溫州地區(qū)原發(fā)性肝細(xì)胞癌TP53基因249密碼子突變研究

胡偉建，鄭亦胡，鮑海力，朱椰凡，張啟瑜(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，浙江溫州325000)

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溫州地區(qū)原發(fā)性肝細(xì)胞癌TP53基因249密碼子突變研究

胡偉建，鄭亦胡，鮑海力，朱椰凡，張啟瑜
(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，浙江溫州325000)

[摘 要]目的 檢測(cè)溫州地區(qū)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的TP53基因249密碼子突變情況，并探討其在肝細(xì)胞癌中所起的作用及其臨床意義。方法 收集石蠟包埋的原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織120例，應(yīng)用Sanger測(cè)序技術(shù)檢測(cè)突變情況。運(yùn)用Spearman檢驗(yàn)分析腫瘤組織中TP53基因249密碼子突變與原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果 TP53基因249密碼子在120例肝癌組織中總突變率為3.33%(4/120)，進(jìn)一步分析顯示TP53基因249密碼子突變與肝細(xì)胞癌患者的臨床病理因素未發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)性(P＞0.05)。結(jié)論 在溫州地區(qū)，TP53基因249密碼子突變?yōu)榉歉甙l(fā)事件，未發(fā)現(xiàn)其與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的進(jìn)展相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]TP53；249密碼子；癌，肝細(xì)胞

Analysis of mutation of TP53 gene codon 249 in primary hepatocellular carcinoma in Wenzhou area HU Wei-jian, ZHENG Yi-hu, BAO Hai-li, ZHU Ye-fan, ZHANG Qi-yu.Department of Hepatobiliary Surgery, the First Af■liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, Zhejiang 325000, China

Abstract ObjectiveTo investigate the mutation of TP53 gene codon 249 in primary hepatocellular carcinoma (HCC) in Wenzhou area, and explore its role in the development of HCC.Methods A total of 120 paraf■nembedded primary HCC tissues were collected, the Sanger sequencing technique were used to detect the mutation.The Spearman test was applied to analysis the correlation of the mutation of TP53 gene codon 249 and the clinicopathological features in HCC patients.ResultsMutation of codon 249 was found in 4 cases with a mutation rate of 3.33% (4/120)； the research also showed that the mutation of codon 249 had no correlation with the clinicopathological feature in HCC patients (P＞0.05).ConclusionOur data suggests that the incidence of mutation of p53 gene codon 249 in Wenzhou area is low and little contribution to the development of the hepatocelluar carinoma.

Key words TP53； 249 codon； heaptocellular carcinoma

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程[1]。Bressac 等[2]發(fā)現(xiàn)肝癌中TP53存在基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)異常，該基因發(fā)生突變后，抑癌功能喪失。后續(xù)研究報(bào)道[3-4]，肝癌TP53基因存在多個(gè)位點(diǎn)基因錯(cuò)義突變，其第七外顯子249位密碼子突變?yōu)闉楦渭?xì)胞肝癌所特有，在發(fā)病中起重要作用[5]。進(jìn)一步研究[6-7]發(fā)現(xiàn)TP53基因249編碼子突變與黃曲霉素暴露密切相關(guān)。溫州市疾控中心腫瘤死因調(diào)查資料[8]顯示，溫州地區(qū)每10萬(wàn)人中就有51人死于肝癌，而炎熱、潮濕的氣候，為該地區(qū)黃曲霉素的污染創(chuàng)造了有利條件。目前，該地區(qū)TP53基因249密碼子突變的資料還比較少，故本文研究該地區(qū)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者TP53基因249密碼子突變的情況，探討TP53基因249密碼子突變?cè)诟伟┌l(fā)病機(jī)制中所占的地位及其與肝癌臨床病理特征的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1材料來(lái)源

石蠟包埋標(biāo)本取自我院2007年1月到2009年7月手術(shù)切除的120例肝細(xì)胞癌患者。其中男108例，女12例；所有組織標(biāo)本均由我院病理科做出病理診斷，均為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，其中低分化34例，中分化66例和高分化20例。手術(shù)標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，于40 ℃溫水中撈片，然后放在60 ℃烤箱中烘烤1 h，充分烤干。本研究經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2主要試劑及儀器

Pfu DNA Polymerase高溫聚合酶、DNA提取試劑盒均來(lái)源于上海生物工程有限公司。測(cè)序儀為美國(guó)ABI公司3730XL。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取:石蠟標(biāo)本經(jīng)二甲苯和乙醇脫蠟后，按照DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，2%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)抽提DNA完整性，并用紫外分光光度法檢測(cè)濃度及純度，確保樣本DNA的OD值為1.8～2.0之間。

1.3.2 PCR反應(yīng):擴(kuò)增TP53基因第七外顯子的引物由上海生工公司合成，引物序列為:引物F:5＇-CCCAGG GGTCAGAGGCAA-3＇；引物R:5＇-GGGCGACAGAGCGAGAT TC-3＇。取DNA模板1 μL，依次加入引物F 1 μL、引物R 1 μL、dNTP(10 mM)1 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL、PCR緩沖液5 μL、MgCl2(25 mmol/L)5 μL、雙蒸水35.5 μL，共50 μL反應(yīng)體系。95 ℃變性3 min后，94 ℃熱變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。2%瓊脂糖電泳見(jiàn)擴(kuò)增出290 bp的基因片段即為所需片段，見(jiàn)圖1。

圖1　擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

1.3.3 TP53突變分析:采用HaeIII限制性?xún)?nèi)切酶分析TP53基因249密碼子突變，酶切反應(yīng)體系為5 μL PCR產(chǎn)物、10 μL HaeIII、1 μL 10倍緩沖液，3.4 μL雙蒸水。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)290 bp條帶著為T(mén)P53基因249密碼子突變。

1.3.4 突變測(cè)序:將30 ng PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，依次加入3.2 pmol引物和6 μL Big Dye Termintor，用MilliQ水補(bǔ)足至20 μL，用ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16統(tǒng)計(jì)分析軟件。TP53基因249密碼子突變與患者臨床病理特征之間的關(guān)系采用Spearman檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1TP53基因249密碼子突變情況

120例的標(biāo)本中，116例(96.67%)為AGG，3例(2.5%)為AGT，1例(0.83%)為AGC，總突變率為3.33%，見(jiàn)圖2。

圖2　TP53基因249密碼子突變情況

2.2肝細(xì)胞癌患者的地區(qū)分布情況

鹿城區(qū)40例；甌海區(qū)16例；龍灣區(qū)7例；永嘉縣18例；蒼南縣9例；洞頭縣4例；平陽(yáng)縣5例；泰順縣1例；文成縣5例；瑞安市7例；樂(lè)清市8例。具體分布見(jiàn)圖3。

圖3　120例肝細(xì)胞癌患者的地區(qū)分布圖

2.3TP53基因249密碼子突變與臨床病理特征之間關(guān)系

Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)TP53基因249密碼子突變與各臨床病理特征存在相關(guān)性。具體見(jiàn)表1。

表1　TP53基因249密碼子突變與臨床病理特征相關(guān)性分析

3　討論

TP53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)腫瘤相關(guān)性最高的基因之一，野生型TP53基因?yàn)橐职┗?，可以誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞分化以及受損的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，避免細(xì)胞進(jìn)一步向惡變進(jìn)展[9]。正常TP53基因編碼p53蛋白，具有抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的功能。p53蛋白的一些結(jié)構(gòu)域是高度保守的，這些結(jié)構(gòu)域和第五至七外顯子是經(jīng)常發(fā)生突變的位置，如果發(fā)生點(diǎn)突變則編碼的多肽就會(huì)影響p53蛋白的空間結(jié)構(gòu)構(gòu)象的正確形成，也會(huì)影響p53蛋白抑制細(xì)胞周期的功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖的失控，引起癌變[10]。

第七外顯子249密碼子突變是TP53基因最常見(jiàn)的突變。1991年，Hsu等[3]在研究我國(guó)啟東地區(qū)肝癌發(fā)病過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)16例肝癌中有8例存在TP53基因點(diǎn)突變，且均位于第249密碼子第三堿基，Bressac 等[4]在研究南非地區(qū)肝癌過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)50%(5/10)TP53基因這一點(diǎn)突變。249密碼子突變主要發(fā)生G→T顛換，這一顛換使249密碼子編碼的蛋白由精氨酸變成絲氨酸，引起p53蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響p53蛋白功能[3]。為進(jìn)一步驗(yàn)證249密碼子突變與肝癌關(guān)系，吳智群等[11]在小鼠中引入TP53基因249密碼子點(diǎn)突變，該突變減弱p53在細(xì)胞周期阻滯和凋亡中的作用，對(duì)TP53的抑癌功能產(chǎn)生影響，在肝癌的發(fā)病中起著非常重要的作用。

在調(diào)查江蘇的啟東地區(qū)和廣西扶綏地區(qū)肝癌發(fā)病情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，肝癌發(fā)生不僅與乙肝感染相關(guān)，而且與黃曲霉素暴露相關(guān)[12]，黃曲霉素等環(huán)境致癌物暴露HBV感染是TP53基因249密碼子突變的主要原因。體外研究也同樣證明黃曲霉素暴露能夠?qū)е?49密碼子第三堿基G→T顛換[13]。這種突變使p53失去促凋亡活性而部分獲得促進(jìn)細(xì)胞周期G0/G1期轉(zhuǎn)變的功能[14]。249密碼子突變程度在一定程度上能夠反映該地區(qū)黃曲霉素暴露程度。在上海地區(qū)52例肝癌患者中有10例發(fā)生突變。在臺(tái)灣地區(qū)肝癌研究中發(fā)現(xiàn)38例肝癌患者中有3例發(fā)生249密碼子突變，在日本279例肝癌患者中有41例發(fā)生突變[15]，根據(jù)249密碼子突變發(fā)生率分級(jí)[16]，這些地區(qū)屬于黃曲霉素中等暴露地區(qū)。在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，黃曲霉素暴露仍然不可忽視。

在本研究中，共收集了本院溫州地區(qū)120例肝癌患者標(biāo)本，回顧性研究并分析TP53基因249密碼子突變情況，以及其在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。本研究使用Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)120例肝細(xì)胞肝癌組織進(jìn)行TP53基因249密碼子進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TP53基因249密碼子總突變率為僅為3.33%，突變發(fā)生率遠(yuǎn)低于啟東等地區(qū)，但與意大利、法國(guó)等地區(qū)發(fā)生率相接近。對(duì)這些突變進(jìn)行點(diǎn)突變檢測(cè)，其中有3例249密碼子由AGG變成AGT，1例變?yōu)锳GC，與既往其他研究相符合。一般研究顯示，正常肝組織中在黃曲霉素暴露下TP53基因249密碼子極少發(fā)生突變，伍國(guó)俊[17]檢測(cè)了10例肝移植供肝及肝外傷切除組織，249密碼子均沒(méi)有發(fā)生突變。本研究中僅4例249密碼子發(fā)生突變，可考慮在溫州地區(qū)仍然存在黃曲霉素暴露，屬于低黃曲霉素暴露區(qū)，其249密碼子在肝癌的發(fā)生過(guò)程中產(chǎn)生突變。分析原因:隨著人們生活水平的提高，衛(wèi)生環(huán)境的改善，食用黃曲霉毒素污染的食物的幾率下降。在本研究收集的120例患者中，63位患者來(lái)自溫州市區(qū)，衛(wèi)生情況相對(duì)較好，相對(duì)于其他縣市的患者來(lái)說(shuō)，黃曲霉素暴露的情況可能性小(圖3)。為進(jìn)一步研究其與臨床病理特征之間關(guān)系，探究該突變?cè)谀[瘤進(jìn)展過(guò)程是否發(fā)生作用，對(duì)腫瘤數(shù)目、大小、AFP、分化、門(mén)靜脈侵犯、TNM分期等指針行相關(guān)性檢驗(yàn)。Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)與各臨床病理特征相關(guān)性分析P值均大于0.05，不能提示294密碼子突變與臨床病理改變相關(guān)，故認(rèn)為294密碼子突變與腫瘤數(shù)目、大小、AFP、分化、門(mén)靜脈侵犯、TNM分期等臨床特征不相關(guān)。

在我們收集的病例中HBV感染患者占95%(114/ 120)，丙肝及其他因素導(dǎo)致經(jīng)占少數(shù)，而4例突變患者具有乙肝感染病史。既往有研究表明黃曲霉素更容易使感染乙肝的患者發(fā)生249密碼子突變[18]，具體機(jī)制待進(jìn)一步研究，本研究尚不足說(shuō)明該突變與乙肝的關(guān)系。

因此，在溫州地區(qū)TP53基因249密碼子突變?yōu)榉歉甙l(fā)事件，提示溫州為黃曲霉素低暴露地區(qū)。雖然在溫州地區(qū)黃曲霉素參與肝癌的發(fā)病，但在肝癌的發(fā)生中不起主導(dǎo)作用，未發(fā)現(xiàn)其與肝癌進(jìn)展相關(guān)。HBV感染是該地區(qū)誘發(fā)肝癌的主要因素，黃曲霉毒素污染誘發(fā)肝癌發(fā)病的患者僅占少數(shù)。

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(本文編輯:張和)

·論著 基礎(chǔ)研究·

[通訊作者簡(jiǎn)介]張啟瑜，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:qiyuz@126.com。

作者簡(jiǎn)介][第一胡偉建(1990-)，男，浙江縉云人，在讀碩士。

[基金項(xiàng)目]浙江省外科學(xué)重中之重學(xué)科資助項(xiàng)目(2008-255)。

[收稿日期]2015-06-30

[中圖分類(lèi)號(hào)]R34； R735.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.01.010