帕立骨化醇預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的作用

郝立校，蔡珍福，周玉坤，王堅，陳莉(中國人民解放軍第四五五醫(yī)院肝膽外科，上海200052)

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帕立骨化醇預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的作用

郝立校，蔡珍福，周玉坤，王堅，陳莉
(中國人民解放軍第四五五醫(yī)院肝膽外科，上海200052)

[摘 要]目的 探討帕立骨化醇預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及合理劑量。方法 300只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為:假手術(shù)組、模型組、實(shí)驗1組、實(shí)驗2組、實(shí)驗3組，每組60只，各實(shí)驗組分別于肝缺血再灌注手術(shù)前24 h腹腔注射0.15、0.30、0.60 μg/kg帕立骨化醇。每組取20只大鼠于術(shù)后3、6、12和24 h取尾靜脈血，并觀察各組此20只大鼠術(shù)后24、48、72 h的生存率。各組另40只大鼠分別于術(shù)后3、6、12、24 h每個時間點(diǎn)處死10只大鼠，取肝組織。比較各組大鼠存活率和術(shù)后谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及肝臟組織丙二醛(MDA)含量。結(jié)果 模型組大鼠存活率低于假手術(shù)組(P＜0.05)，實(shí)驗各組大鼠存活率高于模型組；除實(shí)驗1組與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各實(shí)驗組在術(shù)后3、6、12、24 h與模型組相比ALT均有下降(P＜0.05)；而術(shù)后3 h起實(shí)驗1、2、3組AST水平均低于模型組(P＜0.05)。術(shù)后3、6、12、24 h，各實(shí)驗組肝組織MDA均低于模型組，實(shí)驗2組和3組與實(shí)驗1組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，實(shí)驗2組與實(shí)驗3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 帕立骨化醇預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，0.15 μg/kg即可以明顯改善模型肝功和肝臟MDA水平，但0.30 μg/kg以上水平效果更佳。

[關(guān)鍵詞]帕立骨化醇；肝臟缺血再灌注損傷；谷丙轉(zhuǎn)氨酶；谷草轉(zhuǎn)氨酶；丙二醛

Pretreatment effect of Paricalcitol on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats HAO Li-xiao, CAI Zhen-fu, ZHOU Yu-kun, WANG Jian, CHEN Li.Department of Hepatobiliary Surgery, the 455thHospital of People’s Liberation Army, Shanghai 200052, China

Abstract ObjectiveTo explore the pretreatment effect of paricalcitol on hepatic ischemia reperfusion damage and explore reasonable dosage.MethodsThree hundred healthy male SD rats were randomly divided into sham group (n=60), model group (n=60), test 1 group (n=60), test 2 group (n=60) and test 3 group (n=60).Rats of test group were intraperitoneal injection with 0.15 μg/kg, 0.30 μg/kg, 0.60 μg/kg of Paricalcitol respectively 24 h before reperfusion.Twenty rats’ venous blood samples were taken at 3, 6, 12, 24 h after operation in each group, and the survival rates were observed at 24 h, 48 h, 72 h after operation.Ten of the other forty rats were sacri■ced for liver tissue at 3, 6, 12, 24 h after operation in each group.All groups of rats were compared with the survival rates, levels of ALT, AST and MDA in liver tissue.ResultsThe survival rate in model group was lower than that in sham group (P＜0.05), survival rate of all test groups 1, 2 and 3 was signi■cantly lower than that in model group (P＜0.05).Except test group 1, ALT levels of test 2 and 3were lower than that in model group 3 h postoperative (P＜0.05).Levels of AST in test group were lower than the model group 3 h postoperatively (P＜0.05).Levels of MDA in liver tissue in test groups 1, 2 and 3 were lower than model group 3～24 h postoperatively.Levels of MDA in liver tissue test group 2 and 3 showed statistically difference (P＜0.05) with that in test group 1, but levels of MDA in liver tissue showed no signi■cant difference between test group 2 and 3 (P＞0.05).ConclusionParicalcitol pretreatment possesses protective effects on hepatic ischemia-reperfusion injury.Dosage of 0.15 μg/kg can obviously improve the model and hepatic MDA level, and more than 0.30 μg/kg level affects better.

Key words Paricalcitol； hepatic ischemia-reperfusion injury； ALT； AST； MDA

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemiareperfusion，HIRI)的發(fā)生與缺血再灌注過程中氧自由基釋放、肝臟能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、微循環(huán)功能障礙、細(xì)胞因子、線粒體功能異常、Kupffer細(xì)胞激活及中性粒細(xì)胞的活化等因素有關(guān)[1-3]。但迄今為止，臨床常采用藥物防治、低溫、藥物預(yù)處理或進(jìn)行基因治療等策略尚未妥善解決臨床肝臟缺血再灌注所致的肝功能不全。有研究表明在腎缺血再灌注的治療中帕立骨化醇具有抗氧化、提高HSP70的表達(dá)、并影響腎細(xì)胞凋亡的作用，從而明顯減少腎IRI的發(fā)生[4]。但帕立骨化醇是否對肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用尚無研究。本實(shí)驗研究不同劑量帕立骨化醇預(yù)處理對大鼠HIRI的影響，并初步探討其作用的相關(guān)機(jī)制。

1　材料和方法

1.1分組和造模

分組:健康雄性SD大鼠300只，體重220～250 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為:假手術(shù)組、模型組組、實(shí)驗1組、實(shí)驗2組、實(shí)驗3組，每組60只。

給藥:各實(shí)驗組于手術(shù)前24 h分別腹腔注射0.15、0.30、0.60 μg/kg相同濃度帕立骨化醇注射液(意大利HOSPIRA.S.P.A.，規(guī)格1 mL:5 μg)，模型組和假手術(shù)組未用藥。

造模:模型組和實(shí)驗組采用Yoshizumi等[5]的方法造模，游離Glisson氏系統(tǒng)進(jìn)入肝左葉和中葉的分支，用無創(chuàng)血管夾鉗夾進(jìn)入肝左、中葉的分支，造成肝左、中葉約70%肝臟熱缺血，保持肝右葉及尾狀葉血流通暢，關(guān)腹縫合切口，夾閉60 min后再次入腹，然后松開夾閉使血液復(fù)流進(jìn)行再灌注的方法制備大鼠肝缺血再灌注模型。假手術(shù)組僅暴露肝門，不夾閉動、靜脈。

1.2樣本收集和指標(biāo)檢測

1.2.1 血清樣本:每組取20只大鼠于術(shù)后3、6、12 和24 h取尾靜脈血約1 mL，離心機(jī)離心后取血清送全自動生化分析儀檢測ALT、AST含量。并觀察各組此20只大鼠術(shù)后24、48和72 h生存率，并記錄感染、出血、死亡等可能的并發(fā)癥情況，死亡鼠行解剖查找原因。1.2.2 肝臟組織樣本:各組另40只大鼠分別于術(shù)后3、6、12和24 h各組處死大鼠10只(模型組于12 h死亡1只大鼠、24 h死亡2只大鼠；實(shí)驗1組于12 h死亡1只大鼠、24 h死亡1只大鼠；實(shí)驗2組和3組無大鼠死亡)，每只大鼠取2份肝組織，一份肝組織在10%甲醛溶液中固定72 h后常規(guī)石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色。另一份肝組織冷凍于-20 ℃低溫冰箱，采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituricacid，TBA)法測定丙二醛MDA。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

研究數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗，計量資料(±s)表示，采用方差分析(SNK檢驗)對同一時間點(diǎn)各組的同一指標(biāo)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠生存情況、ALT、AST比較

各組大鼠存活率比較見表1。實(shí)驗各組大鼠存活率明顯高于模型組，實(shí)驗1組在48 h后存活率與模型組組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，實(shí)驗2組和實(shí)驗3在24 h后存活率與模型組組差異即有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，但實(shí)驗1、2、3組間差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。死亡大鼠解剖后共同特征是:胃內(nèi)容物多、腸道明顯積液，腹腔積血。

表1　各組大鼠存活率比較

術(shù)后6 h模型組ALT水平升至最高，與假手術(shù)組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后3 h起實(shí)驗各組ALT水平與模型組相比即具有下降趨勢，但術(shù)后3 h時僅實(shí)驗2、3組與模型組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，實(shí)驗1組差異無統(tǒng)計意義(P＞0.05)，術(shù)后24 h時實(shí)驗1、2、3組與模型組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

術(shù)后6 h模型組AST水平升至最高，與假手術(shù)組比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后3 h起帕立骨化醇低、中、高劑量組AST水平與模型組相比具有下降趨勢，(P＜0.05)，且至術(shù)后24 h時，此趨勢仍然存在(P＜0.05)，雖然高劑量組AST水平低于中、低劑量組，但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

2.2大鼠肝臟組織HE染色、MDA含量情況比較

假手術(shù)組(圖1A):均正常。模型組(圖1B):見肝細(xì)胞膜破裂明顯，大量胞質(zhì)空泡形成，淤血及大量炎性細(xì)胞浸潤，組織損傷隨缺血再灌注時間的延長愈加明顯。實(shí)驗1、2、3組(圖1C～E):損傷較模型組輕，有少量炎細(xì)胞浸潤，尤其是實(shí)驗3組與模型組相比，肝損傷明顯減輕。

術(shù)后3 h模型組大鼠肝臟MDA水平升至最高，此時實(shí)驗各組大鼠肝臟MDA均低于模型組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且實(shí)驗3組降低水平最明顯，此差異至術(shù)后24 h時仍然存在，且術(shù)后24 h時高、中劑量與低劑量間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但高、中劑量間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表2　各組動物不同時間ALT、AST比較(U/L)

圖1　術(shù)后各組6 h大鼠肝臟病理組織圖片(HE，×200)

表3　各組大鼠不同時間肝臟MDA含量比較(nmol/mg)

3　討論

肝臟缺血再灌注是肝臟外科的常見病理生理過程，其在休克復(fù)蘇、肝臟移植、肝葉切除等手術(shù)過程中不可避免，影響預(yù)后。因此預(yù)防或減輕損傷是目前的研究熱點(diǎn)。ALT及AST是評判肝臟缺血再灌注損傷的良好指標(biāo)，分別與肝細(xì)胞膜損傷、線粒體受損有關(guān)。有研究[6]用大鼠行肝臟缺血再灌注損傷實(shí)驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)再灌注80 min血清中ALT、AST水平即急劇上升，可達(dá)正常時的10倍以上。自由基可引起劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞受損、死亡。作為脂質(zhì)過氧化的重要參數(shù)，MDA常用來評價肝臟缺血再灌注過程氧自由基符合程度，并指示和預(yù)測隨后的器官損傷程度。

維生素D3的臨床價值是近年來多項研究的熱點(diǎn)，Seif等[7]認(rèn)為，維生素D3能夠明顯改善缺血再灌注肝臟ALT和AST水平。帕立骨化醇與維生素D3有相似的生物學(xué)效應(yīng)，且副作用比維生素D3小，特別是對鈣代謝影響較低。為研究對帕立骨化醇對肝臟缺血再灌注損傷作用并探討其合理劑量，我們設(shè)計了此次實(shí)驗。

在大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型建立時考慮到鉗夾大鼠門靜脈和肝動脈可造成全肝缺血，會引起腸道大面積淤血，易導(dǎo)致大鼠死亡。本實(shí)驗采用的是70%肝臟缺血模型，即鉗夾進(jìn)入肝臟左、中葉的管道造成缺血再灌注損傷。與假手術(shù)組比較，HIRI后模型組ALT、AST及MDA水平明顯升高，肝組織病理損傷明顯，與以往的研究吻合[8-9]。從大鼠存活率看，HIRI可引肝臟缺血同時也易引起腸道淤血，導(dǎo)致部分大鼠死亡，而帕立骨化醇，特別是中高劑量可提高HIRI大鼠存活率。而與模型組相比，帕立骨化醇能顯著減少肝損傷大鼠ALT、AST和MDA水平。HE染色可見，與模型組相比，帕立骨化醇處理各組大鼠肝臟病理主要表現(xiàn)為匯管區(qū)炎癥細(xì)胞聚集、肝細(xì)胞變性、壞死，而肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整；缺血再灌注組則表現(xiàn)為廣泛的肝細(xì)胞變性、壞死，可見部分肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，整體表現(xiàn)為較重的病理損害，這說明帕立骨化醇能起到對HIRI大鼠肝功能和組織形態(tài)學(xué)的保護(hù)作用，抑制缺血再灌注后氧自由基的對肝臟的損傷。在劑量上，無論從大鼠存活率、肝功能水平，還是HE染色、MDA水平看，術(shù)前24 h注射的三個劑量(0.15、0.30、0.60 μg/kg)，中、高劑量組對HIRI大鼠保護(hù)作用更佳。從作用起效時間來看，各用藥組術(shù)后AST、ALT及MDA水平在術(shù)后3 h即可見到明顯恢復(fù)，不同劑量間的作用存在差異，出現(xiàn)在術(shù)后6 h和術(shù)后12 h，術(shù)后24 h劑量間差異基本消失。說明中、高劑量能夠在更短時間內(nèi)達(dá)到保護(hù)效果，但如果是較低劑量的話，足夠長的時間也能獲得類似效果。這可能與藥物的半衰期及藥物在機(jī)體內(nèi)的蓄積有關(guān)，但考慮到臨床治療的時效性，我們并不建議以較低劑量進(jìn)行長時間治療，而推薦以中、高劑量進(jìn)行短時間沖擊治療，以獲得更為滿意的治療效果。

本研究通過不同劑量帕立骨化醇對肝臟缺血再灌注損傷進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)其在肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)上具有較高價值。我們希望，更多同行能夠參與這一研究，以進(jìn)一步明確其作用及機(jī)制，從而為臨床治療和預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷提供更為有效的方法和途徑。

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(本文編輯:張海燕，魯翠濤)

·論著 基礎(chǔ)研究·

作者簡介][第一郝立校(1978-)，男，河北臨城人，主治醫(yī)師，碩士。

[基金項目]解放軍第455醫(yī)院院內(nèi)課題(2014YG003)。

[收稿日期]2015-05-26

[中圖分類號]R575； R453.9

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.01.012