng)苷A多1個(gè)阿魏?；鄙偈罄钐?位的乙?；〈??；衔?的HMBC相關(guān)可以進(jìn)一步證實(shí)以上推斷。

HMBC譜中，化合物1中葡萄糖端基氫δH 441 （1H，d，J=80 Hz）與C8（δC 726）遠(yuǎn)程相關(guān)，提示葡萄糖與苯乙醇連接成苷。鼠李糖端基氫δH 521 （1H，br s）與葡萄糖3′位碳信號(hào)δC 818遠(yuǎn)程相關(guān)，說(shuō)明鼠李糖與葡萄糖3′位相連接。葡萄糖4′位氫信號(hào)δH 503 （1H，m） 與羰基碳信號(hào)C9″（δC 1687）遠(yuǎn)程相關(guān)，說(shuō)明一個(gè)阿魏酰基與葡萄糖4′位相連；葡萄糖6′位氫信號(hào)δH 436 （1H，m），446 （1H，m） 與化合物1的另一個(gè)羰基碳信號(hào)C9″（δC 1692）遠(yuǎn)程相關(guān)，說(shuō)明另一個(gè)阿魏?；c葡萄糖6′位相連。另1HNMR譜中的δH 376 （3H，s），381 （3H，s），378 （3H，s）信號(hào)與13CNMR譜中的δC 570，569，569信號(hào)都說(shuō)明化合物1含有3個(gè)OCH3信號(hào)，根據(jù)NOESY譜，見(jiàn)圖2，δH 376 （3H，s）與δH 669 （1H，d，J=20 Hz），δH 381 （3H，s）與δH 706 （1H，d，J=20 Hz），δH 378 （3H，s）與δH 714 （1H，d，J=20 Hz）的相關(guān)信號(hào)以及苯環(huán)的取代類(lèi)型，可以確定3個(gè)OCH3分別與3個(gè)苯環(huán)的3位相連。

綜上所述，化合物1鑒定為2（3甲氧基4羥基苯基）乙醇1O[（1→3） OαL鼠李糖基4，6 O二阿魏?；鵠βD葡萄糖苷，見(jiàn)圖1?；衔?的1HNMR，和13CNMR數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1。該化合物為一新化合物，將其命名為列當(dāng)苷B（orobancheoside B）。將化合物1進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)試，測(cè)得其MIC 為128 mg·L-1（陽(yáng)性對(duì)照甲氧西林MIC為2 mg·L-1），說(shuō)明其具有一定的抑菌活性。

4討論

列當(dāng)傳統(tǒng)功效有治療腸炎、痢疾、胃痛、腹痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等各類(lèi)疼痛，現(xiàn)代藥理研究證明苯乙醇苷類(lèi)成分具有很好的抗菌、抗炎、抗氧化、增強(qiáng)記憶力等作用[1011]。本研究分離鑒定出的化合物1為苯乙醇苷類(lèi)化合物，并通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)證明了其具有一定的抗菌作用，進(jìn)一步說(shuō)明其活性成分與傳統(tǒng)療效一致。此外，列當(dāng)抗氧化作用使其在防癌、抗衰老方面具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值[12]，這為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用列當(dāng)提供了廣闊前景。鑒于其廣泛而獨(dú)特的生物活性，列當(dāng)?shù)幕钚猿煞峙c藥理藥效價(jià)值值得進(jìn)一步的研究與開(kāi)發(fā)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志. 第69卷[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1999：109

[2]邵紅霞， 楊九艷， 鞠愛(ài)華蒙藥列當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)成分研究[J]中華中醫(yī)藥雜志， 2011（1）：129

[3]馬毓泉內(nèi)蒙古植物志第4卷[M]呼和浩特： 內(nèi)蒙古人民出版社， 1993：347

[4]趙軍，閆明，黃毅，等紫花列當(dāng)化學(xué)成分的研究[J]中藥材，2007， 30（10）：1255

[5]邵紅霞，楊九艷，鞠愛(ài)華，等. 蒙藥列當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)成分研究[J]中華中醫(yī)藥雜志，2011， 26（1）：129

[6]Murayama T，Yanagisawa Y，Kasahara A，et al. A novel phenylethanoid isocrenatoside isolated from the whole plant of Orobanche caerulescens [J]. Nat Med， 1998， 52（5）：455

[7]Lin L C， Chiou W F， Chou C J. Phenylpropanoid glycosides from Orobanche caerulescens [J]. Planta Med， 2004， 70（1）：50.

[8]趙軍，閆明，黃毅，等. 紫花列當(dāng)水溶性成分研究[J]天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2009， 21（4）：619

[9]王李俊，楊琴，王飛，等. 列當(dāng)中1個(gè)新的苯乙醇苷化合物[J]. 中草藥， 2016， 47（8）：1269

[10]曲正義， 金銀萍， 孫成賀，等. RPHPLC同時(shí)測(cè)定向日葵列當(dāng)中苯乙醇苷類(lèi)化合物crenatoside和類(lèi)葉升麻苷[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2014， 20（10）：87

[11]買(mǎi)提卡司木·買(mǎi)提托合提. 列當(dāng)藥用功能及維吾爾醫(yī)臨床應(yīng)用價(jià)值[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥， 2012， 21（20）：29

[12]許國(guó)青，王曉琴，崔佳穎，等. 傳統(tǒng)藥物黃花列當(dāng)提取物清除DPPH的活性研究[J]. 中國(guó)民族醫(yī)藥雜志， 2012，18（9）：40.[責(zé)任編輯丁廣治]