慢性乙型肝炎的免疫治療研究進(jìn)展*

喬艷綜述，徐東平，李進(jìn)審校

·綜述·

慢性乙型肝炎的免疫治療研究進(jìn)展*

喬艷綜述，徐東平，李進(jìn)審校

臨床上應(yīng)用的抗乙型肝炎病毒（HBV）藥物主要有干擾素和核苷（酸）類似物兩類，在大多數(shù)慢性HBV感染者即使經(jīng)過長期的抗病毒治療仍不能徹底清除病毒。感染的控制和病毒的清除有賴于機(jī)體的免疫系統(tǒng)。感染慢性化與機(jī)體特異性免疫功能，尤其是細(xì)胞免疫功能低下密切相關(guān)。通過增強(qiáng)抗HBV感染的免疫治療是被人們寄予厚望的一種治療策略。目前研究的熱點(diǎn)主要包括免疫激動劑、特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）負(fù)調(diào)節(jié)分子阻斷劑、特異性CTL調(diào)節(jié)分子激動劑或佐劑、治療性疫苗、特異性T細(xì)胞受體（TCR）轉(zhuǎn)基因技術(shù)、攜帶嵌合抗原受體的T細(xì)胞和多糖類物質(zhì)等，本文對近年來這方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

慢性乙型肝炎；免疫治療；進(jìn)展

【Abstract】There are two categories of antiviral agents that have been commonly used in treatment of patients with chronic hepatitis B，e.g.interferons and nucleos（t）ide analogues.Most patients fail to obtain eradication of HBV even receiving a long-term treatment.Disease control and viral clearance depend on the host’s immune responses，which is closely associated with specific-immunity，especially cellular immunity.Strategies of immunotherapies to boost or restore the virus-specific immune response of patients with chronic hepatitis B virus infection have been proposed for curing persistent infections.Currently，researches on immunotherapies focused on Toll-like receptors（TLR）agonists，negative immunomodulatory molecules of cytotoxic T lymphocyte（CTL），CTL agonists，therapeutic vaccinations，specific T cell receptor（TCR）transgenic technology，chimeric antigen receptor T（CAR-T）cells，small molecule，etc.This review summarizes the recent progress in the above researches.

【Keywords】Chronic hepatitis B；Immune therapy；Progress

每年世界范圍內(nèi)約有100萬人死于慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis，CHB）所致的肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。干擾素、核苷類似物及胸腺肽等藥物已被廣泛用于HBV感染的治療，但治療效果還不盡如人意，而且長期使用易產(chǎn)生耐藥變化，不能有效清除病毒共價閉合環(huán)狀DNA（Covalently closed circular DNA，cccDNA），因此需要尋找更有效的治療方案。近來研究表明，CHB患者應(yīng)用或者聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)治療能夠得到良好的效果，乙型肝炎的免疫治療具有良好的前景。本文就慢性乙型肝炎的免疫治療研究進(jìn)展作一綜述。

1　以模式識別受體為靶向的T oll樣受體（T LRs）激動劑

TLRs是一類可以識別病原體并迅速啟動天然免疫反應(yīng)的跨膜蛋白，他們也可以調(diào)節(jié)機(jī)體的獲得性免疫及組織的炎癥反應(yīng)，是機(jī)體感知、抵御及清除病原體的關(guān)鍵分子。TLRs屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成，廣泛分布于樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC）、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等參與機(jī)體免疫反應(yīng)的細(xì)胞上。TLRs活化后促使機(jī)體產(chǎn)生干擾素（Interferon，IFN）和其他炎性細(xì)胞因子，激活其他細(xì)胞基因，從而誘導(dǎo)HBV感染后的抗病毒反應(yīng)。此外，TLRs還能通過細(xì)胞因子-非依賴途徑抑制HBV的復(fù)制[3]。事實(shí)上，已經(jīng)有研究者證明TLRs配體、RIG-I/MDA5配體、MyD88、TRIF、MAVS過度表達(dá)后人類肝細(xì)胞內(nèi)的HBV mRNA和DNA水平會明顯降低[4]。一種TLR7激動劑GS-9620正在投入Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，這種TLR7激動劑的功能在于誘導(dǎo)產(chǎn)生有抗病毒功能的IFN并直接激活NK細(xì)胞和pDC細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)[5]。雖然在健康受試者中給予大劑量（8～12 mg）藥物會導(dǎo)致流感樣副作用，但是小劑量（2 mg）藥物也同樣可以獲得理想的細(xì)胞因子產(chǎn)生，該結(jié)果提示GS-9620在慢性病毒感染治療中是安全的，且耐受性好，并且與誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-α水平具有顯著的相關(guān)性，具有較好的應(yīng)用前景[6，7]。HEPLISAV是由乙型肝炎病毒表面抗原和有免疫刺激能力的ISS1018為佐劑構(gòu)建而成的TLR9激動劑疫苗，已完成了預(yù)防和治療乙型肝炎病毒感染的III期臨床試驗(yàn)[8，9]。在該試驗(yàn)中，HEPLISAV的有效劑量比目前臨床許可的乙肝疫苗劑量小，且兼具見效快且防護(hù)力強(qiáng)的特點(diǎn)。另外，TLRs也作為免疫佐劑在越來越多的文獻(xiàn)中有報道。最近，Zhang et al[10]發(fā)現(xiàn)TLR3、TLR2和TLR3介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)可以控制HBV感染。Kapoor et al[11]總結(jié)了在慢性HBV感染中TLR9和TLR7所發(fā)揮的作用。目前，TLR激動劑的應(yīng)用越來越廣泛，TLR激動劑的使用有望成為慢性乙型肝炎免疫治療的一個潛在的方向。

2　特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic Tlymphocytes，CTL）負(fù)調(diào)節(jié)分子阻斷劑

機(jī)體不能對HBV產(chǎn)生正常的免疫反應(yīng)，可能與CHB患者的T細(xì)胞免疫功能缺陷有關(guān)系。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CHB患者HBV特異性的CD8+T細(xì)胞過度表達(dá)程序性死亡分子（Programmed death-1，PD-1）或程序性死亡配體-1（Programmed death ligand-1，PD-L1），造成T細(xì)胞功能低下。Peng et al和Boni et al均發(fā)現(xiàn)CHB患者尤其是高病毒血癥的患者中，功能失常的CD8+T細(xì)胞高表達(dá)PD-1分子，抗原遞呈細(xì)胞表面也同樣高表達(dá)其配體分子，通過特異性抗體抑制PD-l/PD-LI的結(jié)合后，CD8+T細(xì)胞的抗病毒效應(yīng)明顯增強(qiáng)[12]。Tzeng et al[13]利用抗PD-1抗體阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合，能上調(diào)HBV持續(xù)感染小鼠模型中肝內(nèi)HBcAg特異性T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，也能恢復(fù)CTL對病毒感染的清除作用，表明了抗PD-1/PD-L1抗體用于治療CHB的潛在的價值，但其安全性和療效仍有待臨床試驗(yàn)證明。已發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞負(fù)調(diào)控分子阻斷劑還包括抗CTL相關(guān)抗原-4（Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）和T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucin-domain 3，Tim-3）。目前有證據(jù)表明，阻斷CTAL-4能促進(jìn)HBV特異的CD8+T細(xì)胞增殖、增強(qiáng)CTL殺傷效應(yīng)、誘導(dǎo)Th1/Th2應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生[14，15]。Tim-3是近年來發(fā)現(xiàn)的另外一種T細(xì)胞負(fù)調(diào)控阻斷劑，可能與CHB的發(fā)生有關(guān)。在CHB患者體內(nèi)可觀察到高表達(dá)Tim-3的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的能力下降；Tim-3阻斷劑或抑制Tim-3的表達(dá)不僅能促進(jìn)HBV特異性CD8+T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16，17]，而且能夠增強(qiáng)PBMC和NK細(xì)胞的抗病毒作用[18]。目前CTL負(fù)調(diào)節(jié)分子阻斷劑在治療某些惡性腫瘤方面已獲臨床應(yīng)用，在治療HBV慢性感染研究方面，在土撥鼠模型中取得了較好的效果，但在人體還需要解決既能達(dá)到抗HBV的治療效果，又不使T細(xì)胞功能失衡而導(dǎo)致嚴(yán)重副作用的問題。

3　特異性C T L分子調(diào)節(jié)激動劑或佐劑

目前，不僅發(fā)現(xiàn)了特異性CTL調(diào)節(jié)阻斷劑有抗HBV的作用，也發(fā)現(xiàn)了特異性CTL分子激動劑也有抗HBV作用。特異性CTL分子調(diào)節(jié)激動劑是通過提供CD8+T淋巴細(xì)胞活化所需的第三信號而修復(fù)CHB患者體內(nèi)缺陷的T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷和分泌抗病毒相關(guān)細(xì)胞因子活性。童新燈等[19]發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者IL-7含量的降低可能使CHB患者細(xì)胞免疫功能下降。重組IL-7聯(lián)合使用替諾福韋酯或者恩替卡韋治療慢性乙型肝炎已獲準(zhǔn)進(jìn)行I/IIa期臨床試驗(yàn)[20]。此外，IL-21在HBV感染小鼠模型已顯示出具有抗HBV活性[21]。

4　治療性疫苗

乙型肝炎治療性疫苗的研制就是在預(yù)防性疫苗的基礎(chǔ)上，增加HBV結(jié)構(gòu)或者非結(jié)構(gòu)蛋白表位，或輔以不同分子佐劑，或改變疫苗形態(tài)以獲得新型疫苗。能夠打破慢性HBV感染患者體內(nèi)免疫耐受，誘導(dǎo)強(qiáng)有力的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答、中和免疫耐受、激活體液免疫應(yīng)答，以及刺激直接抵抗一種或者多種HBV抗原的CD4+T細(xì)胞，最終達(dá)到維持控制HBV感染的目標(biāo)?，F(xiàn)階段研究較多的是基于重組HBV蛋白或包膜亞病毒顆粒的治療性疫苗、聯(lián)合治療性疫苗和基于DNA和T細(xì)胞肽表位的治療性疫苗等。

GS-4774是一種重組的、經(jīng)加熱滅活的基于酵母的免疫治療性疫苗，特異性表達(dá)乙型肝炎病毒X、大S蛋白和核心抗原，它們能夠活化樹突狀細(xì)胞的吞噬作用，刺激CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量。GS-4774已經(jīng)開始Ⅰ期臨床研究，在正常的健康成年人中表現(xiàn)出很大的耐受性，同時達(dá)到令人滿意的重組免疫反應(yīng)，在慢性乙型肝炎患者中使用情況正在進(jìn)行中[22]。TG10501是使用非復(fù)制5型載體編碼的一段獨(dú)特的融合蛋白，包括核心蛋白、HBsAg結(jié)構(gòu)域和修飾后的聚合酶。在AAV耐受的小鼠模型中，單次注射TG1050顯示出可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的特異性T淋巴細(xì)胞，分泌IFN-γ和/或IFN-α，具有很強(qiáng)的體內(nèi)溶細(xì)胞作用，而且作用持久[23]，據(jù)新聞稿報道2014年底已經(jīng)開始應(yīng)用TG1050治療HBV基因D型慢性乙型肝炎患者。DV-601是另一種治療性疫苗，含有乙型肝炎表面抗原和核心抗原，作用機(jī)制是觸發(fā)免疫反應(yīng)和產(chǎn)生與乙型肝炎病毒特異性CTL細(xì)胞有關(guān)的抗體和細(xì)胞。DV-601已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床研究，證明是一種安全、耐受性好的治療性乙型肝炎疫苗[24]。由古巴哈瓦那遺傳與生物技術(shù)中心開發(fā)研制的NASVAC疫苗是一種將HBV表面抗原和核心抗原聯(lián)用的疫苗，已經(jīng)進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段，并發(fā)現(xiàn)它在治療慢性乙型肝炎方面的作用是通過活化的B細(xì)胞發(fā)揮免疫應(yīng)答[25]。DNA疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+T、CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，促進(jìn)IFN-γ分泌，也可以引起NK細(xì)胞反應(yīng)[26]。在一項(xiàng)研究中，用含有HBV基因的DNA病毒聯(lián)用IL-12治療12例服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者，發(fā)現(xiàn)50%患者病毒滴度降低，伴隨HBV特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞，CD4+T記憶性T細(xì)胞在治療結(jié)束40周后仍能檢測到[27]，但是不足的是該臨床試驗(yàn)未設(shè)對照組。我國于2005年批準(zhǔn)了第一個治療慢性乙型肝炎的DNA疫苗的I期臨床試驗(yàn)，該疫苗為雙質(zhì)粒DNA疫苗，2個質(zhì)粒分別是pcDNAS2-S（表達(dá)preS2-S抗原）和pcFP（表達(dá)IL-2和IFN-γ），II期臨床試驗(yàn)結(jié)果證明其安全，對提高HBeAg轉(zhuǎn)陰率有一定的效果[28]。美國首先開發(fā)出治療性的T細(xì)胞表位肽疫苗，肽疫苗由3部分共價連接：即HBV CTL表位HBc18～27、N端2棕櫚酸分子和破傷風(fēng)類毒素Th表位（TT830～843）。26名健康受試者和90例慢性乙型肝炎患者接受免疫，健康人群的免疫劑量為0.05 mg、0.55 mg，乙型肝炎患者接受0.05 mg、0.5 mg、5 mg或15 mg的劑量，每6周免疫1次，共4次。結(jié)果顯示，疫苗安全且耐受性好，在74%健康人中免疫刺激產(chǎn)生特異性T細(xì)胞和HBV特異性CTL，但在慢性乙型肝炎患者中免疫刺激產(chǎn)生特異性T細(xì)胞和HBV特異性CTL只有45%[29]。Michel et al[30]發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)對HBV感染免疫機(jī)制和HBV感染的免疫逃逸的研究，選擇合適的易受HBV感染的人群進(jìn)行免疫治療,才能體現(xiàn)治療性疫苗的功效。

5　TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞治療

由于慢性乙型肝炎患者免疫耐受，缺少清除病毒所需的特異性CTL，而CTL的特異性是由TCR基因決定的，TCR可使抗CD3活化的CD8+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樘禺愋訡TL。目前，國內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行HBV特異性CTL的TCR轉(zhuǎn)基因表達(dá)研究，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)可以使HBV特異性CTL獲得TCR轉(zhuǎn)基因表達(dá)，具有結(jié)合HLA-A2限制性表位的活性[31]。Bertoletti[32]的研究表明，普通T淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)基因表達(dá)HBV特異性CTL的TCR后，具備了特異性CTL的表型和功能特點(diǎn)，可針對抗原產(chǎn)生TNF-α、IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子，裂解HBV感染的肝細(xì)胞以及整合有HBV DNA的肝細(xì)胞癌細(xì)胞，該課題組還應(yīng)用TCR轉(zhuǎn)基因方法治療了1例HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌患者，在治療1個月后患者血清HBsAg水平從3200 IU/mL下降到300 IU/mL，且發(fā)現(xiàn)TCR轉(zhuǎn)基因獲得的特異性T細(xì)胞可以在體內(nèi)擴(kuò)增，從初始的6? 105細(xì)胞擴(kuò)增到占CD8+T細(xì)胞總數(shù)的1.2%[33]。

6　攜帶嵌合抗原受體的T細(xì)胞（Chimeric antigen receptor Tcell，CAR-Tcell）

CAR-T細(xì)胞是一種新的免疫調(diào)節(jié)方法，是在體外設(shè)計一種帶有識別HBV蛋白TCR的T細(xì)胞，將其輸注給CHB患者，誘導(dǎo)特異性的抗病毒免疫反應(yīng)。CAR-T技術(shù)已從腫瘤治療領(lǐng)域擴(kuò)展到治療持續(xù)性病毒感染[34]。當(dāng)CAR-T細(xì)胞經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染并開始在細(xì)胞表面表達(dá)抗原后，可使初級人類T細(xì)胞識別的HBsAg陽性肝細(xì)胞釋放IL-2和INF-γ等促炎癥細(xì)胞因子。更重要的是，這種CAR-T細(xì)胞能使HBV復(fù)制的肝細(xì)胞裂解，還能夠誘導(dǎo)特異性的抗病毒免疫反應(yīng)，從而消除HBV cccDNA細(xì)胞[35]。CAR-T細(xì)胞用于細(xì)胞治療可能通過其細(xì)胞毒作用和促炎作用，而不只是殺傷了表達(dá)靶向抗原的HBV感染細(xì)胞，還可能對臨近的正常細(xì)胞造成傷害。CAR-T細(xì)胞的大量激活，向血液中大量釋放促炎癥因子如IFN-γ和TNF-α，被稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴。細(xì)胞因子風(fēng)暴會威脅患者的生命，必須密切觀察患者的病情。與傳統(tǒng)藥物引起的副反應(yīng)相比，細(xì)胞因子風(fēng)暴引起的細(xì)胞毒效應(yīng)并不能單純地通過減少藥物的劑量來控制，因?yàn)檎谠鲋车腃AR-T細(xì)胞最終會減少細(xì)胞因子的釋放而使患者能承受[36]。CAR-T細(xì)胞治療的另一個重要問題是成本昂貴。因此，這種治療方法在進(jìn)入臨床前還有待進(jìn)一步的完善。

7　多糖類化合物

多糖類化合物屬于免疫調(diào)節(jié)類藥物，能增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫，不僅能抑制HBs Ag、HBeAg的分泌，抑制HBV DN A復(fù)制，還有一個顯著的特點(diǎn)就是具有天然低毒副作用。多糖除發(fā)揮抗病毒活性外，還可以減輕肝細(xì)胞的損傷，促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)，在乙型肝炎病毒感染治療中發(fā)揮保肝護(hù)肝作用[37]。有研究證明香菇多糖是可以增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能，恢復(fù)和提高機(jī)體免疫力，具有抗病毒、修復(fù)肝臟損傷等作用[38]。目前使用的主要幾種多糖藥物包括（1）植物多糖：黃芪多糖、人參多糖、大蒜多糖等；（2）動物多糖：蝸牛多糖、扇貝多糖、中國螺多糖等；（3）藻類多糖：螺旋藻多糖、海藻硫酸多糖等；（4）微生物多糖：香菇多糖、冬蟲夏草多糖脂質(zhì)體、靈芝多糖、豬苓多糖、非致病性草分枝桿菌培養(yǎng)物中提取的多糖等。

8　結(jié)語

現(xiàn)階段治療慢性乙型肝炎的目標(biāo)是延緩疾病的進(jìn)程以及延長病人的生存時間，防止HBV感染者進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝衰竭以及肝細(xì)胞癌等。對CHB的治療方法雖然能夠延緩疾病的發(fā)展，但要達(dá)到完全清除HBV仍非常困難，因此需要尋找更有效的治療方案。近來的研究表明，CHB患者應(yīng)用或者聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)治療能夠得到良好的效果，乙型肝炎的免疫治療具有良好的前景。當(dāng)然，這些方法的實(shí)用性和安全性還需要更多的臨床以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持，才能使其成為預(yù)防和控制乙型肝炎更有力的手段。

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（收稿：2015-10-20）

（本文編輯：李磊）

Immuno-therapy for chronic hepatitis B

Qiao Yan，Xu Dongping，Li Jin.Clinical Medical School，Guilin Medical College，Guilin 541004，Guangxi Zhuang Autonomous Region，China

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.03.000

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號81373136）

541004廣西壯族自治區(qū)桂林市桂林醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院（喬艷）；解放軍302醫(yī)院臨床研究管理中心（徐東平）；302醫(yī)院院務(wù)部（李進(jìn)）

喬艷，女，26歲，碩士研究生。主要從事乙型肝炎病毒變異研究。E-mail:qiaoyan302@163.com

李進(jìn)，E-mail：lijin302@hotmail.com