正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化胞磷膽堿鈉合成工藝

孫立娜 孫耀冉

(1. 天津德亦誠(chéng)醫(yī)藥咨詢(xún)有限公司, 天津 300000; 2. 石家莊學(xué)院 化工學(xué)院, 河北 石家莊 050035)

胞磷膽堿鈉是一種核苷衍生物，又名胞二磷膽堿鈉，化學(xué)名為膽堿胞嘧啶核苷二磷酸酯單鈉鹽。是一種腦代謝激活劑，臨床上主要用于急性顱腦外傷和腦手術(shù)后意識(shí)障礙，以及治療帕金森綜合征和神經(jīng)性耳聾，也可用于其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷引起的功能和意識(shí)障礙、缺血性腦血管病和血管性癡呆，對(duì)老年性癡呆癥、抑郁癥、延緩衰老和提高學(xué)習(xí)效果和記憶力等都有一定的療效[1,2]。

關(guān)于胞磷膽堿鈉制備方法的報(bào)導(dǎo)很多，但大致可歸納為三種途徑。一種是有機(jī)化學(xué)合成法[3]，該法存在產(chǎn)品難與縮合劑分離，不適合藥用，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低，副產(chǎn)物多，成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題；一種是微生物發(fā)酵法，該法存在產(chǎn)物濃度低，產(chǎn)率不穩(wěn)定等問(wèn)題；還有一種是酶促合成法，如利用啤酒酵母泥等微生物進(jìn)行生物合成[4,5]。采用游離的啤酒酵母泥細(xì)胞酶促合成，工藝簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高，成本低。通過(guò)酶促合成法合成胞磷膽堿鈉的生產(chǎn)工藝過(guò)程可以分為酶促合成工藝和提取純化工藝兩大部分。本文通過(guò)正交設(shè)計(jì)法對(duì)酶促合成工藝中反應(yīng)液組成的最佳條件進(jìn)行了研究，即對(duì)反應(yīng)液中胞苷酸、磷酸膽堿、葡萄糖、速凍啤酒酵母泥、硫酸鎂的加入量進(jìn)行優(yōu)化，找到了反應(yīng)底物的最佳配比。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胞苷酸、磷酸膽堿、葡萄糖和硫酸鎂均為市售分析純，酵母為啤酒生產(chǎn)中廢棄的啤酒酵母泥，實(shí)驗(yàn)中使用的水均為自制的純化水。

753BI型分光光度計(jì)；ZWF-6型三用紫外分析儀；DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；TGL-16G型高速離心機(jī)。

1.2 合成實(shí)驗(yàn)方法

啤酒酵母泥酶促合成胞磷膽堿鈉的原理為胞二磷膽堿由微生物菌體所提供的酶系催化胞苷酸和磷酸膽堿而合成[6]，國(guó)內(nèi)使用啤酒生產(chǎn)中廢棄的啤酒酵母泥，其中方程式為：

1.2.1 反應(yīng)操作

根據(jù)正交試驗(yàn)方案設(shè)定組成方案，取適量胞苷酸、磷酸膽堿及葡萄糖分別置于錐形瓶中，加入純化水，攪拌溶解后，加入速凍啤酒酵母泥，攪拌均勻，升溫至29 ℃，加入定量的硫酸鎂，攪拌均勻，開(kāi)始計(jì)時(shí)。

維持反應(yīng)溫度30±1℃左右，反應(yīng)2小時(shí)后取樣，測(cè)轉(zhuǎn)化率，補(bǔ)加葡萄糖，以補(bǔ)充代謝過(guò)程中所消耗的能量物質(zhì)，加葡萄糖后攪拌均勻。以后每反應(yīng)1.5小時(shí)補(bǔ)加一次葡萄糖，反應(yīng)8小時(shí)后取樣，測(cè)轉(zhuǎn)化率。

1.2.2 后處理

反應(yīng)結(jié)束后，加熱升溫至70±2 ℃保溫10 min，迅速冷卻至室溫。將反應(yīng)液進(jìn)行板框壓濾，得壓濾液，濾渣干燥后可用做飼料。

1.3 含量測(cè)定方法

以胞苷酸投入量的轉(zhuǎn)化率計(jì)算胞磷膽堿鈉酶促反應(yīng)合成的收率，30±1 ℃溫度條件下反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為約8小時(shí)，用瓊脂糖電泳法和紫外分光光度法試驗(yàn)3次平均測(cè)定轉(zhuǎn)化率[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案

按照1.2中的實(shí)驗(yàn)方法在啤酒酵母泥酶催化下，以胞苷酸為起始底物進(jìn)行胞磷膽堿鈉的合成，該方法中所使用的主要原料有葡萄糖、磷酸膽堿、胞苷酸和硫酸鎂，采用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)四種主要原料的用量進(jìn)行考察。根據(jù)大量單因素反應(yīng)的結(jié)果，設(shè)定胞苷酸、葡萄糖、磷酸膽堿和硫酸鎂四種反應(yīng)底物的用量為四因素，每個(gè)因素三水平，如表1所示。

表1 因素水平表

注：底物濃度以100 mL反應(yīng)液為準(zhǔn)

2.2 試驗(yàn)結(jié)果

設(shè)定反應(yīng)液總量為100 mL，按照表1中各組分的量加入底物，按照1.2中的實(shí)驗(yàn)方法在啤酒酵母泥酶催化下，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以胞苷酸的轉(zhuǎn)化率作為考察指標(biāo)，正交設(shè)計(jì)的具體方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

從表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，A因素即胞苷酸用量的各水平極差最大，為41.1，其為最主要影響因素，A2為A因素優(yōu)先水平。胞苷酸作為主要原料之一，當(dāng)濃度適當(dāng)增加時(shí)，增大了反應(yīng)物的濃度擴(kuò)散動(dòng)力，有助于增大轉(zhuǎn)化率。但是當(dāng)增加過(guò)多后，過(guò)量的胞苷酸會(huì)激活胞苷酸水解酶，胞苷酸被水解為胞苷，胞磷膽堿鈉產(chǎn)率下降，同時(shí)，大量副產(chǎn)物胞苷會(huì)給反應(yīng)后的分離提純帶來(lái)困難[8]。從表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出，B因素極差為14.9，影響次之，B2為B因素優(yōu)先因素，C因素、D因素影響相近，以C3、D1最佳。

根據(jù)葡萄糖、磷酸膽堿、胞苷酸、硫酸鎂四因素篩選試驗(yàn)結(jié)果和表3中方差分析的結(jié)果可以看出，A(胞苷酸的用量)為顯著影響因素，而B(niǎo)、C、D的實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。因此在合成工藝中應(yīng)該嚴(yán)格控制胞苷酸的用量。在A2B2C3D1組合下反應(yīng)，胞磷膽堿鈉產(chǎn)率較高。根據(jù)以上結(jié)論，以100 mL反應(yīng)液為準(zhǔn)，確定底物濃度的最佳組成方案為：葡萄糖30 g，磷酸膽堿7.0 mL，胞苷酸1.0 g，硫酸鎂0.5 g。

3 結(jié)論

在啤酒酵母泥酶催化下，以胞苷酸為起始底物合成胞磷膽堿鈉，該路線(xiàn)中所使用的主要原料有葡萄糖、磷酸膽堿、胞苷酸和硫酸鎂，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以胞苷酸的轉(zhuǎn)化率作為考察指標(biāo)，對(duì)工藝中四種主要原料的用量進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，得出以100 mL反應(yīng)液為準(zhǔn)的底物濃度的最佳組合方案為：葡萄糖30 g，磷酸膽堿7.0 mL，胞苷酸1.0 g，硫酸鎂0.5 g。

此外啤酒酵母泥酶催化反應(yīng)的初始pH、反應(yīng)溫度和時(shí)間有待進(jìn)一步考察，以最終得到啤酒酵母泥酶催化下，以胞苷酸為起始底物合成胞磷膽堿鈉的總工藝。