miR-21調(diào)節(jié)缺血缺氧誘導的大鼠肝卵圓細胞自噬的研究

高勝強，陳冬冬，黃立棟，戴瑞杰，胡偉建，余華軍，張啟瑜，單云峰(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科，浙江溫州325000)

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miR-21調(diào)節(jié)缺血缺氧誘導的大鼠肝卵圓細胞自噬的研究

高勝強，陳冬冬，黃立棟，戴瑞杰，胡偉建，余華軍，張啟瑜，單云峰
(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科，浙江溫州325000)

[摘 要]目的 探討miR-21在缺血缺氧誘導的大鼠肝卵圓細胞自噬中的作用。方法 體外培養(yǎng)肝卵圓細胞，慢病毒轉(zhuǎn)染肝卵圓細胞構(gòu)建穩(wěn)定的細胞株，分別提取各組細胞RNA逆轉(zhuǎn)錄后行SYBR Green實時熒光定量PCR，檢測各組miR-21的表達，以轉(zhuǎn)染好的穩(wěn)定的細胞建立缺血缺氧模型，共分為3組:miR-21空載體慢病毒轉(zhuǎn)染HOC自噬組，miR-21增強慢病毒載體轉(zhuǎn)染HOC自噬組，miR-21-inhibition慢病毒載體轉(zhuǎn)染HOC自噬組。Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡；應用丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色熒光定位法、觀察各組細胞的自噬；免疫印跡法(Western blotting)檢測各組細胞LC3-II/I蛋白表達情況。結(jié)果與空載體組比，增強組miR-21基因水平表達增強，而MDC染色減弱(自噬減少)，蛋白LC3-II/LC3-I的比值減少；而抑制組miR-21基因水平表達減少，MDC染色增強(自噬增強)，蛋白LC3-II/LC3-I的比值增多。結(jié)論 抑制miR-21過表達可以增強缺血缺氧引起的肝卵圓細胞的自噬，有利于肝卵圓細胞在缺血缺氧微環(huán)境中穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境，維持細胞的存活。

[關鍵詞]microRNA-21；自噬；肝卵圓細胞

Research of miR-21 on ischemia and hypoxia-induced autophagy modulation in rat hepatic oval cell GAO Sheng-qiang, CHEN Dong-dong, HUANG Li-dong, DAI Rui-jie, HU Wei-jian, YU Hua-jun, ZHANG Qi-yu, SHAN Yun-feng.Department of Hepatobiliary Surgery, the First Af■liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325000, China

Abstract ObjectiveTo investigate the role of miR-21 in ischemia-thypoxiainduced autophagic model of rat hepatic oval cells.MethodsHepatic oval cells were cultured in vitro and a stable hepatic oval cells line was constructed by lentivirus (miR-21 enhanced lentivirus； miR-21 inhibited lentivirus； vector lentivirus).The RNA was extracted from each group and reverstranscripted, then SYBR real-time PCR was conducted to detect the miR-21 expression.Simulated ischemia and hypoxia of transfected HOCs (hepatic oval cells) as an in vitro model of ischemic-hypoxic microenvironment were employed in this study.Hoechst 33258 staining was used to determine cell apoptosis.MDC (Monodansylcadaverine)-labeled autophagic vacuoles were observed under ■uorescent inverted phase contrast microscopy in HOC.The expression of LC3 and the result of LC3-I converted to LC3-II was detected with Western blotting.ResultsCompared with the empty vector group, the expression of miR-21 was increased in enhanced group and decreased in inhibited group； Compared with the empty vector group, enhanced group MDC staining was decreased, and protein LC3-II/LC3-I was reduced.Compared with the empty vector, inhibited group MDC staining was enhanced, and the ratio of protein LC3-II/LC3-I was increased.Conclusion Inhibition of miR-21 expression can enhance autophagy in ischemia-hypoxiainduced model.Autophagy of HOC can be induced by the ischemic and hypoxic microenvironment and maintain survival and the stability of cells.

Key words microRNA-21； autophagy； hepatic oval cell

肝卵圓細胞被認為是原始的兼性多能干細胞，目前普遍認為卵圓細胞位于小葉間膽管或Hering管，即終末膽管，也是門靜脈周圍肝細胞和膽管細胞的過渡區(qū)域。自噬(autophagy)是將細胞內(nèi)受損、變性或者衰老的蛋白質(zhì)以及受損細胞運輸?shù)饺苊阁w進行消化降解的過程，是細胞應對營養(yǎng)缺乏、細胞密度負荷、低氧、氧化應激、感染等惡劣環(huán)境的生存方式之一。microRNAs(miRNAs)是一類新發(fā)現(xiàn)的在進化上高度保守的非編碼小RNAs，長約19-22nt，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，廣泛參與發(fā)育、器官形成、凋亡、增殖，甚至是腫瘤發(fā)生等重要生命過程。miR-21目前研究最多的miRNAs之一，它定位于人類第17q染色體區(qū)域，通過誘導S期細胞周期調(diào)節(jié)，在肝再生的增殖期上調(diào)，顯著促進細胞增殖。miRNAs通過調(diào)控自噬相關基因的表達，從而發(fā)揮對自噬的調(diào)節(jié)作用，miRNAs在調(diào)控自噬的發(fā)生過程中，大多為抑制自噬發(fā)生，也有少部分miRNAs能激活自噬。LC3是檢測自噬現(xiàn)象的特異性標記分子，LC3-II/LC3-I反映自噬程度。

1　材料和方法

1.1材料

大鼠肝卵圓細胞(HOC)購自中科院上海細胞庫；丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)、微管相關蛋白1輕鏈3β(LC3B)蛋白多克隆抗體、兔抗鼠GAPDH單克隆抗體購自美國Sigma公司；DMSO(北京索萊寶公司)；CCK-8(日本同仁化學公司)；胎牛血清、1640培養(yǎng)液、PBS(GIBCO公司)；Hoechst33258染色液、BCA法蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；密封培養(yǎng)罐、AnaeroPack(安寧包)產(chǎn)氣袋和氧氣指示劑(日本三菱瓦斯化學株式會社)；RNA提取試劑Trizol購自美國invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-購自日本Toyobo公司；GAPDH購自中國杭州賢至生物科技有限公司；miR-21增強慢病毒載體、miR-21-inhibition慢病毒載體、miR-21慢病毒空載體由上海吉凱基因化學技術有限公司構(gòu)建；Marker、ECL發(fā)光液購自美國Thermo公司；7500型實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；ChemiDoc XRS儀器購自BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):大鼠肝卵圓細胞接種于含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長至對數(shù)生長期后，細胞計數(shù)后置入缺血缺氧微環(huán)境中進行試驗。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染:以4×104個/mL HOC接種到96孔板中，等到細胞融合度達到30%進行慢病毒載體轉(zhuǎn)染，選用復感染指數(shù)(MOI值)為100，每個孔100 μL:慢病毒載體10 μL，慢病毒感染增強液80 μL，Polybrene液(50 μg/mL)10 μL。混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后觀察細胞狀態(tài)，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染HOC后穩(wěn)定細胞株的篩選:將待篩選細胞接種于48孔板中至70%～80%融合度，待細胞貼壁后，加入嘌呤霉素(0，1，2.5，5，10 μg/mL)進行篩選。得出藥物處理48 h后細胞全部死亡的最低藥物濃度是5 μg/mL，將細胞種植在24孔板中，貼壁后進行慢病毒感染，感染第2天，加入嘌呤霉素藥物篩選，篩選后的細胞即時觀察熒光以確定獲得感染效率100%的細胞。

1.2.4 缺血缺氧模型:將慢病毒轉(zhuǎn)染好的肝卵圓細胞接種于培養(yǎng)皿，當細胞密度達到80%～90%時，換成無血清1640培養(yǎng)基，放入密封培養(yǎng)罐后迅速放入安寧包產(chǎn)氣袋一袋和氧氣指示劑一枚，密封，45 min后開始計時。

1.2.5 RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄:取三組長滿細胞的六厘米培養(yǎng)皿，同時每組加入1 mL Trizol，在冰上中靜置5 min后，用槍頭吹打細胞后移至離心管中，靜置5 min，按照invetrogen公司Trizol試劑說明書提取RNA。以所提總RNA為模版，分別進行RT反應，反應體系如下:總RNA 1 μL加入Enzyme Mix 0.5 μL、Buffer 2 μL、逆轉(zhuǎn)錄U6引物1 μL、miR-21莖環(huán)引物1 μL，補充Nuclease-free Water至10 μL。反應條件:37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測miR-21表達:根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)獲得成熟miRNA序列，并用Primer5軟件設計相應的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增引物，由上海生工生物股份有限公司合成。miR-21逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物5＇-GTCGTATCCAGTGCA GGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3＇，實時熒光定量PCR前向引物為5＇-GCGGCGGTAGCTTATCAGAC TG-3＇，反向引物為莖環(huán)引物上的一段片段，為5＇-ATC CAGTGCAGGGTCCGAGG-3＇。內(nèi)參U6逆轉(zhuǎn)錄引物為:5＇-CG CTTCACGAATTTGCGTGTCA-3＇，實時熒光定量U6引物為Fp-5＇-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3＇，Rp-5＇-CG CTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3＇。所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍后行熒光定量PCR，反應體系為:模版1 μL，SYBRqPCR Mix液5 μL，miR-21引物和負鏈引物各1 μL(濃度均為1 μmol/L)，Plus solution 1 μL，補充水至10 μL，以U6為內(nèi)參。反應條件為:95 ℃ 1 min預變性，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s和72 ℃ 45 s，40個循環(huán)，采用2-△△CT法計算不同組織中miR-21的相對表達量。

1.2.7 MDC熒光染色:取細胞爬片，移去培養(yǎng)液，PBS洗2次，重新加入含有50 μmol/LMDC的培養(yǎng)基在37 ℃孵育1 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗三遍，抗熒光淬滅劑于載玻片上封片，置于DM4000 B LED熒光正置顯微鏡上，用380 nm波長的激發(fā)光525 nm波長的發(fā)射光濾光片進行觀察。

1.2.8 Hoechst 33258染色:取細胞爬片，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗兩次，Hoechst 33258染色5 min，PBS洗兩次，滴加抗熒光淬滅劑于載玻片上封片，熒光顯微鏡觀察，并隨機選取視野拍照。1.2.9 Western blotting:分別提取各組細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，選擇10% SDS-PAGE凝膠，30 μg上樣量進行電泳，80 V恒壓至樣品進入分離膠后改120 V恒壓至電泳結(jié)束，350 mA恒流60 min轉(zhuǎn)膜后，用含5%脫脂奶粉TBST常溫封閉90 min，4 ℃搖床孵育一抗過夜(抗體稀釋濃度為LC3B為1:1 000，GAPDH 為1:500)。TBST洗膜三次后，以1:5 000濃度加入二抗至牛奶，室溫孵育1 h后，TBST洗三次，加入ECL，ChemiDoc XRS儀器曝光，并采用Image Lab對其進行分析。

1.3統(tǒng)計學分析

圖1　細胞轉(zhuǎn)染圖片(×100)

2　結(jié)果

2.1慢病毒轉(zhuǎn)染情況

由圖1可見慢病毒轉(zhuǎn)染效率達95%以上。

圖2　Hoechst 33258染色圖片(×100)

圖3　MDC染色圖片(×100)

2.2Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡情況

相對于空載體對照細胞，miR-21增強慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞染色增多(凋亡增多)，miR-21-inhibition慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞染色減少(凋亡減少)，見圖2。

2.3MDC染色檢測細胞自噬

相對于空載體對照細胞，miR-21增強慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞染色減少(自噬減少)，miR-21-inhibition慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞染色增多(自噬增多)，見圖3。

2.4實時熒光定量PCR檢測miR-21

采用2-△△CT法計算出不同標本中miR-21的相對表達量，如圖4所示。

2.5Western blotting檢測LC3-II和LC3-I蛋白

Western blotting觀察到，相對于空載體對照細胞，miR-21增強慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞LC3-II與LC3-I的比值降低，miR-21-inhibition慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞LC3-II與LC3-I的比值增加(圖5)。

圖4　miR-21基因表達情況圖片

圖5　Western blotting檢測LC3蛋白圖片

3　討論

當肝臟受到嚴重損傷，肝細胞大量缺失或者肝細胞增殖受到毒素或者致癌因子的抑制時，就會激活肝卵圓細胞。肝卵圓細胞同時具有膽管細胞與肝細胞的表型，且可進一步分化為肝細胞及膽管上皮細胞，因而認為其是一種原始的兼性多功能干細胞[1]。目前普遍認為卵圓細胞位于小葉間膽管或Hering管，即終末膽管，也是門靜脈周圍肝細胞和膽管細胞的過渡區(qū)域。

自噬(autophagy)是一種進化保守的溶酶體依賴的自身降解途徑，是細胞在遇到應激反應等刺激時，將細胞質(zhì)內(nèi)多余的蛋白質(zhì)或損傷的細胞器等物質(zhì)包繞至自噬體中并與溶酶體結(jié)合將其降解的過程。自噬幾乎存在于所有真核細胞，不僅參與維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及生長、分化的重要過程，而且是細胞面臨饑餓、生長因子匱乏等應激環(huán)境的應對策略[2]。根據(jù)其生理功能和自噬體與溶酶體的結(jié)合方式，將自噬分為3種類型:巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperonmediated autophage)，其中以巨自噬的研究最為成熟[3-4]。段文彪等[5]研究得出缺血缺氧可以抑制肝卵圓細胞增殖，并且可誘導肝卵圓細胞自噬。自噬有利于肝卵圓細胞在缺血缺氧微環(huán)境中穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境，維持細胞的存活。微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)蛋白有兩種形式:LC3-I和LC3-II，細胞自噬體形成過程中，LC3-I可以轉(zhuǎn)化為LC3-II。LC3-II含量的多少與自噬體的含量有關，自噬體膜的含量由LC3-II標記[6]，在自噬形成中，LC3-I與LC3-II/LC3-I比例與自噬體數(shù)量有關[7]。LC3-II/LC3-I的比值與自噬呈正相關。

microRNAs(miRNAs)是一類新發(fā)現(xiàn)的在進化上高度保守的非編碼小RNAs，長約19～22 nt在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達[8]。miR-21參與發(fā)育、再生及其干細胞生物學中有發(fā)揮重要作用，Marquez等[9]切除小鼠的部分肝臟，發(fā)現(xiàn)和肝切除術前相比，切除術后小鼠肝臟miR-21的表達在12、24 h達到高峰(超過正常2倍)，提示miR-21在肝再生早期可能參與基因表達調(diào)控。陳楨坤等[10]證實了miR-21在肝卵圓細胞活化與增殖中起重要作用，Smad7作為miR-21的靶基因可能參與這一過程。

miRNA也被發(fā)現(xiàn)在自噬調(diào)節(jié)中扮演了關鍵的角色，在自噬的啟動(induction)、囊泡成核(vesicle nucleation)、囊泡延伸(vesicle elongation)、自噬回收(retrieval)與囊泡融合(fusion)等幾個階段中均有miRNA參與調(diào)控[11]。研究表明miRNAs能調(diào)節(jié)一些Atgs基因，而且調(diào)控子存在于自噬過程的不同階段[12]。Zhu等[13]首次揭示了miRNA與細胞自噬之間的聯(lián)系:miR-30a負調(diào)節(jié)自噬關鍵蛋白Beclin 1表達，引起自噬水平下降。miRNAs在調(diào)控自噬的發(fā)生過程中，大多為抑制自噬發(fā)生，也有少部分miRNAs能激活自噬。抑制自噬發(fā)生的相關miRNAs如miR-375在人類肝癌細胞中表達下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-375后能下調(diào)自噬相關基因Atg7信使RNA及蛋白表達水平，Atg7參與LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)變所必需的Atg10和Atg12、Atg3和LC3復合物形成過程，當Atg7下調(diào)時自噬溶酶體的形成受阻，阻斷了自噬的發(fā)生，從而避免腫瘤治療中自噬引起的耐藥[14]。miR-100[15]、miR-18a[16]、miR-7[17]等都促進自噬的發(fā)生。

本實驗成功構(gòu)建了肝卵圓細胞miR-21慢病毒轉(zhuǎn)染模型，Hoechst 33258染色miR-21增強慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞染色增多(凋亡增多)，miR-21-inhibition慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞染色減少(凋亡減少)，MDC染色miR-21增強慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞染色減少(自噬減少)，miR-21-inhibition慢病毒轉(zhuǎn)染的細胞染色增多(自噬增多)。miR-21過表達在本文中證實抑制HOC的自噬，抑制miR-21過表達可以增強缺血缺氧引起的肝卵圓細胞的自噬，有利于肝卵圓細胞在缺血缺氧微環(huán)境中穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境，維持細胞的存活，具體可能機制有待進一步研究。Lu等[18]研究miR-21的過表達能上調(diào)PTEN表達，抑制P13K-Akt-mTOR信號通路異?；罨种谱允?。我們以miRNA為突破點研究肝卵圓細胞的自噬，為研究自噬提供一種新的思路。

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(本文編輯:張和，魯翠濤)

·論著 基礎研究·

[通訊作者簡介]單云峰，主任醫(yī)師，副教授，博士，碩士生導師，E-mail:shanyfeng@126.com。

作者簡介][第一高勝強(1990-)，男，安徽馬鞍山人，在讀碩士。

[基金項目]浙江省自然科學基金項目(LY12H03006)；溫州市科委課題(Y20110078)。

[收稿日期]2015-08-17

[中圖分類號]R329.2+6

[文獻標識碼]A

DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.01.011